酶联免疫技术的发展与进展.ppt

酶联免疫技术的发展与进展,何林,2020/6/11,YHLO专业培训,2,内容,一、免疫分析的发展历史二、免疫分析技术的种类三、酶联免疫分析技术的发展历史四、酶联免疫分析技术的应用五、酶免疫分析技术的类型六、酶联免疫分析技术的设备七、酶联免疫分析技术的材料及物品八、酶联免疫分析技术的未来发展九、科乐士全自动酶免疫分析系统的特点十、科乐士产品的市场推广视角与辩点,2020/6/11,YHLO专业培训,3,一、免疫分析的发展历史,免疫学发展简史开创阶段：公元1018世纪，天花痘痂预防开花。兴起阶段：公元18世纪20世纪中叶，牛痘苗预防天花，发现细菌，建立感染免疫，细胞免疫和体液免疫学说，变态反应，免疫化学。飞跃阶段：从1908年埃利希提出侧链学说开始，对免记忆、免疫识别，免疫耐受、自身免疫、免疫移植等。现代阶段：从1957年开始，各种新型免疫分析技术、免疫学说、理论、临床应用、疾病诊治等取得重大进展。,根据所用的技术和方法，免疫学的发展历史可分为三个时期：一、免疫学的经验时期（17世纪-19世纪）1.用人痘苗接种预防天花。（中国民间）2.接种牛痘苗预防天花。Jenner,免疫发展历史中的重要发现和发明及人物,二、经典免疫学时期（19世纪中叶-20世纪中叶）免疫学与微生物学互相促进、共同发展*多种病原菌被发现；*“病原菌致病”概念的提出；*疫苗的发明；*细胞吞噬作用的发现（细胞免疫）；*免疫血清具有抵御病原菌的作用（体液免疫）；*免疫化学研究取得重大进展；*初步认识多种免疫学现象的本质。,EliMetchnikoff(1845-1916),EmilvonBehring(1845-1917),RobertKoch(1843-1910),PaulEhrilich(1854-1915),提出体液免疫理论和抗体生成的侧链学说,发现细胞吞噬作用，提出细胞免疫理论,发现结核杆菌；提出病原菌致病的概念,发现抗毒素并治愈一名白喉患者,实际上，与此同时，人们也发现除了微生物之外的其它物质也能引起免疫现象，过敏现象有了进一步认识，如血型不符的输血、器官移植排斥反应、血清病等；Koch在发现了结核杆菌之后，试图用注射的方法使动物产生免疫，但注射局部却出现了组织损伤和坏死。,以上事实揭示出两个问题：第一,免疫不一定仅仅由微生物引起;第二,免疫对机体不一定总是有利的，也可以是有害的。至此，经典的免疫概念被动摇了，那么，免疫究竟是机体防御微生物侵袭的特有成分？还是机体识别“自己”和“非己”的普遍生物学现象？这个问题必须有一个明确的答案。,三.近代免疫学和现代免疫学时期（20世纪中叶现在）,特异性细胞的免疫功能、天然和获得性免疫耐受现象、抗体生成克隆学说、细胞克隆选择学说（clonalselection）*Burnet（1957年）提出克隆选择学说；*从器官、细胞和分子水平探讨免疫系统结构与功能。,MacFarlaneBurnet（1899-1985）,克隆选择学说(clonalselectionhypothesis)的基本观点：,1.机体内存在有能识别多种抗原的细胞系（clone），其细胞表面有识别抗原的特异性受体（recepter)。2.抗原进入机体后，选择具有相应受体的免疫细胞与之结合，使该细胞系活化、增殖，并成为抗体产生细胞和记忆细胞。3.若在胚胎期，某抗原选择相应克隆接触后，该细胞系就被排除或失去活性，处于抑制状态，称此为禁忌克隆（forbiddenclone），使机体失去针对该抗原的反应性，形成免疫耐受。解释了天然免疫耐受现象。4.某些克隆可发生突变，而与自身组织发生反应，形成自身免疫应答。1960年，Burnet和Medawar获诺贝尔奖。,鸡法氏囊及哺乳动物胸腺的免疫功能的认识淋巴细胞免疫功能的确认巨噬细胞抗原提呈作用的揭示细胞因子的研究免疫网络学说单克隆抗体制备技术的问世免疫学技术的发展（单克隆抗体标记技术、免疫转印技术、分子杂交技术、转基因技术、细胞融合技术等）。,20世纪获得诺贝尔医学生理学奖的免疫学家年代学者姓名国家获奖成就1901Behring德国发现抗毒素，开创免疫血清疗法1905Koch德国发现结核杆菌，发明诊断结核病的结核菌素1908Ehrlich德国提出抗体生成侧链学说和体液免疫学说Metchnikoff俄国发现细胞吞噬作用，提出细胞免疫学说1912Carrel法国器官移植1913Richet法国发现过敏现象1919Bordet比利时发现补体,建立补体结合试验1930Landsteiner奥地利发现人红细胞血型1951Theler南非发明黄热病疫苗1957Bovet意大利抗组胺药治疗超敏反应1960Burnet澳大利亚提出抗体生成的克隆选择学说Medawar英国发现获得性移植免疫耐受性1972Edelman美国阐明抗体的化学结构Porter英国阐明抗体的化学结构,2020/6/11,YHLO专业培训,15,20世纪获得诺贝尔医学生理学奖的免疫学家,1977Yalow美国创立放射免疫测定法1980Dausset法国发现人白细胞抗原Snell美国发现小鼠H-2系统Benacerraf美国发现免疫应答的遗传控制Jerne丹麦提出天然抗体选择学说和免疫网络学说Kohler德国杂交瘤技术制备单克隆抗体Milstein阿根廷单克隆抗体技术及Ig基因表达的遗传控制Tonegawa日本抗体多样性的遗传基础Murray美国第一例肾移植成功Thomas美国第一例骨髓移植成功1996Doherty澳大利亚提出MHC限制性，即T细胞的双识别模式Zinkernagel瑞士提出MHC限制性，即T细胞的双识别模式,2020/6/11,YHLO专业培训,17,免疫分析技术的发展历史,1896年，Herbert发明特异性凝集现象,Widal发明Widal试验诊断伤寒;1897年，Kmus发现鼠疫杆菌的培养滤液能与相应抗血清发生沉淀反应；1898年,Kraus发明沉淀试验1899年，Bordet发现免疫溶血反应1900年，Landsteiner在特异血凝现象的基础上发现了人类ABO血型，1930年获得诺贝尔生理学和医学奖。1902年，Ascoli建立了环状沉淀试验1905年，Bechhold建立了明胶沉淀试验1906年，Wassermann发明梅毒补体结合反应,2020/6/11,YHLO专业培训,18,免疫分析技术的发展历史,1935年，Heidelberger，纯化抗体技术，定量沉淀反应1942年，Coons建立了荧光素标记技术1946年，Oudin建立了试管单向免疫扩散试验1951年，Ouchterlony建立了双向平板法双向免疫扩散试验1953年，Grabar建立了免疫电泳1953年，Crabar与Williams建立补体结合技术1959年，Singer首创免疫电镜技术1960年，Yalow建立了放射免疫标记测定技术,2020/6/11,YHLO专业培训,19,免疫分析技术的发展历史,1965年，Mancini建立了平板单向免疫扩散试验1971年，Engvall和Perlmann，VanWeeman和Schuurs建立了酶标记的固相免疫测定技术（ELISA）1971年，Rubenstein等建立了均相酶免疫测定技术1975年，Koher和Milstein，杂交瘤技术制备单克隆抗体1980年，Tonegawa，免疫球蛋白基因结构,自然的肉眼观察的抗原抗体反应（沉淀反应、凝集反应）加速的肉眼观察的抗原抗体反应（电泳技术、分离技术）标记性免疫技术提高抗原抗体反应的特异性、敏感性半自动、自动化检验仪器与免疫反应原理结合，加快了反应过程标记技术、单克隆技术、高智能自动化技术的最佳组合,免疫技术发展的发展进程,2020/6/11,YHLO专业培训,21,二、免疫分析技术的种类,分为两大类别：细胞免疫测定技术和体液免疫测定技术。体液免疫技术又可分为体内法和体外法。体外法即体外抗原抗体反应，包括抗原、抗体、补体以及其他有关因素的定量、半定量或定性测定方法，旧称血清学反应；体内法则利用皮肤试验进行检测。细胞免疫测定也可以分为体外法和体内法两类。,2020/6/11,YHLO专业培训,22,1、免疫沉淀技术,包括液体内沉淀试验、凝胶内沉淀试验、免疫电泳、免疫比浊等。其中在经典的免疫电泳技术基础上，又衍生出对流免疫电泳、火箭免疫电泳、交叉免疫电泳、免疫固定电泳等许多新技术和新方法出现。免疫浊度法则可以分为免疫透射浊度、免疫乳胶浊度和免疫速率浊度测定法等。,2020/6/11,YHLO专业培训,23,2、免疫凝集技术,括血凝、胶凝、菌凝、碳凝等微粒技术。其中磁性微粒(magneticmicrospheres,MMS)是80年代初，用高分子材料和金属离子为原料，聚合而成的一种以金属离子为核心，外层均匀地包裹高分子聚合体的固相微粒。在液相中，受外加磁场的吸引作用，MMS可快速沉降而自行分离，无需进行离心沉淀。因此，将MMS应用于免疫检测，可使操作过程大为简化。,2020/6/11,YHLO专业培训,24,3、放射免疫技术,放射免疫测定法是以放射性同位素作为标记物的标记免疫测定方法，一般可以分为三种类型：1、以同位素标记抗原和受检测标本中的抗原与抗体竞争结合的经典放射免疫测定法，RIA。2、以同位素标记的抗体与受检标本中的抗原结合，然后用固相抗原分离游离的标记抗体的免疫放射测定，IRMA。3、以同位素标记的抗原或抗体及固相的抗原或抗体作为试剂，按固相酶免疫疫测定相似的方式检测受检标本中的抗原或抗体的固相放射测定，SPRIA。,2020/6/11,YHLO专业培训,25,4、免疫荧光技术,分为免疫组织化学技术与免疫测定两大类。免疫荧光测定分均相与非均相。非均相荧光免疫测定与ELISA极为相似，差别仅为标记物和测定方式不同。而均相荧光免疫测定则有其特点，常用方式为时间分辨荧光法和均相荧光免疫测定。荧光免疫组织化学技术则与组织化学染色技术相似，最后用荧光显微镜判断结果。,2020/6/11,YHLO专业培训,26,5、酶联免疫技术,是以酶标记抗体或抗原作为主要试剂的免疫测定方法。是标记免疫技术应用于最广泛的一种，也是应用最多的一种标记免疫技术。有关该类方法原理、分类、应用、特点、局限性等，将在后续介绍。,2020/6/11,YHLO专业培训,27,6、免疫胶体金技术,是以胶体金标记物标记抗原或抗体，对样本中相应抗体或抗原进行检测。检测方法包括组织细胞染色、层析、斑点，均为非均相检测法。未来可能发展均相检测法。,2020/6/11,YHLO专业培训,28,7、补体结合试验,利用特异性抗体对红细胞的溶血作用需要补体参与而建立起来的一类检测方法。主要包括补体结合反应和细胞溶解反应。这类检测参与的反应物质有5种成分：已知抗原或抗体，待测抗体或抗原，溶血素、补体、红细胞。其中后起3种成份又称为指示系统。发生溶血反应为试验阴性，不发生溶血反应为试验阳性。,2020/6/11,YHLO专业培训,29,8、中和试验,是用以测定抗体的中和能力的试验，即中某种抗原或中和携带该抗原的微生物的如病毒感染性或细菌毒素的生物学效应能力的试验。其可以中和该抗原的生物学效应之外，也可以用于疾病诊断或病毒鉴定。该试验检测的是中和指数，目前较少应用。,2020/6/11,YHLO专业培训,30,9、免疫组织化学,又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。,2020/6/11,YHLO专业培训,31,10、免疫电镜技术,是将抗原抗体反应的特异性与电子显微镜的高分辨力相结合，在亚细胞和超微结构水平上对抗原物质进行定位分析的一种高度精确、灵敏的方法。特异性抗体用电子致密物质，如铁蛋白、胶体金等标记后，使之与组织超薄切片中的抗原结合，在电镜下观察到标记物所在位置，即为抗原抗体反应的部位。,2020/6/11,YHLO专业培训,32,11、流式细胞技术,能快速、精确地测量通过检测区液流中的各种粒子。这些粒子可以是细胞、大分子、乳胶滴或其他粒子。流式细胞术是对单细胞定量分析和分选的新技术。通常是应用一个激光和有关的光学检测系统来收集这些信号以供分析。其检测速度之快，统计学精度之高，是其他方法无法比拟的。它可以研究一个细胞从新生到死亡，从细胞膜到脑浆和核内物质及染色体，还可以探讨不同物质之间的关系。同时它还可以从一个细胞中测得多种参数(如DNA、RNA、蛋白质和细胞体积等)，进行多信息分析，为细胞生物学和生物医学研究提供强而有力的手段。,2020/6/11,YHLO专业培训,33,12、免疫印迹技术,又称蛋白质印迹（Westernblotting），是一种借助特异性抗体鉴定抗原的有效方法。该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术。将含有目标蛋白（抗原）的样品首先用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）或非变性电泳（Native-PAGE）等分离后，通过转移电泳原位转印至硝酸纤维素膜或其它膜的表面，然后将膜表面的蛋白质再用抗原抗体反应进行特异性检测。,2020/6/11,YHLO专业培训,34,三、酶联免疫分析技术的发展,对酶联免疫分析技术的文献分析Fifa在Pub-Med检索系统中输入“enzyme-immunoassay”，“enzyme-linkedimmunoasay”，“RIA”三个单词，从1965日至2005年，以每五年为一个阶段，检索了期间发表的论文，结果令人惊异。RIA法的高峰处在80年到90年之间，90年之后到2000年论文数量逐渐减少。而以EIA或者ELISA为关键词的文章，在80年以后迅速增长，90年代以后稳定在每5年4万篇左右，目前还未见有下降的趋势。,2020/6/11,YHLO专业培训,35,四、酶联免疫分析技术的应用,均相酶免疫测定主要用于药物和小分子物质的检测。非均相免疫测定中的ELISA应用更为广泛，ELISA广泛用于传染病的诊断，病毒如病毒性肝炎（甲肝抗体、“乙肝三对”、丙肝抗体、丁肝抗体、戊肝抗体）、风疹病毒、疱疹病毒、轮状病毒等；细菌如结核杆菌、幽门螺杆菌等。也用于一些蛋白质检测，如各种免疫球蛋白、补体、肿瘤标志物（甲胎蛋白、癌胚抗原、前列腺特异性抗原等）。,2020/6/11,YHLO专业培训,36,主要试剂:酶标记的抗体或抗原酶标物特点：免疫学活性酶对底物的催化活性,抗原抗体反应的特异性,+,酶高效催化反应的专一性,原理及特点,2020/6/11,YHLO专业培训,37,HRP的常见底物,邻苯二胺OPD,四甲基联苯胺TMB,5-氨基水杨酸5-ASA,2,2-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)铵盐ABTS,常用底物,酶和酶作用底物,2020/6/11,YHLO专业培训,38,酶联免疫分析技术的特点,特异性高灵敏度高稳定性好操作简便对环境污染小成本较低,2020/6/11,YHLO专业培训,39,特点：灵敏度高、特异性强、准确性好酶标记试剂能够较长时间保持稳定操作简便、对环境没有污染。易与其它技术偶联衍生出适用范围更广的新方法。,原理：酶标抗体（抗原）与抗原（抗体）的特异性反应酶对底物的显色反应对抗原或抗体进行定位、定性或定量的测定分析,原理及特点,2020/6/11,YHLO专业培训,40,酶联免疫分析技术的局限性,洗涤损失影响因素较多定性试验的阴性、阳性判定值与均相方法比较，定量检测中的准确度、精密度及线性尚欠理想。,2020/6/11,YHLO专业培训,41,应用酶联免疫分析的产品,据不完全统计，目前用ELISA技术建立或开发的检测项目多达千余项，通过商业机构可购的检测试剂盒多达300种，其中常用的检测试剂盒有近100余种。概括起来，可以这样描述，凡是可以取得抗原物质的所有物品，几乎都可以建立ELISA检测方法。,2020/6/11,YHLO专业培训,42,五、酶免疫分析技术的分类,2020/6/11,YHLO专业培训,43,酶免疫技术,酶免疫组化,酶免疫测定,均相,非均相,固相酶免疫测定,液相酶免疫测定,组织切片或其它标本中抗原的定位,液体标本中抗原或抗体的定性和定量,2020/6/11,YHLO专业培训,44,用于小分子激素和半抗原（如药物）的测定,酶标记物与相应的抗原或抗体结合后，标记酶的活性会发生改变，不用分离结合和游离酶标记物，通过测定标记酶的活性的改变，而确定抗原或抗体的含量。,原理,（一）均相酶免疫测定,2020/6/11,YHLO专业培训,45,最具代表性的两种技术,酶放大免疫测定技术EMITenzyme-mutipliedimmunoassaytechnique,克隆酶供体免疫分析CEDIAclonedenzymedonorimmunoassay,均相酶免疫测定,2020/6/11,YHLO专业培训,46,分类：液相酶免疫测定固相酶免疫测定以聚苯乙烯等材料作为固相载体的酶联免疫吸附试验（ELISA）是目前最为常用的固相酶免疫测定,与均相不同之处,需分离游离与结合的酶标记物,（二）非均相酶免疫测定,2020/6/11,YHLO专业培训,47,底物显色定性或定量的分析,原理,包被,反应加入待测抗体或抗原和酶标抗原或抗体,洗涤使结合在固相上的抗原抗体复合物与未结合的分离,1,2,3,4,ELISA基本原理,2020/6/11,YHLO专业培训,48,固相的抗原或抗体,酶标记物（酶结合物）,酶反应的底物,三个必要试剂,方法类型及其反应原理,2020/6/11,YHLO专业培训,49,（1）双抗体夹心法方法：用已知抗体包被，加入待检血清，再加酶标抗体，加底物显色应用：二价或二价以上的较大分子抗原测定乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCG等,A、ELISA检测抗原的方法,2020/6/11,YHLO专业培训,50,2020/6/11,YHLO专业培训,51,1、已知抗体包被于载体表面,3、加酶标抗体与抗原结合,4、加酶作用的底物产生颜色,2、加待检物抗原与抗体结合,4、加酶作用的底物不产生颜色,双抗体夹心法测抗原,1、已知抗体包被于载体表面,2、加待检物无抗原与抗体结合,3、加酶标抗体无抗原结合,+,-,Y,Y,E,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,2020/6/11,YHLO专业培训,52,（2）竞争法方法：用已知抗体包被，加入待测血清，再加酶标抗原，酶标抗原与待检物竞争与包被物结合加底物显色。应用：用于只有一个抗原决定簇的小分子半抗原（药物、激素等）,A、ELISA检测抗原的方法,2020/6/11,YHLO专业培训,53,2020/6/11,YHLO专业培训,54,竞争法测抗原,+,-,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,E,Y,2、加待检物抗原与酶标抗原竞争与抗体结合,3、加酶作用的底物不显色或显色弱,3、加酶作用的底物显色,1、已知抗体包被于载体表面,1、已知抗体包被于载体表面,2、加待测物和酶标抗原，酶标抗原与抗体结合,2020/6/11,YHLO专业培训,55,（1）间接法方法用已知抗原包被，加入待测血清，再加酶标的抗人IgG（抗抗体或二抗）加底物显色。优点一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体应用常用于HCV抗体、HIV抗体和梅毒螺旋体抗体等的测定,B、ELISA检测抗体的方法,2020/6/11,YHLO专业培训,56,2020/6/11,YHLO专业培训,57,1、已知抗原吸附于载体表面,2、加待检物无抗体与抗原结合,3、加酶标抗Ig与抗体结合,4、加酶作用的底物产生颜色,1、已知抗体吸附于载体表面,2、加待检物有抗体与抗原结合,3、加酶标的抗Ig抗体,4、加酶作用的底物不产生颜色,间接法测抗体,-,Y,E,Y,+,2020/6/11,YHLO专业培训,58,（2）双抗原夹心法原理类似双抗体夹心法操作步骤类似应用乙型肝炎表面抗体,B、ELISA检测抗体的方法,2020/6/11,YHLO专业培训,59,（3）竞争法原理类似检测抗原的竞争法应用乙型肝炎病毒核心抗体(HBcAb)和乙型肝炎病毒e抗体(HBeAb)的检测,B、ELISA检测抗体的方法,2020/6/11,YHLO专业培训,60,（4）捕获法应用病原体急性感染诊断中的IgM型抗体甲型肝炎HAV-IgM抗体乙型肝炎病毒核心HBc-IgM抗体,B、ELISA检测抗体的方法,2020/6/11,YHLO专业培训,61,捕获法,原理：抗人IgM链抗体包被捕获待测标本中IgM类抗体加入特异性抗原和酶标记特异性抗原的抗体底物显色,2020/6/11,YHLO专业培训,62,捕获法原理,+,-,1、固相化抗人IgM,1、固相化抗人IgM,2、加待测物特异性IgM与非特异性IgM和抗人IgM结合,3、加特异性抗原，与特异性抗体结合,4、加酶标抗体与特异性抗原结合，加底物显色,2、加待测物只有非特异性IgM和抗人IgM结合,3、加特异性抗原，不能与非特异性IgM结合,4、加酶标抗体无抗原结合，加底物不显色,2020/6/11,YHLO专业培训,63,六、酶联免疫分析技术的设备,1、加样器2、洗板机3、孵育箱4、加速仪5、酶免分析仪6、数据分析方法7、结果报告系统,2020/6/11,YHLO专业培训,64,七、酶联分析所需使用的材料,（1）抗原：纯化抗原、合成抗原、基因工程抗原。（2）抗体：多克隆抗体、单克隆抗体、基因工程抗体。（3）酶标抗体或抗原：辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶、B-半乳糖苷酶等。（4）酶色原底物：邻苯二胺（OPD）、ABTS、四甲基联苯胺（TMB）；对硝基苯磷酸盐（pNPP）,酶发光底物（鲁米诺、AMPPD）。（5）微孔反应板（6）洗涤液、终止剂（7）阳性质控品（8）阴性质控品,2020/6/11,YHLO专业培训,65,标记酶的要求：活性高性质稳定专一性强酶催化底物的显色信号易于判断和测量方法敏感，重复性好，简单易行酶的底物易于配制保存，酶及底物价廉,（一）酶和酶作用底物,2020/6/11,YHLO专业培训,66,辣根过氧化物酶（HRP）,糖蛋白（主酶）亚铁血红素（辅基）主酶与酶活性无关辅基是酶的活性中心,RZ值：403nm（辅基）与275nm（主酶）OD值之比,RZ值与酶活性无关，酶活性单位比RZ值更为重要,ELISA中应用最为广泛的标记用酶,常用酶,酶和酶作用底物,2020/6/11,YHLO专业培训,67,碱性磷酸酶（AP）,菌源性AP肠粘膜AP,半乳糖苷酶（-Gal）,用于均相酶免疫测定,常用酶,酶和酶作用底物,2020/6/11,YHLO专业培训,68,HRP的底物,DH2+H2O2D+2H2O,HRP,供氢体DH2习惯上被称为底物，底物有多种,H2O2为受氢体，HRP对受氢体的专一性很高,常用底物,酶和酶作用底物,2020/6/11,YHLO专业培训,69,OPD反应后显橙黄色，加酸终止反应后呈棕黄色，测定波长492nm。不稳定，致癌性。,TMB反应后显蓝色，加酸终止反应后变为黄色,测定波长450nm，稳定，无致癌性，ELISA中应用最广泛的底物。,HRP的常见底物,酶和酶作用底物,2020/6/11,YHLO专业培训,70,AP的底物,-Gal的底物,对-硝基苯磷酸酯（pNPP）,4-甲基伞酮基-D半-乳糖苷（4MUG）,经AP作用后的产物为黄色对硝基酚，最大吸收峰波长为405nm。,酶作用后，生成高强度荧光物，用荧光计测量。,常用底物,酶和酶作用底物,2020/6/11,YHLO专业培训,71,酶免疫技术的核心组成部分,酶结合物（conjugate）酶标记物,通过化学反应或免疫学反应，让酶与抗体或抗原形成的结合物,（二）酶标记抗体或抗原,2020/6/11,YHLO专业培训,72,抗原要求纯度高，抗原性完整,抗体需要特异性好、效价高、亲合力强以及比活性较高，能批量生产，易纯化。,制备方法要求,酶标记抗体或抗原,2020/6/11,YHLO专业培训,73,制备方法要求,技术方法简单、产率高，重复性好,标记反应不影响酶和抗原或抗体的活性,酶标记物稳定，不形成聚合物,酶标记抗