实时荧光定量PCR数据分析及常见问题分析

实时荧光定量PCR数据分析及常见问题分析,一、数据分析,定量PCR扩增曲线的各种概念,一、数据分析,什么是基线基线是扩增曲线的水平部分。,一、数据分析,基线扣除,一、数据分析,什么是阈值阈值是一个荧光强度值，穿过阈值与X轴平行的直线称为阈值线。,一、数据分析,什么是Ct值Ct值是阈值线与扩增曲线的交点对应在X轴上的值。,一、数据分析,基线,一、数据分析,基线,一、数据分析,基线,一、数据分析,基线,一、数据分析,阈值线,一、数据分析,阈值线,二、常见问题分析,1、PCR扩增抑制（以Bio-CFX96为例）扩增曲线荧光强度大小及Ct值大小可提示存在抑制。H07存在扩增抑制；解决方法：将样本稀释后进行扩增。（抑制物的影响可通过稀释样本消除）,二、常见问题分析,PCR抑制物黑色素多糖类血红蛋白尿素其他,乙醇蛋白酶K胍盐苯酚,二、常见问题分析,血液中PCR抑制物的作用机制及对策,二、常见问题分析,检查样本质量用分光光度计测量样本260/280比值DNA纯度：OD260/OD280=1.8RNA纯度：OD260/OD280=2.0,二、常见问题分析,2、自动基线有问题,二、常见问题分析,手动设置基线点击右键，选择BaselineThreshold,二、常见问题分析,手动设置基线将BaselineEnd设置为“扩增信号出现的前一个循环”即，原始为26，将其设置为20，点击OK,二、常见问题分析,手动设置基线设置完成后问题曲线恢复正常,二、常见问题分析,3、重复性1个样本4个复孔重复性好,二、常见问题分析,3、重复性1个样本4个复孔重复性差,二、常见问题分析,造成重复性差的原因基线、阈值的设置加样误差（操作？移液器？）没有将试剂和样本充分混匀低拷贝的样本泊松分布没有使用ROX校准（ABI7500）,二、常见问题分析,基线、阈值的设置根据曲线的具体情况进行设置：阈值：大部分曲线荧光强度/20基线：开始2/3（根据仪器和试剂）结束扩增信号出现的前一个循环如果基线、阈值设置无问题，则是其它原因造成重复性差。,二、常见问题分析,加样误差（操作？移液器？）没有将试剂和样本充分混匀有时候在制备PCR反应混合液时（包括Goldstar/PCRMix反应液、引物探针、样本、水），在分装入反应板（管）前没有充分混匀。结果加入到每个孔中的试剂成分就有所不同。解决方法：在分装反应混合液前，要将其充分混匀（振荡、吹打）离心。同时上机之前，要将PCR反应板（管）离心，使所有液体都在反应管底部。,二、常见问题分析,低拷贝的样本泊松分布泊松分布：是一种统计与概率学里常见到的离散机率分布（discreteprobabilitydistribution）。在30ul中有9个模板，每个反应管均匀的分配到3个模板的几率有多高？如果30ul中有9000个模板呢，又会怎么样？,二、常见问题分析,ROX校准：参比荧光（ABI7500）,二、常见问题分析,ROX设置ABI7500仪器软件自动进行ROX校准。ROX校准为可选步骤，如果使用的PCR试剂没有添加ROX参比荧光，或者ROX添加浓度不适合，请将ROX校准关闭（None）。,二、常见问题分析,4、“可疑的”扩增曲线（以ABI7500为例）由于PCR扩增形成的真正的扩增曲线通常很容易确认。有特征的形状：首先有背景信号（基线期），然后是三个增长阶段（指数增长期、线性增长期和平台期）,二、常见问题分析,指数增长期内扩增曲线具有高度重复性,二、常见问题分析,是什么原因造成平台期很低呢？可能是目标样本的浓度太低。通常如果模板的起始浓度太低，反应体系中会形成大量的引物二聚体。大量引物二聚体的形成使得引物很快消耗完，从而造成扩增曲线的平台期很低。,二、常见问题分析,引物和模板比例,二、常见问题分析,是否可以调整引物和模板的比例？YES。低引物浓度会导致高Ct值（灵敏度低）。所以对于低浓度的样本，反应体系中引物的浓度却不能太低。,二、常见问题分析,如何判断他们是否存在扩增？首先看对数图谱，和同一反应中的其它曲线相比，这些曲线的形状不相同。,二、常见问题分析,如何判断他们是否存在扩增？同时这些曲线没有明显的指数增长期。,二、常见问题分析,如何判断他们是否存在扩增？最后看线性图谱。曲线一直没有上升的趋势，提示不存在扩增。,二、常见问题分析,如何判断他们是否存在扩增？案例：先看对数图谱右侧的曲线形状和扩增曲线很相似，但曲线不光滑。,二、常见问题分析,如何判断他们是否存在扩增？案例：再看下线性图谱，可以看到曲线有一定的上升。,二、常见问题分析,如何判断他们是否存在扩增？案例：分析：形成这类曲线的原因可能是模板可能是模板的质量差（PCR抑制物；模板浓度低），也有可能是引物探针有问题。试剂原因：如果使用的试剂背景信号太强，荧光的增长将会很小，导致扩增曲线的指数增长期会变得很短，或者没有。荧光信号差的