抗生素微生物检定法.ppt

第五模块生物检测技术,第八章抗生素微生物检定法,掌握抗生素微生物检定法的基本原理；理解浊度法的测定原理；掌握管碟法二剂量法的具体操作步骤及相关注意事项能使用管碟法对药物进行效价测定,学习目标,技能目标,知识目标,复习提问,液相色谱定性、定量方法要有哪几种？,1.,2.,3.,液相色谱法流程。,液相色谱法定性和定量依据。,新课大纲,第一节抗生素微生物检定法,一、概述二、标准品及效价三、管碟法,一、概述,系指在适宜条件下，根据量反应平行线原理设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，计算抗生素活性（效价）的方法，能够直观地反应抗生素总的抗菌能力。本法系利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用，比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小，以测定供试品效价的一种方法。特点：灵敏度高、用量少、专属性不强,抗生素微生物检定法,是指当标准品和供试品属于同一性质的抗生素时，标准品溶液和供试品溶液对一定试验菌所得的剂量反应曲线，在一定剂量范围内相互平行。即“同种物质，同种反应”，因此每种抗生素有着各自的效价单位，不同抗生素之间的效价单位没有可比性。,量反应平行线原理,3.方法分类:,扩散法,浊度法,稀释法,分为：,国际通用法定方法:扩散法中的管碟法,管碟法又称管碟琼脂扩散法是利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用，比较标准品与供试品二者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小，以测定供试品效价的一种方法。在一定范围内，抗生素溶液的对数浓度（剂量）与抑菌圈面积或直径成正比，根据抑菌圈的大小计算出抗生素溶液的浓度。,管碟法分为三种方法一剂量法又称标准曲线法，常用于原料生产的过程监控、中间体或半成品检验；二剂量法是抗生素质量检验的常规方法；三剂量法主要用于标准品的标定。中国兽药典（2005年版）收载了二剂量法和三剂量法。,浊度法系利用抗生素在液体培养基中对试验菌生长的抑制作用，通过测定培养后细菌浊度值的大小，比较标准品与供试品对试验菌生长抑制的程度，以测定供试品效价的一种方法。,二、抗生素标准品及效价单位,定义:标准物质,国家与国际标准品,标准品的基本要求,使用保存,抗生素效价单位:单组份和多组分,指抗生素药物的作用强度。用单位“IU”作为其有效成分的一总衡量尺度。目前，抗生素的剂量原则上以纯品的重量表示，并加注单位。如土霉素025克（250000单位）即1毫克=1000单位；个别品种仍以习惯沿用，如青霉素仍用单位表示剂量。,抗菌效价：,T2,S1,S2,T1,三、管碟法,扩散现象：由球面扩散动力学公式表示相当于直线方程：y=bX+c抗生素总量的对数值与所形成抑菌圈直径的大小呈直线关系，来测定抗生素抗菌活性。,1.理论依据：,2.影响因素?,超净工作台,双碟,抑菌圈测量仪,钢管,陶瓦盖,恒温培养箱,玻璃仪器,游标卡尺,缓冲液,培养基,试验菌,灭菌刻度吸管,3.仪器用具材料,抑菌圈（抗生素效价）自动测量分析仪,菌悬液的制备,检定法,标准品溶液的制备,供试品溶液的制备,双碟的制备,灭菌缓冲溶液,培养基及其制备方法,4.测定方法,水1000ml,磷酸二氢钾1.32g,磷酸氢二钾3.68g,氯化钠3.sg,酵母浸出粉3g,胨5g,牛肉浸出粉1.5g,葡萄糖1g,培养基,培养基及其制备方法,除葡萄糖外，混合上述成分，加热溶化后滤过，加葡萄糖溶解后，摇匀，调节P值使灭菌后为7072，在115oC灭菌3分钟，即得。,磷酸盐缓冲液（PH6.0）取磷酸氢二钾2g与磷酸二氢钾8g，加水使成1000ml，滤过，在115oC灭菌30分钟，即得。磷酸盐缓冲液（pH7.8）取磷酸氢二钾5.59g与磷酸二氢钾0.41g，加水使成1000ml，滤过，在115oC灭菌30分钟，即得。,灭菌缓冲液,枯草芽抱杆菌悬液取枯草芽抱杆菌（63501）的普通琼脂斜面培养物，接种于盛有普通琼脂斜面培养基的培养瓶中，在3537oC培养7日，用革兰氏染色法涂片镜检，应有芽孢85以上。用灭菌水将芽孢洗下，在65oC加热30分钟，即得。短小芽抱杆菌悬液取短小芽抱杆菌（63202）的普通琼脂料面培养物，照上述方法制备，即得。,菌悬液的制备,标准品的使用和保存，应照标准品说明书的规定。临用时照附表的规定进行稀释。精密称（或量）取供试品适量，用各该药品项下规定的溶剂溶解后，再按估计效价或标示量照附表的规定稀释至与标准品相当的浓度。,标准品溶液的制备,供试品溶液的制备,取内径90mm、高1617mm的平底双碟，分别注入加热融化的培养基20ml，使在碟底内均匀摊布，放置水平台上使凝固，作为底层。另取培养基适量加热融化后，放冷至4850oC（芽孢可至60），加入规定的试验菌悬液适量（能得清晰的抑菌圈为度。二剂量法标准品溶液的高浓度所致的抑菌圈直径在1824mm。,双碟的制备,二剂量法取照上述方法制备的双碟不得少于4个，在每1双碟中对角的2个不锈钢小管中分别滴装高浓度及低浓度的标准品溶液，其余2个小管中分别滴装相应的高低两种浓度的供试品溶液，高、低浓度的剂距为2：1或4：1。在规定条件下培养后，测量各个抑菌圈直径（或面积）。,检定法,供试品效价相当于标示量或估计效价的百分数,=-1T1T2S1S2I100T2S2T1S1,统计计算与结果判定,S2=高浓度标准品溶液所致的各抑菌圈直径的总和，S1=低浓度标准品溶液所致的各抑菌圈直径的总和，T2=高浓度供试品溶液所致的各抑菌圈直径的总和，T1=低浓度供试品溶液所致的各抑菌圈直径的总和。I=高浓度与低浓度比值的对数。将此百分数乘以供试品估计效价的毫克单位数，即得供试品每lmg中所含的单位数。,5.应用示例,标准品及供试品溶液的制备,滴装溶液,培养,抑菌圈测量,误差统计分析,测定结果的计算