微生物的利用、酶的应用复习

微生物的利用、酶的应用,-2-,考点一大肠杆菌的培养和分离,液体,灭菌,培养,-3-,涂布,倒置,-4-,1.大肠杆菌革兰氏阴性、兼性厌氧的肠道杆菌,在肠道中一般对人无害,属原核生物,是基因工程中被广泛采用的工具。2.培养基(1)分类:按照物理性质可分为液体培养基、半固体培养基和固体培养基。在液体培养基中加入凝固剂琼脂后,制成琼脂固体培养基。微生物在固体培养基表面生长,可以形成肉眼可见的菌落。(2)成分:一般都含有水、碳源、氮源、无机盐和生长因子五类营养物质。还需满足不同微生物生长对pH、特殊营养物质及氧气的要求。(3)制作牛肉膏蛋白胨固体培养基。制作牛肉膏蛋白胨固体培养基的方法步骤:计算称量溶化、调pH灭菌倒平板。,-5-,3.无菌技术(1)获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵。应根据实际情况进行消毒和灭菌。(2)消毒与灭菌的区别消毒是指使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物(不包括芽孢和孢子)。消毒方法有煮沸消毒法,还有化学药剂(如酒精、氯气、石炭酸等)消毒、紫外线消毒等。灭菌则是指使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物,包括芽孢和孢子。灭菌方法有灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌等。,-6-,(3)无菌操作要求各种器皿必须是无菌的。各种培养基必须是无菌的。菌转移操作的过程必须是无菌的。(4)灭菌方法高压蒸汽灭菌法:即用高压蒸汽灭菌锅在121 (1 kg/cm2压力)下灭菌15 min。干热灭菌法:用干热灭菌箱对耐热器具在160 维持 2 h 或170 维持1 h灭菌。酒精灯灼烧法:如接种环在酒精灯火焰上灼烧灭菌。酒精灯火焰上方无菌区,可使菌转移过程在无菌条件下完成。紫外灯照射灭菌:用紫外灯照射灭菌30 min。,-7-,(5)消毒方法。煮沸消毒法:100 煮沸56 min可以杀死微生物的营养细胞和一部分芽孢,可用于培养器皿的消毒。巴氏消毒法:80 中15 min或7075 中30 min,实际生产中常用于鲜奶的消毒。乙醇消毒法:70%乙醇杀菌能力最强,常用于实验时操作者手臂的消毒。(6)含抗生素的牛奶不能发酵为酸奶的原因:牛奶发酵成酸奶是利用乳酸菌发酵来完成的。乳酸菌属于细菌,抗生素有抑制甚至杀死细菌的作用。,-8-,4.细菌的培养与分离(1)细菌培养用LB液体培养基扩大培养大肠杆菌,细菌以分裂的方式繁殖,分裂速度很快,条件适宜时,约20 min可分裂一次。如要将已有细菌培养物转移到新的培养基,一般用接种环转移带菌的培养物。,-9-,(2)细菌分离划线分离法:用接种环在琼脂固体培养基表面连续划线操作,将聚集的菌种逐步分散到培养基表面。培养1020 h后,可以得到由一个细菌繁殖而来的肉眼可见的细胞群,即菌落。稀释涂布分离法:将菌液先进行一系列的梯度稀释,然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面,然后进行培养。两种方法比较:划线分离,方法简单;涂布分离,单菌落更易分开,但操作复杂些。两种方法都能将混杂在一起的微生物分离成单个细胞,并能在培养基表面形成单个菌落,以便分离和纯化菌种。,-10-,5.大肠杆菌的培养和分离实验(1)实验目的进行大肠杆菌的扩增,利用LB液体培养基进行细菌培养的操作。进行大肠杆菌的分离,用LB固体培养基进行细菌的划线培养。说明大肠杆菌培养的条件和操作要求的原理。(2)实验步骤灭菌:用高压蒸汽灭菌锅在121 (1 kg/cm2压力)下对LB液体培养基、LB固体培养基和培养皿灭菌15 min。倒平板:待冷却至60 左右时,将三角瓶中的培养基在超净台上分装至几个培养皿中,制成固体培养基。扩大培养:将大肠杆菌用接种环在无菌操作条件下接种至三角瓶中的液体培养基中,37 摇床振荡培养12 h,完成大肠杆菌培养。,-11-,划线分离:从前一步培养得到的菌液中获取菌种,用接种环以划线法接种至第二步制得的固体平面培养基中,在37 恒温箱中培养1224 h后观察菌落。菌种保存:在无菌条件下将单菌落用接种环取出,再用划线法接种在斜面上,37 培养24 h后,置于4 冰箱内保存。实验结束后,为防止细菌污染,需要对培养物进行灭菌处理。(3)实验结果及相应结论若观察到划线的末端出现不连续的单个菌落,表明菌已被分离。,-12-,例题为了调查某河流的水质状况,某研究小组测定了该河流水样中的细菌含量,并进行了细菌分离等工作。回答下列问题。(1)该小组采用稀释涂布平板法检测水样中的细菌含量。在涂布接种前,随机取若干灭菌后的空白平板先行培养了一段时间,这样做的目的是;然后,将1 mL水样稀释100倍,在3个平板上用涂布法分别接入0.1 mL稀释液;经适当培养后,3个平板上的菌落数分别为39、38和37。据此可得出每升水样中的活菌数为。(2)该小组采用平板划线法分离水样中的细菌。操作时,接种环通过灭菌,在第二次及以后的划线时,总是从上一次划线的末端开始划线。这样做的目的是。,检测培养基平板灭菌是否合格,3.8107,灼烧,将聚集的菌体逐步稀释以便获得单个菌落,-13-,(3)示意图A和B中,表示的是用稀释涂布平板法接种培养后得到的结果。(4)该小组将得到的菌株接种到液体培养基中并混匀,一部分进行静置培养,另一部分进行振荡培养。结果发现:振荡培养的细菌比静置培养的细菌生长速度快。分析其原因是:振荡培养能提高培养液中的含量,同时可使菌体与培养液充分接触,提高的利用率。,B,溶解氧,营养物质,-14-,下面是肺炎双球菌离体转化实验的主要步骤:(1)实验用的器具必须是无菌的,常用法灭菌。用此法对培养基灭菌时,常将培养基装在(器皿)中进行。(2)实验操作需在超净工作台上进行。工作台上,实验前一段时间需打开,实验中需关闭的是。A.酒精灯B.照明灯C.过滤风D.紫外灯,高压蒸汽灭菌,三角瓶,D,-15-,(3)平面培养基与悬浮培养所用的培养基相比,应增加 成分。(4)常用涂布法给平面培养基接种。下列叙述错误的是。A.接种的目的是使细菌相互分离B.接种需过滤除去杂菌后进行C.接种工具需灼烧后使用D.接种需在酒精灯火焰旁进行(5)在37 恒温箱中培养时,培养皿需,主要目的是避免水滴影响的形成。(6)培养后,如果观察到菌落重叠,则在涂布法接种之前需进行操作。,凝固剂(琼脂),B,倒置,单菌落,稀释菌液,-16-,考点二分离以尿素为氮源的微生物,细菌悬液,菌落,-17-,1.土样的获得:在有哺乳动物排泄物的地方取得。2.实验步骤,-18-,3.微生物两种常用分离方法比较,-19-,例题从土壤中分离以尿素为氮源的细菌,实验过程如图所示:(1)图中物质A为,若要统计每克土壤样品中以尿素为氮源的细菌的活菌数目,宜采用法接种到尿素培养基上,对照组配制的培养基为 培养基,若用同浓度的土壤稀释液接种,实验组培养皿中菌 (填“大于”“等于”或“小于”)对照组。在能利用尿素的细菌菌落周围,有红色环带出现的原因是。(2)下列对尿素溶液进行灭菌的最适方法是灭菌。A.高压蒸汽B.紫外灯照射C.70%酒精浸泡 D.过滤,无菌水,涂布分离,LB全营养,小于,能利用尿素的细菌产生的脲酶将培养基中的尿素分解,产生的氨使指示剂呈红色,D,-20-,(3)下列培养基中,能分离出分解尿素的细菌的是 。A.葡萄糖、NaCl、K2HPO4、酚红、琼脂糖、水B.葡萄糖、NaCl、K2HPO4、酚红、琼脂糖、水、尿素C.NaCl、琼脂糖、水、蛋白胨、酵母提取物、尿素D.葡萄糖、NaCl、K2HPO4、酚红、琼脂糖、水、蛋白胨、酵母提取物(4)欲将分离得到的以尿素为氮源的细菌进行扩大培养,应使用LB培养基。,B,液体,-21-,幽门螺杆菌(Hp)感染是急慢性胃炎和消化性溃疡的主要致病因素。在患者体内采集样本并制成菌液后,进行分离培养。实验基本步骤如下:请回答下列问题。(1)在配制培养基时,要加入尿素和酚红指示剂,这是因为Hp含有,它能以尿素作为氮源;若有Hp,则菌落周围会出现色环带。(2)步骤X表示。在无菌条件下操作时,先将菌液稀释,然后将菌液到培养基平面上。菌液稀释的目的是获得菌落。,脲酶,红,接种,涂布,单,-22-,(3)在培养时,需将培养皿倒置并放在中。若不倒置培养,将导致。(4)临床上用 14C呼气试验检测人体是否感染Hp,其基本原理是Hp能将 14C标记的分解为NH3和 14CO2。,恒温培养箱,无法形成单菌落,尿素,-23-,考点三果汁中的果胶和果胶酶,半乳糖醛酸甲酯,甲酯,黑曲,澄清,-24-,1.果胶(1)化学组成:半乳糖醛酸和半乳糖醛酸甲酯。(2)作用:是植物细胞壁的主要成分之一。将植物细胞粘合在一起。去除果胶,会使植物组织变得松散。如山楂果实中果胶含量最多,煮沸后的山楂泥可制成山楂糕。(3)特性:不溶于乙醇,这是鉴别果胶的简易方法。2.果胶酶(1)化学成分:蛋白质。(2)作用:果胶酶和果胶甲酯酶可把果胶分解成可溶性的半乳糖醛酸,使浑浊的果汁变得澄清。(3)来源:常用黑曲霉、苹果青霉等来生产果胶酶。,-25-,3.酶活性酶活性大小可用在一定条件下,酶所催化的某一化学反应速率来表示。反应速率可用单位时间内反应物的减少量或产物的生成量来表示。影响酶活性的因素有温度、酸碱度及酶抑制剂等。4.果汁中果胶和果胶酶实验(1)实验目的探究制作果汁的最佳条件。检测果胶酶活性。(2)实验步骤、结果、结论利用果胶酶制作果汁的实验步骤。第一步,制备水果匀浆:用小刀除去苹果或山楂果实中带种子的部分,切成块后,放入匀浆机中,再加入少量水制成匀浆。,-26-,第二步,设置对照组:取A、B两烧杯,各加入5 g匀浆液,A加入10 mL黑曲霉的提取液或果胶酶溶液,B加入10 mL 水,间歇搅拌2030 min。实验结果:A组澄清度高,B组澄清度低。实验结论:果胶酶能水解果胶,使浑浊的果汁变澄清。探究利用果胶酶制作果汁的最佳条件的实验步骤(紧接上面第二步)。第三步,取4支试管,编号14号。将A烧杯中混合物分别放入1号和2号试管中,将B烧杯中混合物分别放入3号和4号试管中,每支均放入4 mL。第四步,将1号和3号试管放在沸水浴或酒精灯上加热,2号和4号试管不加热,观察。第五步,再向上述4支试管中各加入95%的乙醇4 mL,观察。,果汁中的果胶和果胶酶,1和4没法比较，是不同的变量,最澄清,最浑浊,？,？,加热的目的？,我们看到的浑浊不是果胶而是果渣，果胶是透明的。由于果胶的存在溶液粘度较高，果渣不容易析出，因此果汁会浑浊。 加果胶酶是降解果胶，加酒精是析出果胶，果胶少了溶液粘度下降，果渣析出，果汁澄清。 加热直接使溶液的粘度降低，使果汁澄清。,-29-,果胶是植物细胞细胞壁及胞间层的主要组成成分之一。果胶酶能够水解果胶,瓦解植物细胞的细胞壁及胞间层。在果汁生产中应用果胶酶可以提高出汁率和澄清度。请你帮助完成以下有关果胶酶和果汁生产的实验课题。实验用具和材料:磨浆机、烧杯、试管、量筒、刀片、玻璃棒、漏斗、纱布等;苹果、质量分数为2%的果胶酶溶液、蒸馏水等。.验证果胶酶在果汁生产中的作用,实验方法及步骤:(1)将苹果洗净去皮,用磨浆机制成苹果泥,加入适量蒸馏水备用。(2)取两个100 mL洁净的烧杯,编号为1、2号,按相应程序进行操作,请把表中未填写的内容填上。,-30-,(3)取出两个烧杯,同时进行过滤。一定时间后,观察(或比较) 和,并记录结果。(4)最可能得到的实验结果及结论: 。,注入果胶酶溶液,滤出的果汁体积,果汁澄清度,相同时间内,1号烧杯中滤出果汁体积比2号烧杯多,且澄清度高,说明果胶酶对果胶的水解有催化作用,-31-,.探究果胶酶催化果胶水解的最适pH本课题实验步骤中,在进行果胶酶溶液和苹果泥的混合并调整pH时有下面两种操作:方法一:将试管中的果胶酶溶液和烧杯中的苹果泥相混合,再把混合液的pH分别调至4、5、6、7、8、9、10。方法二:将试管中的果胶酶溶液和烧杯中的苹果泥的pH分别调至4、5、6、7、8、9、10,再把pH相等的果胶酶溶液和苹果泥相混合。,-32-,(1)请问上述哪一种操作更科学:。并说明理由:。(2)如果用曲线图的方式记录实验结果,在现有的条件下,当横坐标表示pH,纵坐标表示,实验的操作和记录是比较切实可行的。根据你对酶特性的了解,在图中选择一个最可能是实验结果的曲线图:。,方法二,方法二的操作能确保酶的反应环境从一开始便达到实验的预设pH,果汁体积,甲,-33-,工业生产果汁时,常常利用果胶酶破除果肉细胞壁以提高出汁率。为研究温度对果胶酶活性的影响,某学生设计了如下实验:将果胶酶与苹果泥分装于不同试管,在10 水浴中恒温处理10 min(如图A)。将步骤处理后的果胶酶和苹果泥混合,再次在10 水浴中恒温处理10 min(如图B)。将步骤处理后的混合物过滤,收集滤液,测量果汁量(如图C)。,-34-,在不同温度条件下重复以上实验步骤,并记录果汁量,结果如下表:根据上述实验,请分析并回答下列问题。(1)果胶酶能破除细胞壁,是因为果胶酶可以促进细胞壁中果胶的水解,产物是。(2)实验结果表明,当温度为左右时,果汁量最多,此时果胶酶的活性。(3)为什么该实验能够通过测定滤出的苹果汁的体积大小来判断果胶酶活性的高低?。,半乳糖醛酸,40 ,最高,果胶酶将果胶分解,破坏了植物细胞的细胞壁和胞间层,使榨取果汁更容易,而且大量的果胶被分解也会增加果汁的量。因此苹果汁的体积大小反映了果胶酶催化分解果胶的能力,-35-,(4)果胶酶作用于一定量的某种物质(底物),保持温度、pH在最适值,生成物量与反应时间的关系如下图:在35 min后曲线变成水平是因为。若增加果胶酶浓度,其他条件不变,请在原图上画出生成物量变化的示意曲线。,底物消耗完毕,-36-,-37-,考点四-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测,吸附法,KI-I2,-38-,1.固定化酶(1)概念:将水溶性的酶用物理或化学的方法固定在某种介质上,使之成为不溶于水而又有酶活性的制剂。(2)将酶改造为固定化酶的原因。由于酶在水溶液中很不稳定,且不利于工业化使用,所以要将酶改造成固定化酶。(3)酶固定化的方法吸附法、共价偶联法、交联法和包埋法等。(4)固定化酶作用的机理将酶吸附在惰性载体(如石英砂)上,制成固定化酶,并装柱,当底物经过固定化酶柱时,在酶的作用下转变成产物。,-39-,2.实验原理淀粉(遇碘显蓝色) 糊精(遇碘显红色) 麦芽糖(遇碘不显色) 葡萄糖3.-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用检测的实验(1)实验目的制备固定化-淀粉酶。进行淀粉水解的测定。,-40-,(2)实验材料的制备-淀粉酶的固定化。在烧杯中将5 mg -淀粉酶溶于4 mL蒸馏水中(由于酶不纯,可能有些不溶物)。再加入5 g石英砂,不时搅拌,30 min后装入1支下端接有气门芯并用夹子封住的注射器中(石英砂体积约4 mL)。用10倍体积蒸馏水洗涤此注射器,以除去未吸附的游离淀粉酶,流速为1 mL/min。可溶性淀粉溶液:取50 mg可溶性淀粉溶于100 mL热水中,搅拌均匀。5 mmol/L KI-I2溶液:称取0.127 g碘和0.83 g碘化钾,加蒸馏水100 mL,完全溶解后装入滴瓶中。,-41-,(3)实验步骤淀粉溶液流经固定化酶柱:将灌注了固定化酶的注射器放在注射器架上,用滴管加淀粉溶液,使该溶液以0.3 mL/min的流速过柱。接取流出物:待从固定化酶柱中流出5 mL后接收 0.5 mL 流出液。流出物鉴定:向流出液中加入12滴KI-I2溶液,观察颜色。用水稀释1倍后再观察颜色。洗涤:保存固定化酶柱。实验后,用10倍柱体积的蒸馏水洗涤此柱,放置在4 冰箱中保存。几天后取出冰箱中的该固定化酶柱,重复上述实验,观察结果。,-42-,(4)实验结果(5)实验结论固定化-淀粉酶能将淀粉水解成糊精。,-43-,下面是关于固定化酶和细菌培养实验的问题。请回答下列问题。(1)某兴趣小组欲利用固定化酶进行酶解淀粉的实验,分组见下表。将吸附了-淀粉酶的石英砂装入柱中后,需用蒸馏水充分洗涤固定化酶柱,以除去。按上表分组,将配制好的淀粉溶液加入到固定化酶柱中,然后取一定量的流出液进行KI-I2检测。若流出液呈红色,表明有生成;若各组呈现的颜色有显著差异,则流出液中淀粉水解产物浓度最高的是组。,未吸附的-淀粉酶,糊精,-44-,(2)下列关于上述固定化酶实验的叙述,错误的是。A.固定化酶柱长度和淀粉溶液流速决定了酶柱中酶的含量B.淀粉溶液流速过快会导致流出液中含有淀粉C.各组实验所用的淀粉溶液浓度应相同D.淀粉溶液的pH对实验结果有影响(3)现