11《DNA重组技术的基本工具》.ppt

基因工程,专题1,烟草,据WTO调查：2004年全世界因狂犬病致死人数约5.5万人中国卫生部通报：2004年月，狂犬病列法定报告传染病死亡数之首。发病死亡率近100%,能产生狂犬病抗体蛋白的转基因,每100kg猪或牛的胰腺中仅可提取45g。,1979年，美国将人的胰岛素基因重组到大肠杆菌内，实现了细菌生产胰岛素，大大降低了生产成本。,治疗糖尿病特效药,据WTO调查：2005年全世界约有糖尿病患者1.8亿人，我国约6000万。,胰岛素,基础理论催生了基因工程,科技探索之路,早期基础理论,达尔文提出生物进化论,基础理论催生了基因工程,科技探索之路,早期基础理论,孟德尔提出基因的分离定律和自由组合定律,基础理论催生了基因工程,科技探索之路,早期基础理论,摩尔根证明基因在染色体上，并提出基因的连锁互换定律。,基础理论催生了基因工程,科技探索之路,后期基础理论,艾弗里证明DNA是遗传物质，DNA可从一种生物个体转移到另一种生物个体。,基础理论催生了基因工程,科技探索之路,后期基础理论,沃森、克里克提出DNA的双螺旋结构模型。,基础理论催生了基因工程,科技探索之路,后期基础理论,梅塞尔松、斯塔尔证明DNA的半保留复制,基础理论催生了基因工程,科技探索之路,后期基础理论,克里克等提出中心法则,基础理论催生了基因工程,科技探索之路,后期基础理论,1963年尼伦伯格和马太破译编码氨基酸的遗传密码，1966年霍拉纳用实验加以证明。,技术发展使基因工程的实施成为可能,科技探索之路,1)基因转移载体的发现2)工具酶的发现3)DNA合成和测序技术的发明4)DNA体外重组的实现5)重组DNA表达实验的成功6)第一例转基因动物问世7)PCR技术的发明,DNA重组技术,生物体外,基因,DNA分子水平,人类需要的新生物类型和产品,一基因工程的原理,DNA重组技术和转基因技术,问题探讨：,苏云金芽孢杆菌含有一种可以合成毒蛋白的基因。让细菌的毒蛋白基因在棉花细胞中表达，可培育出抵抗棉铃虫害的抗虫棉。想一想需要做哪些关键工作？,普通棉花抗虫棉,解决培育抗虫棉的关键步骤,“分子手术刀”限制性核酸内切酶,关键步骤一：,抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来,关键步骤二：,抗虫基因与棉花DNA“缝合”,关键步骤三：,抗虫基因进入棉花细胞,“分子缝合针”DNA连接酶,“分子运输车”基因进入受体细胞的载体,二、DNA重组技术的基本工具,需要哪些工具？,思考,在自然界中有一些生物的DNA可能进入另一种生物的细胞中。我们有没有学过相关的实例？细菌为什么不会因外源DNA的入侵而灭绝？,(1)来源：(2)特点：具有专一性表现在:1、识别双链DNA分子中特定的核苷酸序列,2、切割特定核苷酸序列中的特定位点(3)作用实质使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开（切割DNA分子）,（一）限制性核酸内切酶-“分子手术刀”,T,磷酸二酯键,A,EcoR,（4）作用结果：,黏性末端和平末端,Sma,EcoR,黏性末端,黏性末端,Sma,平末端平末端,限制酶存在于原核细胞中的作用是什么？为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？,思考,实例1：,1、下列关于限制酶的说法正确的是（）A.限制酶广泛存在于各种生物中，但微生物中少B.一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列C.不同的限制酶切割DNA后都会形成黏性末端D.限制酶的作用部位是特定核苷酸形成的氢键,要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性(平)末端？,要切两个切口，产生四个黏性(平)末端。,如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？,会产生相同的黏性(平)末端，然后让两者的黏性(平)末端黏合起来，就似乎可以合成重组的DNA分子了。,（二）“分子缝合针”DNA连接酶,作用:,把切下来的DNA片段拼接成新的DNA，即将脱氧核糖和磷酸连接起来.,作用原理：,催化磷酸二酯键形成,类型：,EcoliDNA连接酶,T4DNA连接酶,来源,功能,大肠杆菌,T4噬菌体,恢复磷酸二酯键,只能连接黏性末端,能连接黏性末端和平末端(效率较低),相同点,差别,可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，,EcoliDNA连接酶或T4DNA连接酶,即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键,T4DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效率较低,T4DNA连接酶,寻根问底,DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗?为什么?,1)只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键,形成磷酸二酯键,1)在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键,(三)“分子运输车”基因进入受体细胞的载体,载体需要的条件：有1多个限制酶切点对受体细胞无害导入基因能在受体细胞中复制、表达有某些标记基因，便于筛选常用运载体：细菌的质粒噬菌体(3)某些动植物病毒,假如目的基因导入受体细胞后不能复制或不能转录，转基因生物能有预想的效果吗？,作为分子运输车载体，如果没有切割位点将会怎样？,霍乱菌的质粒多个限制酶切点，你会用它来做分子运输车吗？,目的基因有没有进入受体细胞，如何去发现？,运载体：常用质粒质粒特点：,1、细菌染色体外双链环状DNA分子2、能自我复制并在受体细胞中稳定存在3、有一个或多个限制酶切点4、有特殊的遗传标记基因,注意：真正用作运载体的质粒都是人工改造过的。,三模拟操作：重组DNA分子的模拟操作,注意