7未知病原菌的分离鉴定.ppt

未知病原菌的分离鉴定,病原菌检测程序,药物敏感试验,标本,直接涂片、染色、镜检,分离、鉴定,生化试验(书p17-18),血清学试验(玻片凝集法),动物试验(产毒性、分离),初步诊断,分子生物学技术(核酸杂交、PCR、基因芯片核酸),其他检测技术,观察培养特征、形态特征,病原菌抗原检测,形态结构,临床标本中未知病原性球菌的分离鉴定程序,临床标本,直接涂片、革兰染色、镜检(形态,排列,染色性),血琼脂平板/巧克力血琼脂平板(菌落性状,溶血性,色素),可疑菌落,涂片,染色,镜检,纯培养,生化反应,致病性测定,药敏试验,思考：如何从脓拭子、咽拭子中分离并鉴定病原性球菌？,查病原,标本,脓血便、肛拭子,选择/鉴别培基,生化反应,血清学鉴定,双糖发酵,橘橼酸盐利用试验,尿素,靛基质试验,SS平板,中国兰,EMB,未知肠道杆菌的分离鉴定程序,伊红美蓝平板-EMB,Eosin-methyleneblueagar,EMB,克氏双糖铁试验,Doublesugarironslant,枸橼酸盐利用试验,Citrateslant,吲哚试验,Indolebroth,玻片凝集,一、材料：5人/组1.待检标本：脓拭子、咽拭子、尿液标本、肛拭子1#、肛拭子2#2.培养基：血平板3块/组EMB平板3块/组克氏双糖铁斜面3支/组动力-靛基质-尿素半固体3支/组3.其他：革兰染液、玻片、10%胆盐、靛基质试剂、NS、兔血浆、3%H2O2、沙门氏菌多价血清、志贺氏菌多价血清二、方法(实验程序)三、结果四、讨论,设计性实验临床标本中病原菌的分离与鉴定,实验目的熟悉临床标本中常见病原菌的分离鉴定程序学习脓汁、痰、粪便、尿液等临床标本的检查方法实验要求针对病例，对临床标本中的病原菌进行分离和鉴定实验前制定方案，实验后写出实验报告,实验分组5人/组1套标本/组（脓汁、痰、尿液、粪便）进程安排实验分3次进行,实验材料,脓汁标本：脓拭子培养基：血琼脂平板其他：3%H2O2、兔血浆、生理盐水、革兰染液、玻片等,脓拭子,分离培养（血平板）,革兰染色,革兰染色,触酶实验,血浆凝固酶实验,实验方案,第1次课,第2次课,实验操作与观察,触酶实验,+,-,触酶实验：挑取菌落置玻片上；滴加12滴3%H2O2，观察结果；,实验操作与结果,血浆凝固酶实验,+,-,凝固酶实验：取生理盐水于玻片上，挑取待检菌置于生理盐水中，制成菌悬液，观察有无自凝现象。向菌悬液中加1滴兔血浆并混合，观察结果。,实验材料,痰标本：咽拭子培养基：血琼脂平板其他：生理盐水、10%胆盐、Optochin纸片、革兰染液、玻片等,咽拭子,革兰染色,革兰染色荚膜染色,胆汁溶菌实验,奥普托辛实验,分离培养（血平板）,实验方案,第1次,第2次,第3次,观察奥普托辛实验结果,实验操作,奥普托辛实验：挑取菌落涂于血平板上，将optochin纸片贴于接种处；37培养1824小时，观察结果。,胆汁溶菌实验（平板法）：在血平板上标记单个菌落直接在菌落上加一接种环去氧胆酸纳溶液将平板37孵育2030分钟，观察结果,实验操作,荚膜染色：石炭酸复红单染1.涂片、自然干燥、火焰固定；2.1滴石炭酸复红，立即冲去，镜下观察。,实验操作,实验材料,尿标本：尿液培养基：EMB平板克氏双糖铁斜面培养基动力-靛基质-尿素半固体琼脂培养基其他：革兰染液、靛基质试剂、玻片等,尿液,离心沉淀1500转，10分钟,分离培养（EMB平板）,革兰染色,革兰染色,克氏双糖铁斜面培养基,动力-靛基质-尿素半固体琼脂培养基,观察结果,观察结果,完成靛基质试验,实验方案,第1次,第2次,第3次,实验材料,粪便标本：肛拭子（1#、2#）培养基：EMB平板克氏双糖铁斜面培养基动力-靛基质-尿素半固体琼脂培养基其他：生理盐水、靛基质试剂、沙门菌多价血清、志贺菌多价血清、玻片等,肛门拭子1、2,EMB平板,克氏双糖铁斜面培养基,动力-靛基质-尿素半固体琼脂培养基,观察结果,观察结果,完成靛基质试验,玻片凝集试验,实验方案,第1次,第2次,第3次,讨论内容,针对实验步骤的讨论；对结果的分析；还需要进一步做哪些实验；此次实验成功或需要改进的地方；其他,预习：肥达反应,肥达试验(Widaltest)用已知的伤寒沙门菌O、H抗原、甲型副伤寒沙门菌、肖氏、希氏沙门菌H抗原的诊断菌液，与患者血清作定量凝集试验，检测患者血清中的相应抗体，辅助诊断伤寒、副伤寒。,GeorgesWidalin1896(French),Widaltest,正常值：诊断伤寒：O凝集效价1:80,H凝集效价1:160;诊断副伤寒：O凝集效价1:80,H凝集效价1:80才有诊断价值.动态观察：抗体效价随病程延长而上升；双份血清升高4倍或以上；O与H抗体的诊断意义：O，H-肠热症(伤寒或副伤寒)的可能性大O，H-患病的可能性小O不高，H-预防接种/非特异性回忆反应O，H不高-感染早期或与伤寒沙门菌O抗原有交叉反应的其他沙门菌感染少数病例在整个病程中，肥达试验始终呈“-”:早期使用抗生素治疗或患者免疫功能低下,Widaltest(5人/组),材料：病人未知血清：1#，2#，3#菌液：O、H、PAH、PBH（已知Ag）方法：每组1块多孔板/24支试管；每人2支吸管；,弃0.5ml于消毒缸123456NS0.50.50.50.50.50.5ml未知血清(1:10)0.50.50.50.50.5菌液(摇匀)0.50.50.50.50.50.5ml(4种,1种/人)1:401:801:1601:3201:640(阴性对照)37，水浴过夜（完成一个完整的检验）,方法,TOTHTAHTBHTCH意义1:6401:3201:6401:3201:6401:1601:6401:160,肥达反应结果举例:,发病早期,不久前患过伤寒/菌苗接种/非特异回忆,伤寒,副伤寒甲,肖氏副伤寒,“O”抗原凝集现象：（呈颗粒状薄膜）100凝集：“”：上层清亮，底部完全凝集，呈颗粒状薄膜（有卷边）。75凝集：“”：上层不太清亮，底部凝集明显。50凝集：“”：上层混浊，下层凝集。孔底中央中间约50白色沉淀，周围膜状凝集，约50。25凝集：“”：液体比较混浊，膜状凝集少。0凝集：“”：如第6孔，混悬后，混浊均匀，底部无凝集。,“H”抗原凝集现象：（呈絮状凝集）100凝集：“”：液体清亮，底部中央完全凝集，呈蓬松絮状；混悬起来，液体仍然清亮，分散开的絮状凝集块漂浮于液体中。75凝集：“”：上层不太清亮，底部絮状凝集明显。50凝集：“”：混悬后，上层均