分子生物学技术.ppt

一、分子生物学概念（一）基本概念（二）基因的碱基顺序与蛋白质的氨基酸顺序（三）基因的结构（四）基因的表达与调控,（一）基本概念基因：是编码蛋白质或RNA分子遗传信息的基本遗传单位。从化学角度观察，基因则是一段具有特定功能和结构的连续的脱氧核糖核酸序列，是构成巨大遗传单位染色体的重要组成部分。顺反子：顺反子和基因这两个术语是互相通用的。一般来说，一个顺反子既是一个基因，大约含有1500个核苷酸对，是由一群突变单位和重组单位组成的线性结构。,因此，顺反子概念表明：基因不是最小单位，它仍然是可分的；并非所有的DNA序列都是基因，而只有其中某一特定的多核苷酸区段才是基因的编码区。每一个顺反子就是一段核苷酸序列，或者是一个基因的DNA或RNA单元，它编码一种完整的多肽链。顺反子是功能单位，它是由许多可以突变的位点组成的，而这些位点之间又可以发生交换。多体蛋白质（multimericproteins）：由数个亚基组成的蛋白质。,同型多体蛋白质：在多体蛋白质中，如果所有的亚基都是同样的，这种蛋白质就属于同型多体（homomultimer）蛋白质，由一种基因编码。异型多体（heteromultimer）蛋白质：亚基各不相同的蛋白质，由多种基因编码。如血红蛋白。,（二）基因的碱基顺序与蛋白质的氨基酸顺序1.中心法则（centraldogma）：既遗传信息是从DNA流向RNA，再由RNA流向蛋白质而遗传信息从DNA直接到蛋白质的传递，只是一种理论上的可能性，迄今尚未得到证实。,2.密码子：每3个碱基编码一种氨基酸，就会编码出64种（43=64）不同的氨基酸。蛋白质分子是由20种不同的氨基酸构成的，因此，1种氨基酸可有几个不同的密码子，既3个碱基甚至更多的碱基编码一种氨基酸是必要的。遗传密码是否重叠？研究证实：遗传密码是不重叠的。三联体之间是否存在着“逗号”？研究证实：碱基的阅读是从一个固定的起点按序进行的，不存在有什么“逗号”的问题。QABCQDEFQGHIQJKLQ,（三）基因的结构基因的编码区（即转录区）是连续不断的序列，包括一个起始密码子ATG和一个终止密码子TAA。编码区的两侧是转录而不转译的侧翼序列区，其中5非转译区简称5UTR，含有一个核糖体结合位点及一个转录起始信号；3非转译区简称3UTR含有一个转录终止信号。无论是真核的基因还是原核的基因，都可划分成编码区和非编码区两个基本组成部分。编码区含有大量的可以被细胞质中转译机器阅读的遗传密码，包括起始密码子（通,常是AUG）和终止密码子（UAA，UAG或UGA）。非编码区结构中的5末端非转译区（5UTR）和3末端非转译区（3UTR），对于基因遗传信息的表述是必要的，但它们都不会被转译成多肽序列。真核基因与原核基因的区别：事实上，真核生物的基因都是以单顺反子的形式存在，因此它们编码的也都是单基因产物。而大肠杆菌类原核生物往往是多顺反子，它转录的是一种大分子量的mRNA，可同时编码两种甚至数种的基因产物。,（四）基因的表达与调控结构基因(structuralgene)：编码细胞成份，如代谢酶类、转运蛋白质和细胞骨架成份等的基因。调节基因（regulatorygene)：编码控制其他基因表达的RNA或蛋白质产物的基因。操纵基因（operator):指接受来自调节基因合成的调节蛋白的作用，使结构基因转录活性得以抑制的特定的DNA区段，也称为控制单元。,储藏在基因中的遗传信息分转录和转译两步进行表达，这种遗传信息从DNA到RNA再到蛋白质的流向，在所有的细胞类型中都是受到高度调节的，同时在有些情况下也是严格协同的。基因表达的此种严格调控机理，保证细胞不会浪费能量用于合成它所不需要的基因产物。从基因研究上，操纵子概念比顺反子又进了一步。即基因不但在结构上是可分的，而且在功能上也是有分工的。同时，有的基因控制蛋白质产物的合成，而有的基因并没有直接的产物。操纵子模型,二、核酸探测技术（一）指纹图谱（二）核酸分子杂交,（一）、指纹图谱指纹图谱：即核酸酶切图谱，对生物的蛋白质、DNA和RNA进行分析的电泳图、杂交放射性自显影图等。在微生物研究上，主要是用限制性内切酶（ERA）对病毒、细菌DNA进行酶切分析的图谱。原理：在微生物（细菌）细胞中有1种限制性内切酶类（II，称为RE），能特异性的识别和切割DNA链上特定的一段DNA片段，这类酶广泛应用于基因工程的各个方面。ERA就是用RE消化病毒或细菌的DNA或质粒，将消化物于琼脂凝胶中电泳分离，经,溴化乙锭（EB）染色，然后分析DNA酶切片段的数目、迁移率等分析微生物的变异现象、鉴定毒株、分型及了解基因结构和进行流行病学研究等等。方法：1.DNA抽提2.DNA酶切3.电泳4.染色5.观察、照相6.分析7.酶切图谱,核酸探针技术前言(一)核酸探针的种类(二)核酸探针的制备(三)核酸杂交(四)核酸探针技术在动物检疫中的应用,前言化学及生物学意义上的探针(probe)，是指与特定的靶分子发生特异性相互作用，并可被特殊的方法探知的分子。抗体-抗原、生物素-抗生物素蛋白、生长因子-受体的相互作用都可以看作是探针与靶分子的相互作用。核酸探针技术原理是碱基配对。互补的两条核酸单链通过退火形成双链，这一过程称为核酸杂交。（基本过程是：加热变性,降温复性。）核酸探针是指带有标记物的已知序列的核酸片段，它能和与其互补的核酸序列杂交，形成双链，所以可用于待测核酸样品中特定基因序列的检测。每一种病原体都具有独特的核酸片段，通过分离和标记这些片段就可制备出探针，用于疾病的诊断等研究。,(一)核酸探针的种类1.按来源及性质划分可将核酸探针分为基因组DNA探针、cDNA探针、RNA探针和人工合成的寡核苷酸探针等几类。作为诊断试剂，较常使用的是基因组DNA探针和cDNA探针。其中，前者应用最为广泛，它的制备可通过酶切或聚合酶链反应(PCR)从基因组中获得特异的DNA后将其克隆到质粒或噬菌体载体中，随着质粒的复制或噬菌体的增殖而获得大量高纯度的DNA探针。,将RNA进行反转录，所获得的产物即为cDNA。cDNA探针适用于RNA病毒的检测。cDNA探针序列也可克隆到质粒或噬菌体中，以便大量制备。将信息RNA(mRNA)标记也可作为核酸分子杂交的探针。但由于来源极不方便，且RNA极易被环境中大量存在的核酸酶所降解，操作不便，因此应用较少。用人工合成的寡聚核苷酸片段做为核酸杂交探针应用十分广泛，可根据需要随心所欲合成相应的序列，可合成仅有几十个bp的探针序列，对于检测点突变和小段,碱基的缺失或插入尤为适用2.按标记物划分有放射性标记探针和非放射性标记探针两大类。放射性标记探针用放射性同位素做为标记物。放射性同位素是最早使用，也是目前应用最广泛的探针标记物。常用的同位素有32P、3H、35S。其中，以32P应用最普遍。放射性标记的优点是灵敏度高，可以检测到Pg级；缺点是易造成放射性污染，同位素半衰期短、不稳定、成本高等。因此，放射性标记的探针不能实现商品化。目前，许多实验室都致力于发展非放射性标记的探针。,目前应用较多的非放射性标记物是生物素(Biotin)和地高辛(digoxigenin)。二者都是半抗原。生物素是一种小分子水溶性维生素，对亲和素有独特的亲和力，两者能形成稳定的复合物，通过连接在亲和素或抗生物素蛋白上的显色物质(如酶、荧光素等)进行检测。地高辛是一种类固醇半抗原分子，可利用其抗体进行免疫检测，原理类似于生物素的检测。地高辛标记核酸探针的检测灵敏度可与放射性同位素标记的相当，而特异性优于生物素标记，其应用日趋广泛。,（二）核酸探针的制备1.DNA探针制备（1）以病原细胞核或病毒中提取的特异性DNA，用理化学方法将其纯化，然后再用限制性核酸酶将DNA切割成若干片段，电泳回收目的DNA；（2）酶促反应合成法，即从病原中提取mRNA，在反转录酶作用下合成互补结构的DNA（cDNA）；（3）化学合成法，以单核苷酸为原料，人工合成DNA的某一片段。,2.RNA探针全基因RNA探针可用RNA病毒的基因标记即可；由DNA转录出探针RNA，可由RNA聚合酶获得大量高纯度的RNA，其灵敏度比DNA探针高出10多倍。,(三)核酸杂交杂交技术有固相杂交和液相杂交之分。固相杂交技术目前较为常用，先将待测核酸结合到一定的固相支持物上，再与液相中的标记探针进行杂交。固相支持物常用硝酸纤维素膜(nitrocellulosefiltermembrane，简称NC膜)或尼龙膜(nylonmembrane)。固相杂交包括膜上印迹杂交和原位杂交。前者包括三个基本过程：第一，通过印迹技术将核酸片段转移到固相支持物上；第二，用标记探针与支持物上的核酸片段进行杂交；第三，杂交信号的检测。,用探针对细胞或组织切片中的核酸杂交并进行检测的方法称之为核酸原位杂交。某特点是靶分子固定在细胞中，细胞固定在载玻片上，以固定的细胞代替纯化的核酸，然后将载玻片浸入溶有探针的溶液里，探针进入组织细胞与靶分子杂交，而靶分子仍固定在细胞内。例如。可用特异性的细菌、病毒的核酸做为探针对组织、细胞进行原位杂交，以确定有无该病原体的感染等。原位杂交不需从组织中提取核酸，对于组织中含量极低的靶序列有极高的敏感性，在临床应用上有独特的意义。,近年来液相杂交技术有所发展。液相杂交与固相杂交的主要区别是不用纯化或固定的靶分子，探针与靶序列直接在溶液里作用。液相杂交步骤有所简化，杂交速度有所提高，增加了特异性和敏感性，但与临床诊断所要求的特异性和敏感性还有一定的距离。各种杂交技术中，膜上印迹杂交技术应用最为广泛，它由以下三个基本过程组成。1.核酸印迹技术(1)斑点印迹(Dot-blot)将待测核酸样品变性后直接点样在膜上，称之为斑点印迹。,为使核酸牢固结合在膜上，通常还将点样后的膜进行80真空烘烤2h。应用斑点印迹技术，可在一张膜上同时进行多个样品的检测，操作简便、快速，在临床诊断中应用较广。适合进行特定基因的定性及定量研究，但不能鉴定所测基因的分子量。(2)Southern印迹(Southernblot)这是指将DNA片段经琼脂糖凝胶电泳分离后转移到固相支持物上的过程。常规处理如下，先用限制性内切酶对DNA样品进行酶切处理，经琼脂糖凝胶电泳将,得DNA片段按分子量大小分离，接着对凝胶进行变性处理，使双链DNA解离成单链，并将其转移到NC膜或其它固相支持物上，转移后各DNA片段的相对位置保持不变。用探针与经Southern印迹处理的DNA样品杂交，可鉴定待测DNA的大小、进行克隆基因的酶切图谱分析、基因组基因的定性及定量分析、基因突变分析及限制性片段长度多态性分析(RFLP)等。(3)Northern印迹(Northernblot)Northern印迹是指将RNA片段变性及电泳分离后，转移到固相支持物上的过程。RNA样品经,Northern印迹后进行杂交反应可鉴定其中特异mRNA分子的量与大小。Northern印迹的方法与Southern印迹基本相同，可参照进行。但RNA的变性方法与DNA不同。DNA样品可先通过凝胶电泳进行分离，再用碱处理凝胶使DNA变性。而RNA不能用碱变性,因为碱会导致RNA水解。因此，在Northern印迹前，须进行RNA变性电泳，在电泳过程中使RNA解离形成单链分布在凝胶上，再进行印迹转移。RNA变性电泳的原理，是用一定剂量的乙二醛-二甲基亚矾，或甲醛和甲基氢氧化汞等处理,RNA样品和凝胶，使双链RNA在电泳过程中变性而完全解离形成单链。2.杂交反应的基本过程杂交反应包括预杂交、杂交和漂洗几步操作。预杂交的目的是用非特异性DNA分子(鲑精DNA或小牛胸腺DNA)及其它高分子化合物(Denharts溶液)将待测核酸分子中的非特异性位点封闭，以避免这些位点与探针的非特异性结合。杂交反应是使单链核酸探针与固定在膜上的待测核酸单链在一定温,度和条件下进行复性反应的过程。杂交反应结束后，应进行洗膜处理以洗去非特异性杂交以及未杂交的标记探针，以避免干扰特异性杂交信号的检测。膜洗净后,将继续进行杂交信号的检测。,(四)核酸探针技术在动物检疫中的应用核酸探针技术是目前分子生物学中应用最广泛的技术之一，是定性或定量检测特异RNA或DNA序列的有力工具。核酸探针可用以检测任何特定病原微生物，并能鉴别密切相关的毒(菌)株和寄生虫。目前，各种常见病毒病的诊断和研究都已应用到核酸探针技术，这方面的研究报道数以万计且与日俱增。但该项技术的操作毕竟比常规方法复杂，费用较高，在动物检疫中尚未推广。多在实验室内对病原作深入研究时使用。,三、聚合酶链反应聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction，PCR)由美国Centus公司的KaryMullis发明，于1985年由Saiki等在Science杂志上首次报道，是近年来开发的体外快速扩增DNA的技术。通过PCR可以简便、快速地从微量生物材料中以体外扩增的方式获得大量特定的核酸，并且有很高的灵敏度和特异性，可在动物检疫中用于微量样品的检测。1.PCR的基本原理和过程PCR技术是在模板DNA、引物和4种脱氧单核苷酸存在的,条件下依赖于耐高温的DNA聚合酶的酶促合成反应。PCR以欲扩增的DNA做为模板，以和模板正链和负链末端互补的两种寡聚核苷酸做为引物，经过模板DNA变性、模板引物复性结合、并在DNA聚合酶作用下发生引物链延伸反应来合成新的模板DNA。模板DNA变性、引物结合(退火)、引物延伸合成DNA这三步构成一个PCR循环。每一循环的DNA产物经变性又成为下一个循环的模板DNA。这样，目的的DNA的数量将以2n-2n的形式累积，在2小时内可扩增30(n)个循环，DNA量达原来的上百万倍。,PCR三步反应中，变性反应在高温中进行，目的是通过加热使DNA双链解离形成单链；第二步反应又称退火反应，在较低温度中进行，它使引物与模板上互补的序列形成杂交链而结合上模板；第三步为延伸反应，是在4种dNTP底物和Mg2+存在的条件下，由DNA聚合酶催化以引物为起始点的DNA链的延伸反应。通过高温变性、低温退火和中温延伸3个温度的循环，模板上介于两个引物之间的片段不断得到扩增。对扩增产物可通过凝胶电泳、Southern杂交或DNA序列分析进行检测。PCR扩增示意图,4.PCR衍生技术PCR可扩增双链DNA和单链DNA，并能以RNA为模板，进行反转录PCR以扩增cDNA。经不断发展和完善，已有多种衍生PCR技术。除反转录PCR外，尚有不对称PCR、反向PCR、锚定PCR、多重PCR、着色互补PCR、免疫PCR和套式PCR等。(1)反转录PCR(reversetranscriptionPCR，RTPCR)RTPCR用于扩增RNA样品。在PCR体系中先引入反转录酶，将RNA反转录获得cDNA，再以cDNA做为PCR的模板，加入引物和TaqDNA聚合酶按正常,PCR方式扩增cDNA。这一技术广泛应用于RNA和RNA病毒的检测。(2)锚定PCR(AnchoredPCR)通常进行的PCR试验必须知道欲扩增DNA或RNA片段两侧的序列，并以此为依据设计引物进行PCR。当欲扩增的片段序列未知时，可通过锚定PCR进行扩增。其基本方法是分离细胞总RNA或mRNA并经反转录合成cDNA，通过DNA末端转移酶在cDNA3端加上同源多聚物poly(dG)尾，通过与其互补的锚定引物poly(dC)来保证扩增反应的特异性。,(3)反向PCR(InversePCR)常规PCR是扩增两个已知序列之间的DNA片段，反向PCR则用于扩增位于已知序列两侧的一段未知序列。方法是使含已知序列和未知序列的DNA片段环化，再用限制性内切酶切开已知序列，这样线性化后原位于已知序列两侧的未知序列变为位于已知序列之间，再经常规PCR操作就可大量扩增未知序列。,(4)不对称PCR(AsymmetricPCR)不对称PCR又称单链扩增PCR。一般PCR反应中两种引物的量是相等的，不对称PCR中，两种引物的量相差悬殊，一般为50:1-100:1，这样在生成一定数量的双链产物后，较少的引物就会被用完，大量生成一条单链的DNA，分