分光光度法检测蛋白质含量

生物化学和分子生物学实验，曾季平生物化学和分子生物学系，生物化学和分子生物学实验，实验室规则实验室安全和防护实验室常用玻璃仪器实验，实验室规则5分钟前到达实验室，不准迟到、早退、缺勤，每迟到、早退减去1分钟，每缺勤减去5分钟。 禁止在实验室吃食品，违反者延迟处理。 上课时要穿隔离服，不能穿拖鞋和背带。 否则就禁止进入实验室。 实验期间必须将手机设置在振动中，上课期间紧急连接，打电话后请在走廊处理。 在实验室里要保持安静，不要吵闹或大声说话。 认真预习实验，养成良好的实验习惯(实验中，实验结束后)，实验室安全防护，火灾预防中毒外伤，实验室常用玻璃器具，吸管* (示教)试管烧杯测量仪器，实验试验，实验课成绩，表现平时实验试验原理的实验报告形式结果操作试验分析， 实验报告书采用网上提交、实验报告书采用网上提交的方式，实验报告书的提交时间为本次实验结束后第三天下午12点前提交，逾期不能提交，本次实验报告书为0分。 尽早提交报告书，不要等到截止日期。 系统可能不稳定，无法提交。 将报告直接粘贴到框中。 请不要用附件上传。 文件可能无法打开，可能会影响成绩。 不要互相模仿，发现雷和卷就是0分。 过期不提交报告书的话，不能把报告书发送到老师的邮箱里，发送也没有用。 最终实验报告的成绩只记录系统导出的成绩。 实验1、理论上把握分光光度技术和蛋白质含量测定、分光光度技术基本原理的分光光度计的基本结构实验：利用分光光度技术进行蛋白质含量测定1 .用双脲法进行蛋白质含量测定2 .用courstran结合法进行蛋白质含量测定3 .用紫外分光光度法测定蛋白质含量1 .物质特有的吸收光谱应用：定性、定量优点：灵敏度高、操作简便、快速、分光光度技术(Spectrophotography )；二、工作原理物质对光线有选择性吸收作用。 每种物质都有其特征吸收光谱。 在一定条件下，物质对光的吸收程度与该物质的浓度成正比。 分光光度法中使用的光谱范围： 200 nm10m 200400 nm 400760 nm 76010m紫外光区可见光区红外光区是怎样定性的？ 利用-吸收光谱曲线鉴定化合物，吸收光谱曲线：将波长不同的单色光作为入射光，测定某溶液的吸光度，将波长绘制为横轴，将吸光度绘制为纵轴，得到溶液的吸收光谱曲线。 每种物质都有其特征吸收光谱，可以作为定性分析的依据。 吸光度，1 .朗伯(Lambert )定律的单色光通过光吸收介质时，其光强度随光吸收介质厚度的增加呈指数减少。 按照I1/I0=e-K1l2.比尔(Beer )法则，单色光通过光吸收介质时，其光强度随光吸收介质浓度的增加而指数性地减少。 I1/I0=e-K2CI0:入射光强度； I:的透射光强度l :介质厚度c :介质浓度，如何定量？ Lambert-Beer定律*，3.Lambert-Beer定律*，通过有单色光的溶液时，光被溶液吸收，吸收量与溶液的浓度和溶液的厚度成正比。 A=CLA :吸光度c :溶液浓度l :液层厚度:即摩尔吸光系数是指在一定波长下溶液的浓度为1mol/L、光路长度为1cm时的吸光度值。 *波长、溶液、温度确定时，由物质的特性决定。 在*(1)标准管法(标准比较法)的实际测定过程中，采用已知浓度的测定物与测定管同样地进行显色处理，读取吸光度，根据上式进行计算。a标准=标准c标准l标准a样品=样品c样品l样品a :吸光度:摩尔吸光度c :溶液浓度l :液层厚： 由于标准液和样品液中的溶质是相同的物质，样品=标准是标准液和测定液的比色杯径相同的l样品=L标准，因此上式可以写为a标准/A样品=标准c标准l样品/样品c样品=A样品/A标准c标准，2 )标准曲线法可以写为标准曲线以溶液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，在方格坐标纸上制作标准曲线。 取得样品浓度：根据测定的样品吸光度值从标准曲线取得测定物的浓度。 另外，标准曲线的使用注意事项是，标准曲线的范围为测定浓度的一半到两倍之间。 吸光度在0.051.0范围内. 创建的标准曲线仅在短期内使用。 标准曲线的制作和测量管的测量请使用相同的设备进行，以免产生误差。 5 .应用中注意的问题* * * Lambertbeerslaw偏差：此规律只适用于一定的浓度范围，a应介于0.051.0之间的选择波长：最大吸收波长a .灵敏度b .避免杂质干扰参照溶液(空白管) :消除背景效应的测定空白管：在测定中，比色皿本身和溶剂也产生一定的光吸收，因此设置了测定溶质以外的成分完全相同的空白管。 测量时，首先用空白管调整光路，使设备归零，消除比色盘本身对光的吸收，消除非测量物对光的吸收，测量值是测量对象物对光的吸收。分光光度计(spectrophotometer )、一.基本部件、二、分光光度计使用顺序(示教)三、使用时的注意事项*1.波长选择。 2 .机器的预热。 3 .不进行测量时，请将样品室的盖子置于打开状态。 不那样的话，光电管会累的。 4 .不要把变成腐蚀性液体的比色皿放在机器表面。 5 .比色皿的使用注意*因为紫外光不透过玻璃比色皿，所以在紫外光区的测定中使用石英比色皿。 同组使用的比色盘应设置(规格、新旧程度一致)。 比色盘有两个光面和两个毛面，光学面对光路，没有污损。 不那样的话会引起光吸收的增加。 放在比色盘里的溶液不能太少，也不能太多。 一般加入的液体约占容积的2/3。 腐蚀性溶液不能长期放在比色皿中。 每次使用时，请立即清空或用抽吸泵吸取后，用水洗净比色盘34次。 *在此次实验中，乌苏亮蓝将玻璃色盘子着色，浸入酒精进行清洗。 蛋白质定量分析实验，实验单缩脲法测定蛋白质含量(p50 )，实验三考质子布莱顿结合法测定蛋白质含量(p52 )，实验四紫外分光光度法测定蛋白质含量(p53 )，实验单缩脲法测定蛋白质含量【基本原理】蛋白质分子中多肽在一定的浓度范围内，颜色浓淡与蛋白质浓度成比例，因此可以用比色法测定蛋白质的含量。 由于含有2个以上肽键的物质会发生这种反应，氨基酸没有这种反应。 缩二脲法的灵敏度为1-20mg。 【操作顺序】，(1)标准曲线的制作1 .取6根试管，编号按照下表进行操作，2 .混合后，在37的水浴中放置15分钟，在540nm波长下比较颜色，在第6管中调整为零，测定各管的吸光度值。 以各管的吸光度值为纵坐标、蛋白质浓度为横坐标绘制曲线。 (二)样品的测定：样品0.1ml，生理盐水0.9m1，再加入缩二脲试剂4m1，在37的水浴中放置15分钟，测定其吸光度，从吸光度值调查标准曲线，计算样品中的蛋白质浓度。 注意：双缩二脲法灵敏度为1-20mg，取蛋白标准液时要注意浓度。实验时样品管可与标准管同时处理，“基本原理”客运行G-250存在两种不同的颜色形式，红色和蓝色。 蛋白质与范德华力结合，与蛋白质结合的颜色由红变为蓝，最大吸收峰从465nm变为595nm，通过测定595nm处的光吸收增加量可知结合蛋白质的量。 优点：灵敏度高，1-5g； 测量速度快的干扰物质很少。 实验三考质量布莱顿结合法测定蛋白质含量，1 .取3根试管，编号为下表操作试剂(ml )空白标准生理盐水0.1蛋白标准液(50ug/ml)0.1样品0.1考斯布莱顿试剂5.05.05.0，2 .混匀，放置5分钟，波长595nm 【操作步骤】，3.a标本/A标准50(g/ml)=计算样品中蛋白质含量(g/ml )的注意：蛋白质标准液浓度50g/ml，实验四紫外分光光度法测定蛋白质含量，【基本原理】蛋白质分子中含有酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸，因此蛋白质具有吸收紫外光的性质，吸收皮由于各种蛋白质中含有的芳香族氨基酸的量很少，因此在该波长范围内，吸收峰的光密度值与其浓度成正比，可以进行定量测定。 灵敏度： 50-100g、【操作步骤】、(1)制作标准曲线1 .取6根试管，标注编号，如下表所示操作。 试剂(ml)123456标准蛋白质溶液0.51.01.52.02.50混合生理盐水3.53.02.52.01.54.0放入石英杯中，使用紫外分光光度计，在波长280nm下测定各管的光密度，以各管的光密度值为纵坐标，以蛋白质浓度为横坐标绘制标准曲线图(二)标本测定：取标本1.0ml，加入生理盐水3.0ml，测定a80标准线上浓度。颈椎脱位处死小鼠，切开腹部，取出肝组织，放入平皿用PBS冲洗。 取100mg肝组织，破碎，转移至均化器。 将1mL预