血液标本采集和制片.ppt

临床检验基础,一、医学检验发展史基础。,医学检验奠基人1673年列文霍克(ALeeuwenhoek)发明显微镜他用自制显微镜发现了红细胞、细菌及原虫等。,概述,一、医学检验发展史临床医学检验-实验诊断学,临床检验基础临床生化检验临床免疫检验临床微生物检验临床血液检验临床输血检验临床分子诊断学检验,临床医学检验,概述,二、医学检验现状和特点,医学检验是一门具有多学科理论交叉、应用性强、发展迅速的应用技术学科，是医学各科中发展最快的专业之一。,概述,（一）现状1、临床检验已进入仪器化时代：,电子技术和计算机在医学检验中得到了广泛应用，基础医学的重大进展促进了实验诊断迅猛发展。标本用量少、减少标本的转运环节、更快速、更灵活、易操作、信息量大、易质控、报告及时。但是许多手工操作仍然是基础,是金指标,可校准仪器,是质量控制重要方法。,二、临床检验现状和特点,概述,2、工作任务的转变：,（一）现状1、临床检验已进入仪器化时代：,由简单的为临床提供检验结果发展检验技术+参与临床咨询+临床诊断+治疗及预防工作,3、运用循证医学理论为临床提供合理的检验项目。,4、检验医师与临床医师共同制定诊断和疗效判断标准。,概述,1、检验操作的自动化：2、检验方法的标准化：3、检验技术的现代化：流式细胞术、生物芯片、分子杂交、PCR4、检验试剂的商品化：5、计量单位的国际化：6、质量管理的全程化：检测前、中、后,（二）医学检验的特点,概述,7、生物安全的严格化：标本有潜在危险严格遵循“实验室生物安全通用要求”、“临床实验室废物处理原则。8、检验人员的合格化：,（二）医学检验的特点,能做,能质控,能维护,能分析,期待检验医师能遵照和参与国家、国际标准化检验的实践活动，精通先进检验操作方法，并能与临床医生进行交流。,概述,三、医学检验的基本任务运用物理学、化学、生物学、免疫学、自动化检验等技术，对人体的血液、体液、排泄物、分泌物和脱落细胞等标本进行实验室检查，以获得病原学、病理学和脏器功能状况等资料，为疾病诊断、治疗、病情观察、预后判断提供依据，并结合病史、体格检查和其他各种辅助诊断资料，进行综合分析，以达到诊断明确、治疗及时和制定预防措施的目的。,概述,临床检验基础：是临床上最常用、最基本的检测方法，即运用现代分析技术、显微镜、物理学、化学、生物学、免疫学、遗传学等技术对人体血液、体液、分泌物、排泄物及脱落细胞等进行检验，以获得疾病病因、病理变化、器官功能状态等资料,协助诊断疾病的学科。是集微观形态学和宏观理化检验于一体综合性学科。,概述,四、临床检验基础的临床应用1、为疾病诊断和鉴别诊断提供客观依据2、为疾病疗效观察和预后判断提供动态变化依据3、为预防疾病提供检测依据4、为健康咨询提供依据5、为科学研究提供基本数据、基本检验方法和操作技能,概述,五、学习的基本要求学习目的：1、掌握本学科基本技能，用准确、经济、简便、快速的检测方法获取检测结果达到协助诊断疾病和预防疾病的目的2、为探索准确、经济、简便、快速的检测方法，培养创新能力打下坚实的基础。,概述,五、学习的基本要求1、掌握临检的基本理论,2、掌握各种操作技能,3、掌握方法学评价,4、熟悉各项实验的参考区间,6、加强职业道德培养必须养成严谨、细心、有条不紊、一丝不苟、认真负责、实事求是的工作作风,树立优良的职业道德。,5、熟悉实验项目的临床意义,概述,五、学习的要求:7、勤学苦练基本技能和具有过硬的形态学本领,才能胜任工作,成为一个优秀的检验工作者。8、上课要同时带理论教材和实验教材。9、实验课前要求预习实验指导；不无故缺课，实验考试不及格不准参加理论考试。本课程总课时学128时,其中理论64学时;实验64学时,第一章血液标本采集和血涂片制备,第一节血液标本的采集,一、血标本类型（一）全血:血细胞+血浆静脉全血、动脉全血、毛细血管全血（二）血浆：全血血细胞（三）血清：全血血细胞纤维蛋白原及其他凝血因子（四）分离或浓缩的血细胞,二、血标本采集的方法,第一节血液标本的采集,皮肤采血静脉采血法动脉采血,采集部位,普通静脉采血真空采血法,凡用血量较少,0.1ml的检验项目，均可用此法采血。如：手工操作做RBC、WBC、Hb、PLT等。婴幼儿血液分析仪做血常规,第一节血液标本的采集,二、血标本采集的方法（一）皮肤采血(毛细血管采血),二、血标本采集的方法（一）皮肤采血(毛细血管采血)1、采血部位：1）、手指：WHO推荐以左手中指或无名指尖内侧为宜。婴幼儿半岁以上用手指,半岁以下用拇指或足底部内、外侧缘烧伤病人视具体情况选择皮肤完整部位采血或静脉血。,第一节血液标本的采集,（一）皮肤采血：1、采血部位：1）手指：,第一节血液标本的采集,2）耳垂：痛感较轻，操作方便，适于反复采血。缺陷：血循环较差，受气温影响较大，血细胞汁数和血红蛋白浓度等结果静脉血，且冬季波动幅度较大，已是淘汰。,（一）皮肤采血：2、采血器材（1）采血针皮肤采血法1）微量吸管：10ul、20ul刻度。2）采血针：用三棱针或专用“采血针”，用前须高压或煮沸消毒，为避免交叉感染应严格实行一人一支吸管和一根针。目前最好的是激光无痛采血仪。3）消毒用具：3、采血方法：略,第一节血液标本的采集,（一）皮肤采血：4、注意事项：(1)采血部位应无水肿、冻疮、炎症、紫绀、溃疡。(2)注意消毒及用具一次性使用。(3)以血液自行流出为佳。可轻挤压,切忌用力挤压，以免组织液混入。(4)采血顺序为：PLTRBCHbWBCDC等。(5)若做出血时间测定,需另刺一针，不能拭去第一滴血。凝血时间另外测定。,第一节血液标本的采集,第一节血液标本的采集,激光皮肤采血法（1）器材：激光采血器、一次性激光防护罩、微量吸管、消毒用品（2）方法：,第一节血液标本的采集,激光皮肤采血法（3）注意事项：禁止在有易燃易爆气体环境中操作，以免引起爆炸事故；禁止用肉眼观看激光窗口或将激光窗口对准身体其他部位；防护罩要紧贴采血部位，以免影响标本采集效果；激光采血器的透镜部分应经常清洁。,（二）静脉采血法1、普通静脉采血凡需血量较多（0.2ml）的检验项目，用此采血法，如：多项血细胞分析、压积、血沉等。采血部位：肘前静脉为主，亦可用手背部、手腕部和外踝部静脉。幼儿用颈外静脉采血。,第一节血液标本的采集,（二）静脉采血法1、普通静脉采血注意事项严格无菌操作，止血带压迫时间不超过1min,抽血时避免气泡。以检查项目要求选择是否空腹采血。出血性疾病要用硅化或塑料注射器和试管。应拔下注射针头后,将血沿试管壁注入试管。,第一节血液标本的采集,2、真空采血法又称负压采血法。真空采血装置有套筒式、头皮静脉式。封闭式采血无需容器之间转移，减少了溶血现象，同时样本转运方便，避免医患间的交叉感染。根据需要不同，不同检验项目，在真空管上标有不同颜色。,第一节血液标本的采集,盖子颜色添加抗凝剂注意事项用途红色无凝块形成约需30min化学、血清学、血库紫色EDTA须颠倒混匀68次全血细胞计数(CBC)淡蓝色枸橼酸钠须颠倒混匀；血液与抗凝血检查(PT、APTT、凝剂比例为9:1因子测定)绿色肝素钠、肝素锂、根据实验需要选择不同化学肝素铵类型的肝素灰色氟化钠、草酸钾不能用于其他化学检查葡萄糖、糖耐量、乙醇浓度黄色多茴香脑磺酸钠须颠倒混匀8次血培养(SPS)深蓝色无抗凝剂或肝素化学清洁的试管毒理学、微量金属钠、EDTA金黄色分离胶凝块激须颠倒混匀5次，使血液化学，不适于血库活剂与激活剂充分接触。凝块完全形成后离心淡绿色分离胶肝素锂钾测定桔黄色凝血酶须颠倒混匀8次化学黑色枸橼酸钠血液与抗凝剂比例为4:1血沉棕色肝素钠铅浓度80草酸酸盐可被分解为碳酸盐而失效。,三、血液标本的抗凝,（三）双草酸盐：草酸钾+草酸铵用途：草酸钾盐或钠盐可使红细胞体积皱缩（约11%）。草酸铵可使红细胞胀大。二者适当混合不影响红细胞形态和体积如：红细胞比积，血细胞计数，网织红计数等，抗凝以后小时结果可靠。缺点：草酸盐可引起血小板聚集，并可影响白细胞形态故不适用于血小板计数和白细胞分类计数。,三、血液标本的抗凝,（四）肝素：肝素广泛存在于肺、肝、脾等几乎所有组织的血管肥大细胞和嗜碱性粒细胞的颗粒中。,三、血液标本的抗凝,（四）肝素：机理：1.与抗凝血酶(AT-)一起，在低浓度能抑制因子IXa、和PF3之间的作用，阻止凝血酶形成。2.加强抗凝血酶(AT-)灭活丝氨酸蛋白酶，从而阻止凝血酶形成3.抑制凝血酶的自我催化抑制因子的作用。4.高浓度时可阴断凝血酶与纤维蛋白的反应,三、血液标本的抗凝,（四）肝素：配制：肝素粉（每mg含100125单位），配成1g/L水溶液取0.5ml置小瓶中，放3750烘干，可抗凝血5ml。,三、血液标本的抗凝,三、血液标本的抗凝,（四）肝素：用途：肝素具有抗凝能力强，不影响血细胞引起溶血等优点，为一种较好的抗凝剂。红细胞计数，血红蛋白测定，红细胞比积及多种生化分析。也是抗血栓药物之一。缺点：过量肝素会引起白细胞凝集和血小板减少，故不能用于白细胞计数，血小板计数。肝素抗凝血瑞氏染色后背景呈是深兰色，影响镜检，故也不适于作DC。,三、血液标本的抗凝,（五）乙二胺四乙酸（EDTA）盐：机理:与血中钙离子结合成螯合物,阻止血液凝固.配制：ICSH建议其使用浓度为每毫升血1.52.2mg。实验室常将其配成15g/L，取0.5ml100，烘干，可抗凝血5ml。,三、血液标本的抗凝,用途：适用于多项血液学检查血细胞计数（特别是血小板计数）红细胞比积测定（室温下48h内红细胞比积不改变）,（五）乙二胺四乙酸（EDTA）盐：,三、血液标本的抗凝,（五）乙二胺四乙酸（EDTA）盐：缺点：1.影响血小板聚集和白细胞吞噬功能，不适于出血凝血检查及血小板功能检验。2.能影响某些酶的活性和抑制红斑狼疮因子，故不适于制作组化染色和检查红斑狼疮细胞的血涂片。,三、血液标本的抗凝,（六）脱纤维蛋白法（物理抗凝）：方法：将血液注入有玻璃珠的盛器中不停转动，使纤维蛋白缠绕凝固于玻璃珠上，从而阻止血凝固。或用棉签挠。用途：适用于免疫学检查和红斑狼疮细胞检查。,四、血标本的运送、保存与处理血标本处理的基本原则把每一分标本当作无法重新获得的唯一标本,加以小心运送、保护、保存、检测和报告；要视每一分标本都有传染性,对高危标本要注明标识；严禁用口吸标本,避免标本污染皮肤和实验台；检验完毕,标本必须消毒处理,容器要消毒、毁型或焚烧。,四、血标本的运送、保存与处理（一）血液标本检测前预处理分离血清、分离血浆、分离血细胞（二）血液标本运送遵循：唯一标识原则、生物安全原则、及时运送原则,四、血标本的运送、保存与处理（三）血液标本拒收溶血、容器不当、标本量不足、转运不当、申请单标识不清、标本污染或破损均要拒收（四）血液标本保存按要求分为室温保存、冷藏保存、冷冻保存立即送检标本：血氨、血沉、血气分析酸性磷酸酶、乳酸等。（五）检测后标本处理原则：将危险减至最小、对环境危害减至最小,第二节血液标本采集质量保证,一、采血环境要求与生物安全1、环境要求：环境应舒适、宽敞、明亮通风、有足够的采血窗口。2、生物安全：防止交叉感染，履行环境消毒。,血液标本的采集是分析前质量控制的重要环节之一,第二节血液标本采集质量保证,二、标本的采集的一般要求（一）检验申请单（二）标本采集和处理具体要求患者告知、患者准备说明书、标本采集类别和数量、标本采集日期和时间、标本处理要求、标本采集人员、标本采集器材和安全处理。（三）标本信息完整性与接收对特殊标本处理、急危重病人标识、规定时间内送检、注意物理条件对标本影响、标本归档记录、接收记录等,第二节血液标本采集质量保证,三、血液标本采集及检测结果的影响因素1、患者生理状态和饮食的影响标本采集时的活动情况、精神状态、饮食、吸烟、等都影响结果(见p12表1-5),、药物对检验结果影响:影响反应系统待测成分的物理性质；参与检验化学反应；影响机体生理功能和细胞活动的代谢；对器官的药理活性和毒性作用。,第二节血液标本采集质量保证,3、采血操作对检验结果的影响（1）采血的时间应尽可能上午9时前空腹采血，应尽可能检查和治疗前采血（）采血部位1)皮肤采血：避开炎症、化脓、冻伤等处；2)静脉采血:选择大而浅表的大血管。,第二节血液标本采集质量保证,3、采血操作对检验结果的影响（3）采血体位：直立比仰卧血液浓缩，细胞计数和大分子增高。（4）止血带压迫时间：不超过1min，过长将引起血液浓缩，成分改变，影响结果。,第二节血液标本采集质量保证,4、其他（1）输液：（2）避免溶血：（3）抗凝剂对标本影响（4）低温保存对标本的影响血液分析仪测定抗凝血标本不宜低温保存，低温可使血液成分及细胞形态发生变化；室温保存时间不能超过6h，冰冻标本不宜反复冻融，解冻后应完全融化、混匀后应用。,第三节血涂片制备和染色,一、血片制备（一）载玻片的清洁、新玻片用1mol/L（10）Hcl浸泡24h清水彻底冲洗烤干后备用。、用过的玻片用肥皂水煮沸20min趁热将血膜刷洗干净清水反复冲洗。,第三节血涂片制备和染色,（二）制血片：推片法于载玻片1/3与2/3交界处加绿豆大血1滴,左手拇指与中指持载玻片(血滴靠中指端),右手持边缘平滑的推片,从血滴前方接触血液使血液散开成一线以推片与载片保持2530度夹角向前(母指方向)推动形成血膜,(三)良好涂片标准,(1)呈头、体、尾分明的舌形外观(2)血膜均匀一致，厚薄适宜(3)两边留有空隙(较大细胞常在边缘),(1)血滴大小(2)推片与玻片之间角度(3)推片速度,二、血涂片染色,常用染色方法有：瑞氏染色法、姬姆萨染色法、瑞姬氏染色法(一)瑞氏染色法（right)【原理】1、瑞氏染液组成：瑞氏粉+甲醇,(1)瑞氏粉的组成：美蓝的氯盐+伊红的钠盐+水瑞氏粉沉淀(ME)瑞氏粉不溶于水，而溶于甲醇,二、血涂片染色,(2)瑞氏粉的性质：是一种中性盐（伊红E、美蓝M），难溶于水，可溶于甲醇并解离,(一)瑞氏染色法（right)【原理】1、瑞氏染液组成：(1)瑞氏粉的组成：,ME(瑞氏粉)甲醇M+E-瑞氏染液美蓝氧化后-天青(紫红色),二、血涂片染色,2、甲醇作用：固定血膜片（具强大脱水力）,防止细胞溶解；增加染色效果；使细胞粘附于玻片溶解瑞氏粉，起溶剂的作用：过多瑞氏液或染色过久反可使细胞不着色。,(一)瑞氏染色法（right)【原理】1、瑞氏染液组成：,二、血涂片染色,3、细胞对染液的反应：染色过程中既有物理吸附作用又有化学亲和力作用（各类细胞和细胞的各种成份,化学性质不同，对染液亲和力不同对各染料可发生不同的化学结合）。因而在染色后同一张血膜上，可以看到不同的着色，从而区分各细胞。,(一)瑞氏染色法（right)【原理】1、瑞氏染液组成：2、甲醇作用：,二、血涂片染色,3、细胞对染液的反应：带正电的蛋白质(细胞内碱性物质)与带负电的酸性伊红结合，而染成红色如：红细胞浆内Hb