基因诊断与基因治疗.ppt

基因诊断与基因治疗GeneDiagnosisandGeneTherapy,基因诊断用分子生物学技术对生物体的DNA序列及其产物（RNA和蛋白质）进行定性、定量分析，为疾病诊断提供依据。,基因诊断的前提已明确疾病表型与基因型的关系,基因诊断包括定性和定量分析DNA、RNA或蛋白质水平变化，如病毒基因及其转录产物在体内从无到有、癌基因表达水平从低到高；基因结构变化，如点突变引起基因失活、染色体转位引起基因异常激活或灭活。,基因诊断的特点高特异性高灵敏性早期诊断性应用广泛性,基因诊断的基本技术流程,样品抽提,DNA,RNA,cDNA,PCR扩增,分子杂交,反转录,合成寡核苷酸引物,制备和标记探针,杂交信号检测,基因诊断中常用的分子生物学技术,核酸分子杂交（Nucleicacidhybridization）聚合酶链式反应(PCR)单链构象多态性（SSCP）限制性片段长度多态性（RFLP）DNA序列测定（DNAsequencing）生物芯片（biochips）Western免疫印迹（Westernblotting）免疫组织化学诊断,PCR在基因诊断中的应用,RT-PCR荧光定量PCR多重-PCRPCR-ASO（等位基因特异性寡核苷酸探针法）PCR-SSCP（单链构象多态性分析）PCR-RFLP（限制性片段长度多态性分析）,多重PCR,多重PCR示意图A：普通PCR；B：多重PCR,PCR-ASO(等位基因特异性寡核苷酸探针法）,N：正常基因；H：杂合子基因；M：突变基因,ASO1,ASO2,N,H,M,单链构象多态性分析（single-strandconformationpolymorphism,SSCP）,DNA的突变造成DNA片段中碱基序列不同，变性为单链后在中性聚丙烯酰胺凝胶中的构象不同（单链构象多态性），利用迁移率的差别可使各种序列不同的单链分离开来。,PCR-SSCP分析原理示意,限制性片段长度多态性分析（restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP）,由于DNA变异产生新的酶切位点或原有的酶切位点消失，在用限制性核酸内切酶消化时产生不同长度或不同数量的片段。可借助核酸分子杂交或PCR进行检测。,GAATTC,CTTAAG,EcoR限制性内切酶位点的变化,左侧：正常；右侧突变,序列分析用于基因诊断研究,生物芯片（biochips）,基因芯片（genechips）蛋白质芯片(proteinchip),基因诊断中常用的分子生物学方法比较,遗传病的基因诊断GeneDiagnosisofHereditaryDiseases,（一）镰状细胞贫血病,一、血红蛋白病,1.镰状红细胞贫血患者基因诊断-ASO杂交法2.HBS的限制性内切酶谱分析3.HBS的PCR-RFLP分析,正常的（N）的ASO探针：5-ACTCCTGAGGAGAAGTCTGC-3突变的（M）的ASO探针：5-ACTCCTGTGGAGGAAGTCTGC-3,1.镰状红细胞贫血患者基因诊断ASO杂交法,斑点杂交结果N：正常；M突变,镰状红细胞贫血患者ASO杂交法检测,N-ASO,M-ASO,正常突变突变纯合子杂合子纯合子,5,3,正常基因,1.15kb,(CCTGAGG),突变基因,1.35kb,(CCTGTGG),镰状红细胞贫病的限制性内切酶谱分析,Mst酶切位点（CCTNAGG）,2.HBS的限制性内切酶谱分析,目录,0.2kb,1.15kb,1.35kb,正常人,突变携带者,患者,镰状红细胞贫血病的限制性内切酶谱分析,目录,3.HBS的PCR-RFLP分析,正常人的扩增产物经Mst消化可生成54bp和56bp两个片段，而镰状细胞贫血症患者的DNA片段不被酶切，仍为110bp，杂合子可见三条带,正常人,杂合体,患者,Marker,传染病的基因诊断GeneDiagnosisofInfectiousDiseases,一、病毒性疾病,甲型肝炎病毒（HAV）HAV系RNA病毒，利用RT-PCR技术可从粪便中检测出甲型肝炎病毒的基因组RNA。乙型肝炎病毒（HBV）设计保守区序列引物，扩增各型HBVDNA片段；设计位于可变区的引物扩增某一亚型HBVDNA，以便分型。丙型肝炎病毒（HCV）HCV为正链RNA病毒，先反转录成cDNA，再进行巢式PCR检测HCV。,二、细菌引起的疾病,结核分枝杆菌先设计一对特异性引物，用PCR技术扩增出一383bp序列，再用探针杂交，灵敏度可达到100个细菌水平。幽门螺杆菌（HP）主要采用PCR技术：检测HP染色体DNA特异片段；检测HP尿素酶A基因；用PCR-RFLP鉴别HP菌株。,肿瘤的基因诊断GeneDiagnosisofMalignantTumors,一、原癌基因与抑癌基因的检测二、常见肿瘤的基因诊断乳腺癌结肠癌,一、原癌基因与抑癌基因的检测,1原癌基因的检测ras基因家族由H-ras、K-ras和N-ras组成。最常见的突变是第12、13、59或第61位密码子的点突变。胰腺癌、结肠癌、肺癌以K-ras突变为主，如第12位密码子突变，由编码甘氨酸的GGT突变为TGT、GTT或GAT，少数突变为GCT。急性淋巴细胞白血病，慢性淋巴细胞白血病等以N-ras突变为主；泌尿系统肿瘤则以H-ras突变为主。,PCR及PCR-SSCP分析：扩增ras基因第12位密码子点突变部位，再用SSCP技术进行分析，或者直接测序确定患者ras原癌基因的点突变。核苷酸杂交技术（如ASO）：检测ras基因第12位密码子点突变。,2.ras原癌基因突变常用的检测方法,3抑癌基因p53的检测,p53基因以密码子第175位、第248位、第249位、第273位及第282位点突变率最高。在结直肠癌、乳腺癌、小细胞肺癌，都可见异常的p53基因蛋白。p53的基因诊断方法有（1）PCR-SSCP分析技术（2）DNA序列分析（3）PCR-RFLP分析,基因治疗GeneTherapy,基因治疗指将目的基因通过基因转移技术（病毒载体介导或者非病毒载体介导的基因转移技术）导入靶细胞内，目的基因表达产物对疾病起治疗作用。,基因治疗分类,体细胞(somaticcell)基因治疗生殖细胞(germline)基因治疗,只限于某一体细胞的基因的改变只限于某个体的当代对缺陷的生殖细胞进行矫正当代及子代,一、基因治疗的策略,（一）基因置换（genereplacement）,定义：指将特定的目的基因导入特定细胞，通过定位重组，导入的正常基因，以置换基因组内原有的缺陷基因。,目的：将缺陷基因的异常序列进行桥正。对缺陷基因的缺陷部位进行精确的原位修复，不涉及基因组的任何改变。,转导基因的载体与基因组DNA具有相同的序列。带有目的基因的载体就能找到同源重组的位点，进行部分基因序列的交换。基因同源重组技术又称为基因打靶（genetargeting),基因同源重组技术,（二）基因添加（geneaugmentation）,定义:通过导入外源基因使靶细胞表达其本身不表达的基因。,类型:在有缺陷基因的细胞中导入相应的正常基因，而细胞内的缺陷基因并未除去，通过导入正常基因的表达产物，补偿缺陷基因的功能；向靶细胞中导入靶细胞本来不表达的基因，利用其表达产物达到治疗疾病的目的。,（三）基因干预（geneinterference）定义：采用特定的方式抑制某个基因的表达，或者通过破坏某个基因的结构而使之不能表达，以达到治疗疾病的目的。,定义：将“自杀”基因导入宿主细胞中，这种基因编码的酶能使无毒性的药物前体转化为细胞毒性代谢物，诱导靶细胞产生“自杀”效应，从而达到清除肿瘤细胞的目的。应用：是恶性肿瘤基因治疗的主要方法之一。,（四）自杀基因治疗(SuicideGeneTherapy),自杀基因的作用机制,（五）基因免疫治疗,通过将抗癌免疫增强的细胞因子或MHC基因导入肿瘤组织，以增强肿瘤微环境中的抗癌免疫反应。,二、基因转移技术,基因治疗的两种途径,载体,目的基因,invivo,exvivo,靶细胞,基因转移(genetransfer)技术,1.病毒介导的基因转移2.非病毒介导的基因转移,反转录病毒的结构及生活周期,（1）反转录病毒,反转录病毒载体的特点,1）反转录病毒包膜上糖蛋白，能够被许多哺乳动物细胞膜上的特异性受体识别，从而使反转录病毒携带的遗传物质高效地进入靶细胞。,2)前病毒通过LTR高效整合至靶细胞基因组中，有利于外源基因在靶细胞中的永久表达。,3)病毒颗粒以出芽的方式分泌至辅助细胞培养的上清液中，易于分离制备。,反转录病毒载体的主要缺点,1）随机整合，有插入突变、激活癌基因的潜在危险；2）反转录病毒载体的容量较小，只能容纳7kb以下的外源基因。,（2）腺病毒(adenovirus)载体腺病毒是双链DNA病毒。它通过受体介导的内吞作用进入细胞内，然后腺病毒基因组转移至细胞核内，保持在染色体外，不整合进入宿主细胞基因组中。,腺病毒的优点,基因导入效率高，对人类安全；,宿主范围广；,基因转导与细胞分裂无关；,腺病毒载体容量较大，可插入7.5kb外源基因。,腺病毒载体缺点,宿主的免疫反应导致腺病毒载体表达短暂。,靶向性差。,不能整合到靶细胞的基因组DNA中。分裂增殖快的细胞，导入的重组病毒载体，随分裂而丢失的机会增多，表达时间相对较短。,（3）腺病毒相关病毒载体单链线状DNA缺陷型病毒。其基因组DNA小于5kb，无包膜，外形为裸露的20面体颗粒。AAV不能独立复制，只有在辅助病毒（如腺病毒、单纯疱疹病毒等）存在时，才能进行复制和溶细胞性感染，否则只能建立溶源性潜伏感染。,腺病毒相关病毒载体（AAV）的特点,以潜伏感染为主；病毒基因组与细胞共存；若细胞受刺激，表达应激基因，使AAV病毒复制；产生子代病毒并释放，又感染新的细胞，建立新的潜伏状态。,AAV载体的缺陷,常用基因治疗载体,7.5kb,2.非病毒载体介导的基因转移系统（1）脂质体介导的基因转移技术基本原理:利用阳离子脂质体单体与DNA混合后，可以自动形成包埋外源DNA的脂质体，与细胞一起孵育，即可通过细胞内吞作用将外源DNA转移至细胞内，并进行表达。脂质体介导的基因转移技术使用方便、成本低廉。,脂质体介导的基因转移示意图,（2）受体介导转移技术,多聚阳离子与细胞配体偶联，通过电荷相互作用与带负电荷的DNA结合，将DNA包围，配体暴露于表面。该复合物可被带有特异性受体的靶细胞吞饮，从而将外源DNA导入靶细胞。,受体介导转移技术示意图,（3）基因直接注射技术将基因直接注入动物体内，表达基因产物。如将促进心脏血管生长的基因直接注入实验鼠的心脏，可使其心脏壁内毛细血管增加30%40%；将胰岛素基因直接注入鼠骨骼肌细胞，能分泌糖尿病所缺少的胰岛素；肌内注射凝血因子基因，可产生血友病所需的凝血因子。,基因直接注射法的优点,排除病毒载体可能潜在的致癌性或其他副作用；导入的基因不需整合即可表达，避免了反转录病毒载体导入整合后，一旦发生副作用不易中止或逆转的缺点；基因直接注射法可反复使用，而病毒载体则可能诱导体内免疫应答，致使反复治疗效果下降。,三、基因干预（geneinterference）,（一）反义RNA（antisenseRNA）利用反义RNA对体外培养的细胞进行基因表达调控，通常采用的方法有两种：（1）体外合成反义RNA，直接作用于培养细胞，细胞吸收RNA后，发挥作用。（2）构建一些能转录反义RNA的重组质粒，将这些质粒转入细胞中，转录出反义RNA而发挥作用。,（二）干扰RNA,RNA干扰（RNAinterference，RNAi）是一种由双链RNA诱发的基因沉默现象。在此过程中，与双链RNA有同源序列的mRNA被降解，从而抑制该基因的表达。,RNA干扰的机制,RNA干扰过程主要有2个步骤：,（1）小干扰性RNA（siRNA）,（2）siRNA与细胞内的某些酶和蛋白质形成复合体，称为RNA诱导的沉默复合体（RNA-inducedsilencingcomplex,RISC)。,该复合体可识别与siRNA有同源序列的mRNA，并在特异的位点将该mRNA切断,长双链RNA被细胞内的双链RNA特异性核酸酶Dicer切成21-23个碱基对的短双链RNA，称为小干扰性RNA（smallinterferingRNA，siRNA）,RNA干扰机制示意图,1.体外化学合成;2.用质粒载体或病毒载体可在细胞内稳定地生成。,siRNA的产生,四、基因治疗的应用研究,腺苷脱氨酶(ADA)和嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)缺乏症珠蛋白生成障碍性贫血和血红蛋白病血友病和其他血浆蛋白缺乏症苯丙酮酸尿症和其他先天性代谢缺陷病莱-纳(Lesch-Nyhan)综合征家族性高胆固醇血症囊性纤维化病,(一)遗传病基因治疗,（二）恶性肿瘤基因治疗研究,（1）通过基因置换和基因补充，导入多种抑癌基因以抑制癌症的发生、发展和转移；,（2）抑制癌基因的活性，通过干扰癌基因的转录和翻译，发挥抑癌作用；,（3）增强肿瘤细胞的免疫原性，通过对肿瘤组织进行细胞因子修饰，刺激机体免疫系统产生对肿瘤细胞的溶解和排斥反应；,（4）通过导入“自杀基因”杀伤癌细胞。(5)提高化疗效果的辅助基因治疗：药物增敏基因治疗；耐药基因治疗。,（三）病毒性疾病的基因治疗研究,病毒感染人体后可能急性发病，还可以在人体内长期潜伏，造成终身伤害。病毒还是造成先天畸形的重要因素之一。它与某些癌症、自身免疫性疾病和内分泌疾病也存在一定的关联。临床上对绝大多数病毒感染性疾病仍然缺乏