微生物遗传第二章微生物的遗传物质

微生物遗传育种,生命科学技术学院何璟2012年2月,陈大松彭楠,第一章绪论,微生物遗传学：研究微生物遗传体制、遗传和变异规律的学科。微生物育种：根据微生物遗传学原理，采用人工方法引起微生物变异或形成新的杂种，从中选育出符合要求的优良变种。,一、基本概念,显微镜的发明,ANTONYVANLEEUWENHOEK,August26,1723(aged90）Delft,Netherlands,Died,October24,1632Delft,Netherlands,Born,Dutchmicrobiologist,二、微生物遗传学的建立和发展,（一）在成为一门独立学科以前,微生物学的三大奠基人,September28,1895(aged72)Marnes-la-Coquette,Hauts-de-Seine,France,Died,December27,1822Dole,Jura,Franche-Comt,France,Born,Frenchmicrobiologistandchemist,LouisPasteur,FerdinandJuliusCohn,RobertKoch,27May1910(aged66)Baden-Baden,GrandDuchyofBaden,Died,11December1843Clausthal,KingdomofHanover,Born,Germanphysician,KnownforDiscoverybacteriologyKochspostulatesofgermtheoryIsolationofanthrax,tuberculosisandcholeraNobelPrizeinMedicine(1905),Germanbiologist,25June1898(aged60),Died,24January1828Breslau,PrussianProvinceofSilesia,Born,1.疾病细菌说2.巴斯德消毒法,Koch定律，确立了微生物种的概念,按形状将细菌分为四大类,1907年，在睡眠虫中发现了微生物的抗药性变异。1928年，在肺炎双球菌中发现了转化现象。20世纪30年代，酵母、草履虫和脉孢菌是仅有几种进行遗传学研究的微生物，其内容仅限于基因重组和定位。总之，40年代以前的微生物遗传学研究是不系统的，仅限于产有性孢子的微生物。,1.营养缺陷型的研究：G.W.Beadle和E.L.Tatum用X射线处理脉胞菌的分生孢子时得到预期的营养缺陷型。,（二）发展成为一门独立学科,20世纪40年五个方面的工作促使微生物遗传学发展成为一门独立学科,Neurosporacrassa,2.细菌抗药性突变的研究：,Luria和Lederberg分别用遗传实验证明:细菌的某些突变是随机发生的,与选择条件无关。,波动试验（fluctuationtest）,3.细菌基因重组的发现：,J.Lederberg和E.L.Tatum合作发现两种细菌在混合培养之下发生了杂交的现象，即基因重组。,4.转化因子化学本质的鉴定：意义：这是明确遗传的物质基础是DNA的第一个证据，为1953年DNA分子双螺旋模型的提出和分子生物学开启的奠定了基础。5.噬菌体遗传学的研究：意义：噬菌体遗传学的研究把遗传学规律推广到最简单的生物。温和噬菌体及其转导作用的发现则成为微生物遗传学、分子遗传学研究的有效手段。,三、微生物作为遗传学材料的特点和优越性,特点：微生物是单细胞或多细胞、不分化或简单分化低等生物，以及无细胞结构的病毒原核微生物一般为单倍体，许多真核微生物营养体也为单倍体微生物个体小，生长繁殖速度快，便于人工控制，缩短研究周期。代谢旺盛，能积累大量代谢产物，而有利于基因表达的研究,优越性：易于突变体的筛选易于开展基因重组过程和机理的研究易于开展基因结构、功能和调控机制的研究利用微生物遗传特性的研究，可以揭示所有生物共同的遗传规律微生物载体系统，是研究和改造高等生物的重要工具,四、微生物遗传学与其他学科的相关性,最终解决真核生物的遗传学问题,经典遗传学,微生物遗传学,分子遗传学,生物化学,研究对象不同,研究方法不同,发展,分子生物学需以微生物作为材料,思考题：,什么是微生物遗传学？微生物作为遗传学研究材料的特点和优越性？20世纪40年哪五个方面的工作促使了微生物遗传学的建立？微生物遗传学与其他学科的相关性如何？,参考书目：盛祖嘉等微生物遗传学第三版科学出版社2007陈三凤等现代微生物遗传学化工出版社2003施巧琴等工业微生物育种学科学出版社2003周俊初等微生物遗传学中国农业出版社1997LewinBetalGenesIXPearsonEducationInc.2006StreipsUNetalModernMicrobialGeneticsJohnWiley&SonsInc.2002,第二节原核生物染色体及其复制,第一节遗传物质的基础,第四节微生物基因和基因组,第三节真核微生物染色体及其复制,第二章微生物的遗传物质,一、遗传物质的特点,遗传物质：是指在遗传上起主要或决定作用的物质，即遗传信息的载体。遗传物质的特点：稳定性：高度的稳定性可使物种在长期传代过程中保持其基本属性，又称遗传保守性多样性：多样性是指遗传物质具有编码复杂多样生物遗传性状的能力自我复制能力：自我复制能力是指它的延续性，即遗传物质能够通过精准的自我复制传给下一代。非细胞生物的病毒，虽然没有自我复制能力，但也能借助于寄主细胞来完成其遗传物质的复制。,第一节遗传物质的基础,生命科学领域的学者曾开展了长期的探索和研究。1865年G.J.Mendel首次提出生物存在遗传因子1903年W.S.Sutton报道染色体是遗传单位1910年T.H.Morgen证实豌豆的遗传基因位于染色体上（基因学说），1944年O.T.Avery等人证实DNA是遗传物质1953年J.D.Watson和F.H.C.Crick确认了DNA的双螺旋结构模型,什么是遗传物质？,科学界才普遍接受了DNA是遗传物质和遗传信息的载体，目前普遍认为：基因是染色体DNA分子上的一个特定大小的片段。除DNA外，某些病毒（只含RNA的病毒）也可以RNA作为遗传物质。,三、证明遗传物质的三个经典试验,1.细菌的转化实验,第一次用实验证实了DNA是细菌的遗传物质。,2.噬菌体感染实验,只有DNA才具有T2噬菌体的全部遗传信息，是噬菌体的遗传物质。,3.烟草花叶病毒的重建实验,TMV的蛋白质组成及其引起的病斑特征均由RNA决定，证实在RNA病毒中，RNA就是病毒的遗传物质。,1953年，Watson和Crick根据X射线分析结果，确立了DNA双螺旋结构模型，提供了DNA是遗传物质的分子基础，并开创了分子遗传学和分子生物学研究的新纪元。,分子生物学的基本定律中心法则,四、DNA的半保留复制,MatthewMeselson和FranklinStahl1958,DNA的复制总是由5向3方向进行DNA的半保留复制保证了所有的体细胞都携带相同的遗传信息，并可以将遗传信息稳定地传递给下一代。,五、DNA的复制过程,复制单位：复制是从DNA分子的特定部位开始，这个部位称为复制起点（Originofreplication）。每个复制起点及其复制区为一个复制单位，称为复制子（replicon）。每个复制子在每次细胞分裂期间只发动一次复制事件。复制起点是复制子中控制启动复制的元件，有的还有一个复制终点(terminus)。,原核生物染色体一般只有一个复制子，在一个复制起点上启动复制整条染色体。每个质粒都是独立的复制子。原核生物染色体和质粒的复制起点都以ori表示。真核生物染色体上有许多个复制子，其大小也不尽相同，每一复制子的复制速率低于原核生物，它们共同完成染色体的复制。真核生物的复制起点称为自主复制序列(autonomouslyreplicatingsequence简称ARS)。,复制方向：,单向复制：从一个起点开始，以同一方向生长出两条链，形成一个复制叉。双向复制：从一个起点开始，沿两个相反方向各生长出两条链，形成两个复制叉。,线状DNA的复制一般是双向复制，根据复制起点的多少又分为双向单点和双向多点复制。,环复制滚环复制D环复制（线粒体DNA）,环状DNA复制的主要方式,滚环复制,滚环复制的特点：以亲本链（链）为模板合成互补的环状负链，形成闭合环状的复制形RF1以成环滚环复制产生多个子代RF以RF的负链为模板进行滚环复制产生多拷贝正链单环,D环复制,重链复制，置换亲代重链，形成D-环,D-环延伸至轻链复制起点，轻链开始复制,六、RNA的转录,内含子：不能编码蛋白质的核苷酸片段外显子：编码蛋白质的核苷酸片段转录后新合成的mRNA是未成熟的mRNA，需要在特定部位剪接，最后形成较短的有功能的RNA。原核生物中，DNA链上不存在内含子,翻译过程中，由于每一个氨基酸是严格按照mRNA模板的密码序列被逐个合成到肽链上，因此，mRNA上的遗传信息被准确地翻译成特定的氨基酸序列。细胞质中，翻译是一个快速过程，一段mRNA可以相继与多个核糖体相结合，同时连续进行多条同一种新肽链的合成。遗传信息流由DNARNA蛋白质流动。RNA的自我复制，反转录,七、蛋白的翻译,第二节原核生物染色体及其复制,原核微生物主要有细菌、放线菌和蓝细菌，DNA是原核微生物染色体的主要组成成分，含量在80%以上，其余为RNA和蛋白质。其染色体一般为环状双链DNA，存在于细胞内相对集中的区域，称为拟核（nucleoid），无核膜包裹，呈裸露的DNA分子。虽有少量蛋白结合，但不能形成染色体结构。拟核中的蛋白质与DNA的折叠、复制、重组、转录等过程有关。然而，习惯上也称其为染色体（chromosome）。,一、原核生物染色体数目和大小,E.coli染色体DNA大小为4.7106bp，长度为1333um，是菌体长度的1000倍。,二、原核生物染色体的结构,遗传因子存在形式,三、原核生物染色体的复制,参与大肠杆菌染色体复制的蛋白及其功能,大肠杆菌染色体复制起点oriC的结构,长度245bp,右侧含有4个9bp的重复序列（5-TTATCCACA-3）称Dnabox,左侧含有13bp富含AT的重复序列（5-GATCTNTTNTTTT-3）,大肠杆菌染色体复制起始,大肠杆菌染色体复制的延伸过程,第三节真核微生物染色体及其复制,真核细胞和原核细胞的最大差别之一是遗传物质的分布和存在状态。原核细胞的染色体是以裸露DNA存在于细胞中，而真核细胞的DNA则与组蛋白和非组蛋白相结合并缠绕成多条染色体存在于细胞核中。在真核生物染色体中，DNA约占30-40%，组蛋白和非组蛋白占60%以上，RNA约占10%以下。,一、核小体的成份,组蛋白是染色体的结构蛋白，它与DNA组成核小体，是一种含有大量赖氨酸和精氨酸的碱性蛋白。通常由H1、H2A、H2B、H3、H4五种蛋白组成,二、染色体的结构,真核生物染色体组成的基本单位是核小体，核小体由上述组蛋白八聚体和DNA组成。由H1组蛋白和DNA相连一串核小体称为染色质（chromatin）。在细胞分裂中期，染色质浓缩、反复折叠成为一定形状的染色体。,三、真核染色体的复制,真核细胞的生活周期分为4个时期：G1：复制预备期S：复制期G2：有丝分裂准备期M：有丝分裂期DNA复制只发生在S期，复制是通过许多独立的复制子来完成，部分复制子在S期任何时间都参与复制，而另一些复制子则只在S期某一特定时间起作用。,四、真核生物染色体复制特点,真核生物复制子多而相对较小复制速度慢复制起点的连续性：染色体在全部复制完成之前，复制起点不会开始新的复制，而原核生物，由于生长快的要求，起点可以发动连续复制。真核生物在快速生长时，往往起动更多的复制起点。,第四节微生物基因和基因组,一、基因的结构,从分子遗传学角度，基因是一段具有特定功能和结构的连续的DNA片段，是编码蛋白质或RNA分子遗传信息的基本单位。因此，采用开放读码框（ORF：openreadingframe）及其转录调控元件（启动子和终止序列）来描述基因。因为一个基因不仅有它的编码序列，而且还包括表达编码序列所需要的信息。绝大多数编码蛋白质的ORF都有完全相同的结构式，即始于DNA特殊的三联体密码子（ATG(甲硫氨酸),GTG(缬氨酸)）和终止于几个特殊的终止密码子（TGA、TAA或TAG）。,ORF：由起始密码子到终止密码子是一个连续的编码序列启动子（promoter）：是位于5-端上游紧靠转录起点的一段长度在20-200bp的非编码序列，其功能是RNA聚合酶结合，其中包含两个区：-35区和-10区。-10区是RNA聚合酶核心酶结合部位，其序列一般为TATAAT。-35区是RNA聚合酶因子识别部位，其序列为TTGACA。终止子（terminator）：是位于一个基因或一个操纵子末端，提供终止转录信号区段。,1.原核生物基因的结构,位于基因的5端位置和距离都比较恒定决定转录的启动和方向序列保守直接和RNA多聚酶相结合结构典型，都含识别R，结合B和起始I位点常和操纵序列相邻特殊的操纵子的R,B序列不同,启动子（promoter）的结构特点,在大肠杆菌中，终止子分两类：强终止子内部终止子（intrinsicterminator）是一类不依赖于Rho蛋白辅助因子而能实现终止作用(1)有回文结构存在；(2)茎的区域内富含G-C；(3)强终止子3端上有6个U；弱终止子需要因子（rhofactor）又称为依赖性终止子（Rho-dependentterminator）,终止子（terminator）,2.真核生物基因的结构,一个完整的真核基因，不仅包括编码区，也包括编码区两侧的调控序列。与原核基因相比，最大的差别在于编码区被许多非编码序列所间断，这种非编码序列称为内含子（intron），被间隔的编码区称外显子（exon）。,真核生物基因的启动子,真核生物启动子与原核生物类似，也含有两个高度保守的共有序列。在-25至-35区含有TATAA序列（TATAbox），它与原核启动子-10区相似，是转录因子与DNA的结合部位。在-70至-80区含有GGNCAATCT序列（CAATbox），它是激活因子结合部位。还有一部分DNA序列能增强或减弱转录起始的频率，称为增强子（enhancer）和沉默子（silencer），其长度一般为100-200bp。,增强子的性质：,增强效应十分明显，使转录效率增加10-200倍，有的可达上千倍。与其位置和取向无关，在基因上游或下游、5-3或3-5方向，均表现出增强效应。可远离转录起点，通常在1-4kb起作用，甚至长达30kb。没有基因特异性，对同源、异源基因均有效。具有组织和细胞特异性。可感受外界信号的调控，如金属硫蛋白基因启动区所带的增强子，可以对环境中的锌、铬浓度做出反应。,沉默子：,沉默子是在酵母交配型座位中首次发现的。沉默子属于负调控元件，可不受距离和方向的限制，并可对异源基因的表达起作用。沉默子在真核生物细胞中对成簇基因的选择性表达起重要作用。（结构高度相关、功能相同或类似的一群基因，称为成簇基因。其成员的表达可以在不同时或不同类型细胞中。）,终止子和poly(A)尾：,真核基因3-末端含有终止转录的序列和mRNA转录后加工信号，称为终止子。成熟的mRNA的3-末端都含有poly(A)尾，长度一般在200个核苷酸，酿酒酵母基因多数在50个核苷酸左右。,3.基因概念的发展,随着现代生物技术和分子生物学研究的发展，对基因的认识也有了进一步的深入，明确了重叠基因、断裂基因、移动基因、假基因等概念。重叠基因（overlappinggene）：是指一个基因的核苷酸与另一个基因的核苷酸之间存在着一定程度的重复现象。重叠基因有两种类型：a.是一个基因的核苷酸序列完全包含在另一个基因的核苷酸序列之中；b.是一个基因的末端密码子与另一个基因的起始密码子之间有少数核苷酸之间的重叠。,二、基因组,基因组研究的迅猛发展已形成了一个新的学科，即基因组学（genomics）。基因组学是研究生物体基因和基因组的结构组成、不稳定性及功能的一门学科。基因组学分成：结构基因组学（structuralgenomics），研究基因和基因组的结构，各种遗传元件的序列特征，基因组作图和基因定位等。功能基因组学（functionalgenomics），研究不同的序列结构具有不同的功能，基因表达的调控，基因和环境之间（包括基因与基因之间，基因与其他DNA序列之间，基因与蛋白质之间）相互作用等。,基因组（genome）是指单倍体细胞中所含的全套遗传物质。就大多数细菌和噬菌体而言，它们的基因组是指单个的染色体上所含的全部基因。,什么是基因组？,截止2006年5月为止，已经对约500个微生物的基因组完成了测序工作，同时对约500个微生物基因组正在进行测序。2001年2月，人类基因组的测序也已基本完成。,三、大肠杆菌基因组,转录单元（operon）是指由启动子、结构基因及其终止子组成的一段DNA顺序。如果功能上相关的几个结构基因前后相连，利用一个共同的启动子和终止子，这种转录单元被称为操纵子（operator）。操纵子通常是先被转录成一条大的mRNA，再由同一条mRNA翻译出几个结构蛋白。,1.编码蛋白质的基因,在大肠杆菌中，染色体上的许多基因是以操纵子的形式组织起来的。这种操纵子是原核生物基因组的一个特点，如乳糖操纵子、色氨酸操纵子等。另外，还有不少功能相关的蛋白质的基因并不簇集在一起，而是分散排列在整个染色体DNA的不同区域，如与大肠杆菌染色体复制有关的十多个酶基因就是分散在染色体上的。,对大肠杆菌K-12的基因组全序列分析表明：共有2584个转录单元，其中：73%（2192个）只有一个基因16.6%有2个基因4.6%有3个基因6%有4个或4个以上基因,rRNA基因：一般来说，大多数细菌的rRNA基因(rDNA)都是以转录单元（也称为rrn位点）的形式组织在一起的。一个转录单元中含有三个rRNA基因，即5SrDNA、16SrDNA、及23SrDNA，它们以16S-23S-5S的顺序串联排列，长度约为5kb，转录时先形成一个大的rRNA前体，再形成成熟的16S、23S及5SrRNA。,2.最终产物是RNA的基因,另一个特点是rDNA的拷贝数多。大肠杆菌染色体上，有7个以16S-23S-5S顺序排列的rDNA转录单元。在大肠杆菌的7个rDNA转录单元中，有6个分布在染色体DNA的双向复制起点oriC附近。,有些细菌的rRNA基因转录单元中含有tRNA基因（tDNA）或其他基因。如一些根瘤菌的rRNA转录单元中基因的排列顺序为：16SrDNA-tDNA-23SrDNA-5SrDNA。16SrDNA、23SrDNA及它们之间的间隔序列现在都作为分类的现代研究方法，广泛应用到微生物的分类鉴定中。,(2)tRNA基因：tRNA的种类远比rRNA的种类多，一般原核生物有3040种tRNA。tRNA基因多数以基因簇的形式存在，它们簇集在染色体复制起点的附近，一般一个转录单元含有23个tRNA，同受一个启动子的控制。有些转录单元只含有一个tRNA基因。在大肠杆菌K-12中，有86个tRNA基因，形成43种转录单元。,所有生物的基因组中都存在重复序列。原核生物基因组中除了一些多拷贝基因，如rRNA基因、tRNA基因、插入团子IS等外，还存在有很多的重复序列，其中大多数是短重复序列，主要的重复序列有Rhs、REP、ERIC、Chi(位点）等。Rhs是大肠杆菌K-12中最大的重复序列，长度为5.79.6kb，它可以编码141kD的大蛋白，但不具已知功能，菌株比较表明可能是移动因子。,3.重复序列,基因外重复的回纹序列（repeatedextragenicpalinodrome,REP）是一段38bp的反向重复序列，它能形成一个稳定的茎环结构，一般位于多顺反子的转录单元之间的区域。它们在不同的菌株、种和属间具有高度的保守性，目前已证实在很多细菌中都有REP序列。REP序列与染色体结构的稳定性有关，并与染色体的重组有关。,肠杆菌基因间的重复一致序列（enterobacteriarepetitiveintergenicConsensus,ERIC）是一段长为126bp的反向重复序列，其特点与REP序列相似。普遍存在于细菌的基因组中，特别是肠杆菌群（enterobacteria）中，位于可转录的非编码区。Chi（5-GCTGGTGG-3）是大肠杆菌染色体的另一个重复序列，是易发生同源重组的位点，具有8个bp。平均5.5kb就有一个Chi位点，大肠杆菌K-12染色体上有1009个Chi位点。,由于短重复序列在原核基因组中的随机分布，因此短重复序列目前已广泛应用到分子生物学研究及生物指纹图谱的分析中,插入序列是大肠杆菌染色体的重要组成部分，如在K-12染色体上有IS1、IS2、IS3、IS4、IS5、IS150、IS186、IS30、IS600及IS911。它们的分布与rrn和Rhs相互补充，即在没有rrn和Rhs的DNA区域有IS。IS除插入失活外，还能引起染色体缺失、重复和倒位。转座子也是大肠杆菌染色体DNA的重要组成部分。,4.插入序列和转座子,大肠杆菌K-12除具有噬菌体外，还有一些缺陷性噬菌体和隐蔽原噬菌体，后两者都丧失了裂解生长和产生噬菌体粒子的基本功能。,5.噬菌体及其噬菌体残迹,根据基因的功能，将大肠杆菌的基因分为多个功能组,四、X174噬菌体的基因组,X174噬菌体是一种较小的噬菌体，只有T类噬菌体的1/4，呈20面体颗粒状。其DNA为单链环状，共有5386个核苷酸。X174噬菌体的DNA绝大部分用来编码蛋白质，不翻译出来的部分只占4%（217/5386），其中包括基因之间的间隔区和一些控制基因表达的序列。,X174噬菌体基因组的最显著特征是有基因重叠现象。噬菌体共有11个基因，基因B、基因K、基因E分别在基因A、基因C、基因D之中，但使用不同的阅读框架。基因A*虽然与基因A使用相同的阅读框架，但却在A基因中部才开始转录。类似的基因重叠现象也存在于其他噬菌体及某些真核生物的病毒中。,五、真核生物的基因组及其特点,1)基因组的分子量大：低等真核生物大约107108bp（比细菌大10倍以上），而高等真核生物达到51081010bp，有些植物和两栖类可达1011bp，哺乳动物大于2109bp，它们可以编码100万个基因。,真核生物基因组的结构特点,真核生物基因组与原核生物有很大的差异，真核生物基因的结构、基因表达的过程、表达调控等方面都远比原核生物复杂。它主要有如下几个特点。,4)基因组有大量不编码蛋白质的序列。真核生物基因组的最大特点是它含有大量的重复序列，而且功能DNA序列大多被不编码蛋白质的非功能DNA所隔开。,5)真核生物的蛋白质编码基因往往以单拷贝形式存在。功能相关的基因一般不以操纵子的形式存在。,3)核基因组DNA存在于细胞核内，由于核膜将细胞分隔成细胞核和细胞质，在基因表达中转录和翻译的位置是分隔的，不偶联的。,2)真核生物往往有很多条染色体，一般呈线性。每个染色体的DNA又具有很多复制起点。细胞核DNA与蛋白质稳定地结合成染色质的复杂结构。,1)非重复序列（单一序列）：是指在一个基因组中，这些序列一般只有一个或几个拷贝，它占DNA总量的40%80%。如牛细胞中占55%，小鼠中占70%，果蝇中占79%。不重复序列长约7502000bp，相当于一个结构基因的长度。实际上，大多数结构基因都属于不重复序列，也就是说是单拷贝的。,2.真核生物基因组中的DNA序列特征,真核生物细胞中DNA序列大致可分为非重复序列、中度重复序列和高度重复序列3类：,2)中度重复序列：重复次数为几十次到几千次，占总DNA的10%40%。各种rRNA、tRNA、可移动基因、重复序列家族以及某些结构基因如组蛋白基因等都属于这一类。,3)高度重复序列卫星DNA：这类