脓汁和粪便标本中病原菌的检测-5.ppt

器材准备,斜面培养物4支，营养肉汤培养物（菌液）4支，半固体琼脂4支，营养琼脂平板4个，微量发酵管1套，青链庆纸片1套，眼科镊子2把。,医学微生物学实验综合性实验一,脓汁和粪便标本中病原菌的检测（五）糖发酵试验药敏试验血浆凝固酶试验半固体接种法,糖发酵试验SugarFermentationTest,不同细菌具有不同的糖分解酶，分解各种糖的代谢产物也各不相同，有的产酸，有的产酸又产气，据此，可以鉴别各种细菌。糖发酵管:葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇和蔗糖等。指示剂：溴甲酚紫，PH6.8为紫色，5.2为黄色。原理：多糖单糖丙酮酸、酸性产物(产气)pH指示剂呈酸性变色。结果:培养基变色无气泡“+”，培养基变色有气泡“”，培养基不变色“-”。应用:观察细菌对糖的分解情况,常用于肠道杆菌鉴定。,甲紫黑葡萄糖乙紫黑乳糖丙粉红葡萄糖丁粉红乳糖,3724小时,细菌的糖发酵试验,实验分组,俩俩相对4人为一个小组,组号编在电源插座上。每组按从前到后,从左到右的顺序，分别编号为甲、乙、丙、丁。,甲乙4丙丁,甲乙3丙丁,甲乙2丙丁,甲乙1丙丁,甲乙5丙丁,甲乙8丙丁,甲乙7丙丁,甲乙6丙丁,甲乙10丙丁,甲乙9丙丁,讲台,抗菌素敏感性试验AntibioticSusceptibilityTest,磺胺1907年发现，1935年临床应用。青霉素1929年发现，1945年临床应用。我国住院病人抗菌素使用率达70%，新生儿病房抗菌素使用率达100%。为了避免抗菌药物使用的盲目性，防止因不合理用药，导致耐药性细菌的增多、药物中毒、治疗失败、菌群失调等问题的发生，用药前（时），做药物敏感性试验。,滤纸片扩散法DiscAgarDiffusionMethod将含有定量抗菌素的纸片，平贴在已经接种了试验细菌的平板上。纸片中的抗菌素吸收培养基的水分，溶解后不断向周围扩散，形成递减的梯度浓度。敏感细菌在纸片周围的生长受到抑制，而形成没有细菌生长的抑菌圈依抑菌圈的有无、大小来判断敏感性。敏感（Sensitive）：试验细菌所引起的感染，可以用常用剂量的某种抗菌药物治愈。耐药（Resistant）：试验细菌引起的感染，不能用该种抗菌药物治愈。试验菌用量以对照琼脂平板表面生长的菌落呈密集或半密集为宜。,抗菌素敏感性试验分工,甲黄色菌液平板+青、链、庆纸片。乙白色菌液平板+青、链、庆纸片。丙紫黑菌液平板+青、链、庆纸片。丁粉红菌液平板+青、链、庆纸片。每人1个营养琼脂平板,抗菌素敏感性试验方法,接种环取菌液35ul2环,在平板培养基表面，拉出2条细菌接种线，使呈“十字形”(注意：操作时，不得同时握持菌液管和平板，以免菌液倒出来，造成污染）平板密集划线接种细菌（纱窗样）。设计三点，呈等边三角距离，点距离平皿边缘约15mm。作标记：青、链、庆。镊子火焰消毒，夹取相应的药物纸片，平贴在已设定的位置上，按压，镊子火焰灭菌。371824小时培养，观察结果。试验菌用量以对照琼脂平板表面生长的菌落呈密集或半密集为宜。,灭菌取菌液2次,甲黄色菌液乙白色菌液丙紫黑菌液丁粉红菌液,35ul+35ul,接种线呈十字形,纸片扩散法：菌液密集涂布平板标记:青、链、庆贴青霉素、链霉素、庆大霉素纸片按压倒置培养1824小时观察结果。,标记,贴抗菌素纸片,凝固酶试验CoagulaseTest,致病性葡萄球菌能产生血浆凝固酶，使血浆中的纤维蛋白原转变为纤维蛋白,附着于细菌表面,产生凝固。葡萄球菌产生两种凝固酶:一种是与细胞壁结合的凝固酶,为结合凝固酶;另一种是细胞释放于培养基中,为游离凝固酶；二者抗原性不同。在体内，凝固的血浆沉积在菌体表面，阻碍吞噬细胞的吞噬和杀菌物质的破坏，从而有利于细菌的生长繁殖、引起感染。体外试验有试管法和玻片法两种。试管法检测游离凝固酶，结果准确。玻片法只能检测结合凝固酶，比较简便，常作为快速筛选技术（金黄色葡萄球菌中有10%15%可呈阴性反应）。,凝固酶试验试管法：游离凝固酶凝血酶纤维蛋白原纤维蛋白血浆凝固凝固酶试验玻片法：结合凝固酶（菌体表面）纤维蛋白原纤维蛋白细菌凝集,凝固酶试验玻片法,取二滴兔血浆置于洁净的玻片上。分别用接种环取白色和黄色菌苔(23个菌落的菌量)与血浆研磨混合，立即观察结果。菌液出现明显凝块为阳性，否则为阴性。白色菌苔容易混合均匀，黄色菌苔常涂抹不开。反复旋转或侧倾载玻片，让菌液流动起来，结果更明显。,载玻片1张,兔血浆各15ul,右侧血浆与白色菌苔混合,左侧血浆与黄色菌苔混合,半固体穿刺接种法StabSemisolidMethod具有鞭毛能够真正运动的细菌，在半固体培基中,能冲破低浓度琼脂的阻力，自接种部位向周围移动扩散生长，使培养基呈扩散云雾状混浊状态。无鞭毛不能运动的细菌，只能沿着穿刺线生长繁殖，穿刺线边缘清晰，周围培养基清澈透明。方法：接种针斜面取菌，从半固体培养基中心，垂直刺入，到达培养基底部4/5处，再循原来的路线，退出接种针。甲紫黑，乙紫黑；丙粉红，丁粉红。,半固体穿刺接种法甲紫黑,乙紫黑,丙粉红,丁粉红。,37,24小时,标记:组号,颜色,生物安全警告,本次实验（糖发酵试验、药敏试验、血浆凝固酶试验和半固体接种）操作，可能产生几百个微生物气溶胶颗粒。气溶胶粒径100um沉降很快,50um在0.4s内扩散开,5um通过呼吸道直接到达肺泡。Pike博士对实验室感染统计分析结果发现，不明原因的感染高达82%，大多数是气溶胶在空气中扩散引起的。实验时应坐着，在火焰周围1020厘米内操作，保持安静、有序，尽量少说话、少走动，以免感染病原菌。,细菌的糖发酵试验P16甲紫黑葡萄糖乙紫黑乳糖丙粉红葡萄糖丁粉红乳糖细菌的药敏试验P20（菌液）甲黄色平板+青、链、庆纸片乙白色平板+青、链、庆纸片丙紫黑平板+青、链、庆纸片丁粉红平板+青、链、庆纸片血浆凝固酶试验P17兔血浆15ul+黄色,白色半固体接种法P11甲紫黑，乙紫黑，丙粉红，丁粉红。,思考题,细菌生化反应在感染性疾病诊断中有何重要意义?为什么要在发酵管液面上方大约23cm处切割？培养时，微量糖发酵管管口不能朝上，为什么？抗生素敏感性实验有何实际意义?血浆凝固酶试验观察完毕，应将载玻片立即放入消毒缸内，为什么?半固体穿刺接种时，为什么要强调“原路返回”?为保证实验结果的可靠性，你认为上述试验应还设立