细胞生物学128-8-17-第七章：线粒体与过氧化物酶体1-23_2596.pptx

,7.线粒体与过氧化物酶体,细胞的生存需要两个基本的要素构成细胞结构的化学元件和能量。生物从食物中获取能量，根据对氧的需要情况分为两种类型厌氧的，即不需要氧；好氧的，即需要氧的参与。在真核生物中，需氧的能量转化过程与线粒体有关，并且伴随着一系列的化学反应；而在原核生物中，能量转化与细胞质膜相关。,线粒体(mitochondrion)是1850年发现的一种细胞器,1898年命名。是细胞内氧化磷酸化和形成ATP的主要场所(图7-1)。,过氧化物酶体是细胞内另一个需要氧的细胞器,不过过氧化物酶体需要氧不是用于ATP的合成而是用于有毒物质的氧化,对线粒体具有氧调节作用。,图7-1线粒体结构及功能示意图,7.1线粒体的形态结构,线粒体是能够在光学显微镜进行观察的显微结构，它具有渗透性，在低渗溶液中会膨胀，而在高渗溶液中能够收缩。,7.1.1线粒体的发现与功能研究,人们对线粒体的研究有一个多世纪的历史。1850年,德国生物学家RudolphKlliker第一个发现线粒体,并推测这种颗粒是由半透性的膜包被的。,1898年对线粒体进行命名。,1,1900年，LeonorMichaelis用染料Janusgreen对肝细胞进行染色，发现细胞消耗氧之后，线粒体的颜色逐渐消失了，从而提示线粒体具有氧化还原反应的作用。,后又经过几十年的研究,逐步证明了线粒体具有Krebs循环、电子传递、氧化磷酸化的作用,从而证明了线粒体是真核生物进行能量转换的主要部位。,从线粒体的发现和功能鉴定的简史,你有何体会?,7.1.2线粒体的形态结构,线粒体的形态和分布,大小:,线粒体的形状多种多样,一般呈线状(图7-2),也有粒状或短线状。,图7-2电子显微镜观察的蝙蝠胰腺细胞线粒体,数量:,在不同类型的细胞中线粒体的数目相差很大,但在同一类型的细胞中数目相对,稳定。有些细胞中只有一个线粒体,有些则有几十、几百、甚至几千个线粒体。,分布,在多数细胞中,线粒体均匀分布在整个细胞质中,但在某些些细胞中,线粒体的,分布是不均一的。,线粒体较多分布在需要ATP的部位，如肌细胞和精细胞）图7-3)，或较为集,中分布在有较多氧化反应底物的区域,如脂肪滴(图7-4),因为脂肪滴中有许多要被,2,氧化的脂肪。,图7-3肌细胞和精子的尾部聚集较多的线粒体,以提供能量,图7-4线粒体包围着脂肪滴,内有大量要被氧化的脂肪,3,存在方式,线粒体在细胞中并非都是单个存在的，有时可形成由几个线粒体构成的网络结构，有些线粒体具有分支,可以相互交错在一起。如通过相差显微镜检查完整的肝细胞,发现线粒体并非是单个存在的,而是以交织的网络状态存在(图7-5)。,图7-5细胞中线粒体分支交织连接而成的网状二维结构,7.2线粒体的结构与化学组成,7.2.1线粒体的结构,线粒体由内、外两层彼此平行和高度特化的膜包围而成,内外膜都是典型的单位膜。线粒体外膜(outermembrane)起界膜作用,线粒体内膜(innermembrane)向内皱折形成嵴(cristae)，嵴上有一些颗粒朝向线粒体基质,这些颗粒称为F颗粒(F,1,1,particle),似把手状。线粒体的外膜和内膜将线粒体分成两个不同的区室:一个是膜间间隙(intermembranespace),是两个膜之间的空隙;另一个是线粒体基质(matrix),它是由内膜包裹的空间(图7-6)。,图7-6线粒体结构模式图,4,7.2.2线粒体膜通透性,很早就认识到线粒体的膜具有半透性,通过对半透性的研究导致线粒体各组分分离方法的建立。,线粒体通透性研究,将线粒体放在100mM蔗糖溶液中，蔗糖穿过外膜进入线粒体的膜间间隙；然后将线粒体取出测定线粒体内部蔗糖的平均浓度,结果只有50mM,比环境中蔗糖的浓度低。据此推测:线粒体外膜对蔗糖是通透的,而内膜对蔗糖是不通透的(图7-7)。,图7-7线粒体通透性测定,左:将线粒体置于含有100mM的蔗糖溶液中;中:蔗糖穿过线粒体外膜，达到平衡;右:将线粒体从蔗糖溶液中取出,测定线粒体中蔗糖的浓度。如果测得线粒体的蔗糖平均浓度是50mM,就可以推测:100mM的蔗糖仅仅穿过了线粒体外膜,而线粒体中有一半流动的液体在线粒体基质,由于内膜对蔗糖不通透,所以测得的线粒体平均浓度只有50mM。,5,线粒体各组分的分离,由于线粒体外膜的通透性比内膜高,利用这一性质,DonalParsons和他的同事最先建立了分离线粒体内膜、外膜及其他组分的方法(图7-8)，,图7-8线粒体组分的分离,首先将线粒体置于低渗溶液中使外膜破裂,此时线粒体内膜和基质(线粒体质)仍结合在一起,通过离心可将线粒体质分离。用去垢剂毛地黄皂苷处理线粒体质,破坏线粒体内膜,释放线粒体基,质,破裂的内膜重新闭合形成小泡,其表面有F颗粒。,1,请根据线粒体外膜比内膜通透性高这一行特性,设计分离线粒体各组份的方法,7.2.3线粒体各部分的化学组成和特性,线粒体的化学组成,经过对线粒体各结构组分的生化分析,线粒体的化学组分主要是由蛋白质、脂类、水份等组成。,蛋白质占线粒体干重的6570%。线粒体的蛋白质分为可溶性和不溶性的。可溶性的蛋白质主要是基质的酶和膜的外周蛋白，不溶性的蛋白质构成膜的本体，其中一部分是镶嵌蛋白,也有一些是酶蛋白。,脂类线粒体的脂类只占干重的2030%。在线粒体的脂类中多数是磷脂,占,6,总脂的3/4以上。含丰富的心磷脂和较少的胆固醇是线粒体在组成上与细胞其他膜结构的明显差别。,线粒体内、外膜在化学组成上的主要区别是脂类和蛋白质的比例不同,内膜上的脂类与蛋白质的比值低(0.3:1),外膜中的比值较高(接近1:1)。,线粒体各部分的特性和功能,蛋白分布:,线粒体由四个部分组成，在能量转换过程中分别起不同的作用。各部分功能的差异主要是化学组成的差异，特别是蛋白和酶分布的差异(表7-1)。,表7-1线粒体各部分蛋白的分布,外膜,膜间隙,内膜,基质,细胞色素b5NADH-细胞色素还原酶,腺苷酸激酶核苷,NADH脱氢酶琥珀酸脱氢酶细胞色素氧化酶细胞色素CATP合酶,丙酮酸脱氢酶脂肪酸氧化酶Krebs循环酶系DNA聚合酶RNA聚合酶核糖体,单胺氧化酶脂酰辅酶A合酶,二磷酸激酶单磷酸激酶,(FF复合物),0,1,磷酸甘油酰基转移酶核苷二磷酸激酶孔蛋白,运输蛋白,转移RNAs,膜脂含量,膜脂含量磷脂/蛋白=0.3心磷脂/磷脂=0.22醌,磷脂/蛋白=0.9心磷脂/磷脂=0.03,功能,由于线粒体各部分结构的化学组成和性质的不同,它们的功能各异(表7-2)。,表7-2线粒体各部分的功能,部位,功能,外膜内膜膜间隙基质,磷脂的合成;脂肪酸链去饱和;脂肪酸链延伸电子传递,氧化磷酸化,代谢物质运输核苷的磷酸化,丙酮酸氧化,TCA循环,脂肪的氧化,DNA复制,RNA合成,蛋白质合成,7,标志酶,通过细胞化学分析,线粒体各部位有特征性的酶,称为标志酶:外膜:单胺氧化酶,内膜:细胞色素氧化酶,膜间隙:腺苷酸激酶,基质:苹果酸脱氢酶,外膜线粒体外膜是最外的一层全封闭的单位膜结构，是线粒体的界膜，厚67nm,平整光滑。外膜含有孔蛋白,所以外膜的通透性非常高,使得膜间隙中的环境几乎与胞质溶胶相似。外膜含有一些特殊的酶类，如单胺氧化酶(monoamineoxidase),这种酶能够终止胺神经递质,如降肾上腺素和多巴胺的作用。,线粒体外膜的通透性差,又没有电子传递装置,所以没有什么作用,此说正确码?,内膜位于外膜的内侧包裹线粒体基质的一层单位膜结构,厚56nm。内膜的通透性较低，一般不允许离子和大多数带电的小分子通过。,线粒体内膜通常要向基质折褶形成嵴(cristae),其上有ATP合酶(ATPsynthase),又叫FFATP酶复合体,是一个多组分的复合物。,0,1,内膜的酶类可以粗略地分为三类运输酶类、合成酶类、电子传递和ATP合成酶类。,内膜是线粒体进行电子传递和氧化磷酸化的主要部位。在电子传递和氧化磷酸化过程中，线粒体将氧化过程中释放出来的能量转变成ATP。,膜间隙线粒体内膜和外膜之间的间隙称为膜间隙,宽68nm,由于外膜通透性很强，而内膜的通透性又很低，所以膜间隙中的化学成分很多，几乎接近胞质溶胶。功能是建立和维持氢质子梯度。,线粒体基质内膜和嵴包围着的线粒体内部空间是线粒体基质，与三羧酸循环、脂肪酸氧化、氨基酸降解等有关的酶都存在于基质之中；此外还含有DNA、tRNAs、rRNA、以及线粒体基因表达的各种酶和核糖体。,比较线粒体外膜、内膜、膜间隙和基质的化学特性和功能的主要差别,7.2.3线粒体内膜的主动运输系统,由于线粒体对于大多数亲水物质的透性极低，所以它必须具备特殊的主动运输系统，完成下列运输作用:,糖酵解产生的NADH必须进入电子传递链参与有氧氧化；线粒体产生的代谢物质如草酰辅酶A和乙酰辅酶A必须运输到细胞质中，它们分别是细胞质中葡萄糖和脂肪酸的前体物质;,线粒体产生的ATP必须进入到胞质溶胶，以便供给细胞反应所需的能量，同,8,时，ATP水解形成的ADP和Pi又要被运入线粒体作为氧化磷酸化的底物。,丙酮酸、脂肪酸、Pi等的运输,在线粒体内膜上具有完善的运输系统,主要是运输蛋白和一些起促进运输作用的脂类(如心磷脂)。运输系统也包括参与电子传递和氢质子传递的复合物,内膜上有运输丙酮酸、脂肪酸和特殊氨基酸的运输蛋白,其中某些运输蛋白(包括同向和逆向)的运输作用是靠质子梯度驱动的(图7-9)。,图7-9线粒体内膜中的运输系统,线粒体内膜的通透性极低,它是如何进行物质运输的?,线粒体对细胞内Ca2+的调节,线粒体、内质网和细胞外基质都是Ca2+的储藏地，在内质网、肌质网和细胞质膜上都有Ca2+泵的存在。线粒体内膜上有两种类型的Ca2+运输系统，能够将Ca2+输入到线粒体基质中，或将Ca2+从线粒体基质运输到膜间隙(图7-10)。,9,图7-10线粒体的两种Ca2+离子运输系统系统1是由膜动力势引起的Ca2+离子流向线粒体基质;系统2是通过与Na离子输出到胞质溶胶。,+,离子的交换将Ca2+,线粒体内膜是如何进行Ca2+运输的?对细胞质中Ca2+浓度调节有何意义?,7.3导向信号与线粒体蛋白定位,线粒体中的蛋白质绝大多数都是核基因编码,在细胞质的游离核糖体上合成后运输到线粒体的(表7-3)。,表7-3细胞质中合成的某些线粒体蛋白质,线粒体定位线粒体基质,蛋白质,FATPase:亚基(植物除外)、,亚基、亚基(某些真菌)1,RNA聚合酶、DNA聚合酶、核糖体蛋白、柠檬酸合成酶、TCA酶系、乙醇脱氢酶(酵母)、鸟氨酸氨基转移酶(哺乳动物),内膜,ADP-ATP逆向运输蛋白、磷酸-OH逆向运输蛋白、细胞色素c氧,-,化酶亚基4,5,6,7、FATPase的蛋白质、CoQH-细胞色素c2,0,还原酶复合物亚基1,2,5(Fe-S),6,7,8,膜间隙外膜,细胞色素c、细胞色素c过氧化物酶、细胞色素b、CoQH-细胞22,色素c还原酶复合物亚基4(细胞色素c)1,线粒体孔蛋白,10,7.3.1蛋白质寻靶(proteintargeting)和蛋白质分选(proteinsorting),蛋白质的两种转运方式,细胞质中的核糖体在合成蛋白质时有两种可能的存在状态，一种是在蛋白质合成的全过程一直保持游离状态（实际上是与细胞骨架结合在一起的），这种核糖体称为游离核糖体(freeribosomes)；另一种情况是核糖体在合成蛋白质的初始阶段处于自由状态，但是随着肽链的合成，核糖体被引导到内质网上与内质网结合在一起,这种核糖体称为膜结合核糖体(membrane-boundribosomes)。这两种核糖体上合成的蛋白质不仅在细胞内的去向不同,它们的转运方式也是不同的。,翻译后转运(post-translationaltranslocation)与蛋白质寻靶游离核糖体上合成的蛋白质释放到胞质溶胶后被运送到不同的部位,即先合成,后运输。由于在游离核糖体上合成的蛋白质在合成释放之后需要自己寻找目的地,因此又称为蛋白质寻靶(7-11)。,图7-11蛋白质翻译后转运,定位在线粒体、叶绿体、细胞核、细胞质、过氧化物酶体的蛋白质在游离核糖体上合成后释11,放到胞质溶胶中,进入细胞核的蛋白质通过核孔运输,与定位到其他翻译后转运的细胞器蛋白的运输机制不同。,共翻译转运(co-translationaltranslocation)与蛋白质分选膜结合核糖体上合成的蛋白质通过定位信号,一边翻译,一边进入内质网,由于这种转运定位是在蛋白质翻译的同时进行的,故称为共翻译转运(图7-12)。在膜结合核糖体上合成的蛋白质通过信号肽,经过连续的膜系统转运分选才能到达最终的目的地,这一过程又称为蛋白质分选。,图7-12蛋白质的共翻译转运膜结合核糖体合成的蛋白质经内质网、高尔基体进行转运,运输的目的地包括内质网、高尔基体、溶酶体、细胞质膜、细胞外基质等。,12,导向序列(targetingsequence)与信号序列(signalsequence)导向序列,将游离核糖体上合成的蛋白质的N-端信号称为导向信号(targetingsignal),或导向序列(targetingsequence),由于这一段序列是氨基酸组成的肽,所以又称为转运肽(transitpeptide),或导肽(leadingpeptide)。导向序列又称引导序列。信号序列,将膜结合核糖体上合成的蛋白质的N-端的序列称为信号序列(signalsequence),将组成该序列的肽称为信号肽（signalpeptide)。在不需要特别区分时,可将它们统称为信号序列或信号肽。,比较导向序列与信号序列有什么不同,7.3.2线粒体蛋白转运,构成线粒体的蛋白主要是核基因编码的,少量是线粒体基因编码的,无论是核基因还是线粒体基因编码的蛋白质都要转运定位。线粒体有四个组成部分,其中有两层膜,所以由细胞质核糖体合成的蛋白质转运到线粒体基质必须穿过两层膜障碍(图7-13)。,图7-13线粒体蛋白转运的部位,线粒体基质蛋白(mitochondrialmatrixprotein)转运线粒体基质蛋白,除极少数外,都是游离核糖体合成,并通过转运肽转运进来的,转运过程十分复杂(图7-14)。,13,图7-14蛋白质输入线粒体基质,线粒体基质蛋白是如何定位的?,从线粒体基质蛋白的定位,可看出导肽在转运蛋白时具有哪些特点?,线粒体膜间隙蛋白的转运,线粒体膜间隙蛋白,如细胞色素c的定位需要两个导向序列，位于N端最前面的为基质导向序列(matrix-targetingsequence)，其后还有第二个导向序列,即膜间隙导向序列(intermembrane-space-targetingsequence)，功能是将蛋白质定位于内膜或膜间隙,这类蛋白有两种转运定位方式。,保守性寻靶(conservativetargeting)前体蛋白在N-端的基质导向序列引导下采用与线粒体基质蛋白同样的运输方式,将前体蛋白转运到线粒体基质,在基质中由转肽酶切除基质导向序列后,膜间隙导向序列就成了N端的导向序列,它能够识别内膜的受体和转运通道蛋白,引导蛋白质穿过内膜,进入线粒体膜间隙,然后由线粒体膜间隙中的转肽酶将膜间隙导向序列切除(图7-15)。,14,图7-15线粒体内膜蛋白的保守性寻靶,详见正文,非保守性寻靶(nonconservativetargeting),与保守性寻靶不同,蛋白质的非保守性寻靶首先在线粒体基质导向序列的引导下,通过线粒体的外膜和内膜,但是疏水的膜间隙导向序列作为停止转运序列(stop-transfersequence)锚定在内膜上,从而阻止了蛋白质的C-末端穿过内膜进入线粒体基质；然后通过蛋白质的扩散作用,锚定在内膜上的蛋白逐渐离开转运通道,最后在转肽酶的作用下,将膜间隙导向序列切除,蛋白质释放到膜间隙,结合血红素后,蛋白质折叠成正确的构型(图7-16)。,15,图7-16线粒体膜间隙蛋白的非保守性寻靶线粒体内膜和外膜蛋白的转运,图7-17显示线粒体内膜蛋白的N-端只有一个基质导向序列,内膜蛋白在基质导向序列的引导下,按基质蛋白的转运方式进入线粒体基质后,由转肽酶切除导向序列,然后通过构型的变化或与别的蛋白结合形成复合物后再插入到内膜中,详细机理尚不清楚。,图7-17中的P70是线粒体外膜的一个重要的蛋白质,通过体外实验获得有关外膜蛋白转运的一些线索。在P70的N-端有一个短的基质导向序列,紧随其后是一段较长的、强疏水性氨基酸序列。实验中,如果将疏水性氨基酸序列缺失,P70进入线粒体基质,并且其基质导向序列依然连接在一起。这一结果提示,长的疏水性氨基酸序列可作为停止转运信号,既防止了外膜蛋白进入线粒体基质,又作为锚定序列将外膜蛋白锚定在外膜上。正常情况下,外膜蛋白N-端的基质导向序列和长的疏水性序列都不会被切除。,16,图7-17线粒体内膜、外膜的导向序列,7.3.3线粒体蛋白转运的实验研究,上面所讨论的线粒体蛋白的转运方式已得到许多实验的支持。,线粒体蛋白转运的实验证明,通过脉冲示踪研究发现酵母线粒体蛋白合成之后存在于胞质溶胶中,后来逐渐进入线粒体各部位,通过无细胞系统进一步证明这一结果。,请设计一个实验证明线粒体蛋白合成之后进入了线粒体,17,转运中间体与导向序列的特异性研究,在线粒体蛋白转运中一个很重要的中间过程是基质导向序列穿过内外膜,如果能够证明线粒体基质蛋白正在穿过内外膜通道形成的中间体的存在则是对上述转运机制的最有力的证明。,另外,线粒体导向序列对所引导的蛋白质是否具特异性也是人们所关心的问题。科学家通过实验证明了中间体的存在,同时也证明了导肽没有特异性。,请问科学家是怎样证明线粒体基质蛋白在转运过程中穿膜中间体的存在,并证明导向序列(导肽)没有特异性?,7.4线粒体的功能-氧化磷酸化作用,线粒体是真核生物氧化代谢的部位,是糖、脂肪和氨基酸最终氧化放能的场所。最终氧化的共同途径是三羧酸循环和呼吸链的氧化磷酸化。,7.4.1真核细胞中的氧化作用(oxidation),葡萄糖和脂肪酸是真核细胞能量的主要来源，细胞通过对葡萄糖的代谢获取能量。葡萄糖进入细胞后先在细胞质中通过酵解作用生成丙酮酸，如果有氧存在时，丙酮酸进入线粒体基质经过三羧酸循环、电子传递和氧化磷酸化，最后生成ATP和水。如果没有氧，丙酮酸经过发酵生成乳酸(图7-18)。,图7-18真核细胞中碳水化合物代谢俯瞰,18,葡萄糖酵解生成丙酮酸,细胞质中的葡萄糖(或糖原)在一系列酶的催化下生成丙酮酸的过程称为糖酵解(glycolysis)。反应的主要过程包括葡萄糖在磷酸化酶的作用下形成1，6二磷酸果糖,此过程需要消耗两个ATP；二磷酸6-碳糖被裂解生成两个3-碳糖；三碳糖被逐步转变成丙酮酸(图7-19)。,图7-19葡萄糖经糖酵解生成丙酮酸的过程,线粒体中乙酰CoA的生成,丙酮酸生成乙酰CoA,细胞质膜中由糖酵解生成的丙酮酸分子经过线粒体外膜的孔蛋白进入线粒体膜间隙，然后在运输蛋白的作用下穿过内膜进入线粒体基质。在基质中，丙酮酸被丙酮酸脱氢酶(pyruvatedehydrogenase)氧化成乙酰辅酶A,同时生成一分子NADH和一,分子CO。,2,脂肪酸在线粒体基质中通过氧化途径(-oxidationpathway)循环氧化生成乙酰辅酶A。,生物需要能量时首先利用多糖，必要时也会利用脂肪。脂肪被水解生成脂肪酸后进入线粒体。每两个脂肪酸碳产生一分子乙酰辅酶A，同时产生一分子NADH、,一分子FADH(图7-20)。,2,19,图7-20脂肪酸氧化,脂肪酸氧化的第一步是与辅酶A的巯基(-SH)结合而被激活。这一反应发生在脂肪酸的脂酰基团在线粒体内膜运输蛋白帮助下穿过内膜之后。在线粒体中,脂酰CoA经过氧化循环,每循环一,次,脱去两个C,产生一分子乙酰CoA进入TCA循环,同时产生一分子NADH、一分子