细胞培养与细胞生物学常用技术

细胞培养与细胞生物学常用技术目录实验一软琼脂克隆形成2实验二细胞伤愈合4实验三细胞活力测定6实验四细胞免疫荧光8实验五细胞的转染12实验六细胞总RNA提取15实验七逆转录反应18实验8 real time PCR20实验一软琼脂克隆形成【原理】正常情况下，贴壁生长的细胞必须附着在固体基质上生长，漂浮在液体或半固体基质上培养后难以增殖的现象称为锚定依赖生长(anchorage dependent growth )。 一些细胞转化后，如恶性肿瘤细胞不依赖于固体基质，在半固体(琼脂，甲基纤维素)培养基中增殖形成细胞菌落的现象称为锚定无依赖生长(anchorage independent growth )。 锚定不依赖生长是肿瘤细胞的一个标志，也是检测恶性转化细胞的比较准确的标志之一。 软琼脂克隆技术是在体外水平检测肿瘤细胞和转化细胞系固定无依赖生长能力的最常用手段之一。 该技术利用低熔点琼脂糖模拟体内细胞所处的半固体状态，将细胞消化为单细胞，不使细胞成为壁或单细胞状态。 经过3周左右的生长，通过比较克隆率，比较不同细胞或同一细胞在不同处理后的转化和锚定不依赖生长的能力。 因此，软琼脂克隆实验是肿瘤研究领域的重要体外检测技术。【材料】1、仪器： CO2培养箱、倒置显微镜、超清洁工作台、酒精灯、高压灭菌锅、水浴锅2 .试剂： DMEM培养基、胎牛血清、无水乙醇、75%乙醇、PBS溶液、0.25%胰酶溶液、低熔点琼脂；3、细胞株：肝癌细胞系HepG2；【步骤】制备1.2%和0.7%的低熔点琼脂糖，高压灭菌后，放入42的水浴锅(或恒温罐)中，保持融解状态制备2，2x DMEM培养基(包括202x抗生素)，在37下预热将1.2%的低熔点琼脂糖凝胶和2x DMED培养基等体积混合，将混合液放入6孔，每孔轻轻混合1.5mL，不产生气泡，在室温下放置凝固4、取对数较长的细胞，胰酶消化后，尽量吹散细胞，制成单细胞悬浊液，取出10L，对细胞悬浊液进行细胞计数，在无血清培养基中将细胞稀释至1x104个/mL5、下层凝胶完全凝固后，分别将1.5mL的0.7%琼脂糖凝胶和2x培养基等量混合，加入300L的细胞悬浊液，充分混合后放入6孔，每孔设置1mL (即1000个细胞/孔)，每细胞设置3个平行孔将6.6孔放入CO2孵化器孵化23周后，在一个孔中加入0.1%结晶紫染色1ml，室温染色10min，再用清水洗30min，用镜子拍照，计算克隆的形成情况进行分析。实验双细胞伤愈合【原理】细胞移动是细胞在接收移动信号或感觉到一种物质的浓度梯度后产生的移动。 细胞迁移是正常细胞的基本功能之一，是生物体正常生长发育的生理过程，也是活细胞普遍存在的运动形式。 胚胎发育、血管生成、伤口愈合、免疫应答、炎症反应、动脉粥样硬化、癌转移等过程与细胞迁移有关。 细胞创伤愈合实验(wonderhealing )简称创伤实验，是第一个研究细胞迁移的体外实验，操作简单、经济、应用广泛。细胞创伤愈合的操作过程非常简单，基本步骤包括制造“创伤”、获取细胞迁移中的图像和处理后期数据。 具体过程是在细胞融合形成单层状态时，在融合的单层细胞中人为地形成空白区域，称为“伤”。 然后在显微镜下继续拍照，记录伤口边缘的细胞逐渐进入空白区域，即记录“伤口”愈合的过程，最后反映细胞根据“伤口”愈合的速度移动的速度。【材料】1、仪器： CO2培养箱、活细胞站、超清洁台、酒精灯2、试剂和消耗品： DMEM培养基、胎牛血清、75%乙醇、PBS溶液、0.25%胰酶溶液、直径30mm细胞培养皿、尺子、标记笔3、细胞株：肝癌细胞系HepG2；【步骤】在培养皿中接种细胞之前，用直尺测定，培养皿的背面加上“横线”，每隔约0.51.0cm，共计5条线2 .取指数生长的细胞，胰酶消化后收集细胞沉淀，细胞计数后稀释至2.5x105个/mL取背面有标记的培养皿(直径30mm )，每盘接种2mL细胞，放入培育箱培养34h中4 .取出细胞培养皿，用10L的枪口与尺寸相比，在与底面垂直的横线上划伤加入1 ml PBS缓冲液，清洗细胞3次，清洗划痕产生的细胞碎片6、加入无血清培养基2mL，在活细胞站下拍摄24小时，每小时拍一张照片7 .根据收集的图像数据分析实验结果，计算细胞迁移率。迁移率=【(T0时划痕宽度值-Tt时划痕宽度值)/T0时划痕宽度值】x100%实验三细胞活力检测【原理】最常用的细胞活力测定方法是噻唑蓝比色法(MTT法)。 MTT均称为3-(4，5-dimethylethiazol-2-yl )-2，5-diphenyltetrazoliumbromide，中文化学名为3-(4，5 -二甲基噻唑-2)-2，5 -二苯基四唑溴盐，商品名为噻唑活细胞线粒体内琥珀酸脱氢酶可将外源性MTT还原成水不溶性蓝紫色晶体甲壳，使其沉积在细胞中，但由于死细胞没有这种功能，结晶形成量与活细胞数成正比。 DMSO能溶解细胞中的甲壳，用酶测定仪在490nm波长下测定其光吸收值，间接使活细胞数发生反应。 该方法灵敏度高且经济实惠，广泛应用于药物筛选等细胞毒性检测领域。【材料】1、仪器： CO2培养箱、倒置显微镜、超清洁工作台、酒精灯、多功能酶指标仪2、试剂：细胞培养基、胎牛血清、MTT(5mg/mL )、DMSO、75%乙醇、PBS溶液、顺铂母液3、细胞株：肝癌细胞系HepG2；【步骤】一、细胞接种1 .从1.co2培养箱中取出细胞培养瓶，丢弃培养基，用PBS洗涤2次，胰酶消化后，加入培养基重量的悬浮细胞，转移到离心管中以2，800 rpm离心2min，丢弃上清加入35mL的新鲜培养基重悬浮细胞(以25cm2的培养瓶为例)，吸引细胞悬浮液10L，滴加到血球计数板中进行细胞计数4 .根据细胞计数结果，将细胞浓度稀释为4x104个/mL5 .将细胞悬浮液以100L/孔加入96孔细胞培养板6.96将节流孔放入CO2孵化器孵化一夜。二、细胞荷药1 .在新鲜培养基中将5mM顺铂母液的药物浓度稀释至15M2 .从2.co2培养箱中取出96孔板，抛弃培养基，实验组更换含有上述药物的新鲜培养基，对照组更换新鲜培养基将3.96节流孔放入CO2孵化器，持续孵化24小时。三、MTT法检验1 .从CO2培育箱中取出96孔，废弃培养基，每孔加入新鲜培养基90L及mtt10l5mg/ml将2.96节流孔放入CO2孵化器继续孵化4h3 .废弃培养基，每孔加入100L DMSO，混合振动10min4 .用酶测定仪测定490nm下的吸光值(A490 )，计算细胞活力。实验四细胞免疫荧光【原理】免疫细胞化学(immunohistochemistry )利用抗原抗体间特异性结合的原理，同时利用特殊标记技术实现定位、定性或定量测定细胞内目标抗原和抗体的技术。 由于其特异性强、灵敏度高，而且传统免疫学检测技术能克服只能定性和定量的缺点，在实现定性定量的同时能精确定位目标蛋白质，故又称原位免疫检测技术。 由于具有这些优点，免疫细胞化学技术广泛应用于免疫学、微生物学、病理学、肿瘤学及临床检测等多个领域。免疫细胞化学技术有多种染色方式，根据标记物的种类可分为免疫荧光法、免疫酶标记法、免疫铁蛋白法和免疫胶体金发等。 其中免疫荧光法结合激光共聚焦扫描显微镜成像技术，大大提高了检测分辨率，能够更准确地检测抗原的细胞定位和分布。 目前可选择的荧光素较多，其中较成熟的荧光素标记物为异硫氰酸酯荧光素、四甲基异硫氰酸酯罗丹明(tetramethylrhodaminisothiocyanate，TRITC )、四乙胺(RR 免疫荧光还能染色活细胞，在流式细胞术(flowcytomitry，FCW )中有很多应用，因此已成为最常用的免疫细胞化学技术之一。免疫荧光技术将荧光素标记在已知抗原或抗体上，并利用荧光抗体(或抗原)作为探针来检测细胞或组织中的相应抗原(或抗体)。 含有形成细胞的抗原抗体复合体上标记的荧光素，照射激发光后，从低能量状态进入高能量状态，高能量状态的电子不稳定，以放射光量子的形式放出能量后，在恢复到原来的低能量状态的过程中可以发出明亮的荧光，用荧光显微镜荧光根据荧光素标记的位置，可分为直接法和间接法。 直接法是最早的标记方法，是用荧光素直接标记测定蛋白质的第一抗体的标记方法，该方法特异性高，灵敏度低，而且每种抗体都需要单独标记，非常不方便，成本较高，因此逐渐被其他方法取代的间接法是直接法的改进， 不是标记与抗原直接结合的特异性一次抗体，而是标记与一次抗体结合的二次抗体，因为与一次抗体结合的二次抗体分子多数不是一个，间接法可以大幅度提高检测灵敏度，与直接法相比，荧光亮度可以提高34倍。 除灵敏度高外，间接法所需的种间接荧光抗体可应用于同种属产生的多种第一抗体的标记，大大降低了检测成本，成为目前应用最广泛的免疫荧光技术之一。【材料】1、仪器： CO2培养箱、倒置显微镜、超清洁工作台、酒精灯、正置荧光显微镜、高压灭菌锅2 .试剂： DMEM培养基、胎牛血清、无水乙醇、75%乙醇、PBS溶液、0.25%胰酶溶液、4%聚甲醛、P53初级抗体、FITC荧光二抗、抗荧光衰减片剂、Triton X-100；3、细胞株：肝癌细胞系HepG2；【步骤】一、准备工作1、切片处理：盖玻片浸渍浓酸一夜，自来水20次，蒸馏水5次，高压灭菌，干燥预备2、细胞悬浮液的制备：胰酶消化HepG2细胞，收集细胞沉淀，培养基重悬浮液，制成单细胞悬浮液，计数稀释至2x105个/mL。二、细胞爬行动物在1.6孔板的中央滴下100L培养基，放入按孔处理过的盖玻璃，完全盖在孔内培养基上2、在每个孔中慢慢滴入2mL稀释的细胞悬浊液，使其柔软混合3.6节流孔放入CO2培育箱，培养一夜。 三、取出免疫荧光1、6节流孔，丢弃孔内培养基，PBS温柔洗涤3次，每次3min 2，每孔加入1mL预冷的4%聚甲醛，4固定20min，PBS洗涤3次，每次3 min；每孔加入1mL含0.2%Triton X-100的PBS，在冰上静置10min5、PBS清洗3次，每次3min；每孔加入含有1 % BSA的PBS1ml，室温下关闭1h以1:100的比例稀释P53一次抗体后，取出100L滴入封口膜，从培养孔中取出玻璃盖，用吸水纸吸取背面和细胞面边缘的液体后，轻轻放置在封口膜上，细胞面和抗体均匀接触，在4孵育一夜8 .拆下盖玻璃，放入6张孔板对应的孔中，用PBS每次清洗3min滴加荧光素二抗，37孵育30min (注意遮光操作)。10、PBS清洗3次，每次3min；每孔加入500L DAPI染色液，室温染色5min12、PBS清洗3次，每次3min；13 .取出清洁的载玻片，在中心位置滴入50L的抗荧光猝灭片，从6块板上取出盖玻片，控制液体，贴有细胞的面朝下，放在密封液上，尽量避免气泡14 .用显微镜观察，拍照。实验5细胞转染【原理】细胞转染是将外源DNA和RNA导入真核细胞，研究真核细胞的基因功能、基因表达调控和蛋白表达的专业技术。根据实验的目的，细胞转染技术分为两类，分别是瞬时转染和稳定转染。 瞬时转染是指外源基因进入受体细胞后，不能与宿主染色体整合，以游离的形式存在，由于一个宿主细胞存在多个拷贝数，可以表达出高水平。 但是，由于不能复制，表达时间有限，仅24天，最终在细胞分裂过程中消失。 稳定转染是外源基因整合到宿主细胞染色体中，成为宿主细胞基因组的一部分，复制到子细胞中形成稳定转染的细胞株。 因此，瞬时转染通常用于短期研究，如基于产物的短期表达、基于敲除和RNA的沉默研究蛋白质小规模表达等的稳定转染需要基因长期持续的表达情况，如大蛋白表达、长期药