茶树油、丁香酚和柠檬醛对荔枝黑曲霉的抑制作用

基础研究 食 品 科 学 2 0 1 2 ， V o 1 3 3 ， N o 1 1 2 1 茶树油、丁香酚和柠檬醛对 荔枝黑曲霉的抑制作用 钟业 俊 ，徐欣源 ，刘成梅 一，孙健 z ，吴建永 ，刘桃 英 ( 1 南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 3 3 0 0 4 7 ； 2 广西农业科学院农产品加工研究所，广西 南宁 5 3 0 0 0 7 ) 摘 要：研究茶树油、丁香酚和柠檬醛的挥发性香氛对荔枝致腐真菌黑曲霉的抑制作用，采用复配方法探究 3种 香料对黑曲霉的协同抑菌性。结果表明：丁香酚和柠檬醛的挥发性香氛对黑曲霉有较强的抑制作用，最低抑菌浓 度分别为0 - 3 g t L c m3 和0 4L I L c m3 ；茶树油挥发性香氛抑制黑曲霉的作用稍差，但与丁香酚和柠檬醛复配后协同抑 菌 作 用 增 强 。 关键词 ：茶树油；丁香酚；柠檬醛；黑 曲霉；抑菌作用 I n h i b i t o r y Ef f e c t s o f Te a Tr e e Oi l Eu ge n o l a n d Ci t r a 1 o n As pe r g i l l u s n i ge r i n Li t c h i Z HONG Y e q u n ，XU Xi n y u a n ，L I U C h e n g me i 一，S UN J i a n ，wu J i a n y o n g ，L I U T a o y i n g ( 1 S t a t e Ke y La b o r a t o r y o f F o o d S c i e n c e a n d T e c h n o l o g y ， Nanc h a n g Un i v e r s i t y ， Na n c h a n g 3 3 0 0 4 7 ， Ch i n a ： 2 I n s ti t u t e o f Ag r o f o o d S c i e n c e a n d T e c h n o l o g y ， Gu a n g x i Ac a d e my o f A g r i c u l t u r a l S c i e n c e s ， N a n n i n g 5 3 0 0 0 7 ， C h i n a ) Ab s t r a c t ： Th e i n h i b i t o ry a n d s y n e r g i s ti c i n h i b i t o r y e ffe c t s o f v o l a t i l e a r o ma t i c c o mp o n e n t s f r o m t e a fl e e o i 1 e u g e n o l a n d e i t r al o n r o t - c a u s i n g f u n g i s u c h a s As p e r g i U u s n i g e r i n l i t c h i we r e s t u d i e d Th e r e s u l t s s h o we d t h a t the v o l a t i l e a r o ma t i c c o mp o n e n t s f r o m e ug e no l an d c i t r a l h a d s t r on g i nh i bi t o r y e ffe ct on As pe r g i Uu s ni ge r wi th mi ni mu m i n hi tio n c o nc e n t r a tio ns of 0 3 p c m3 ( a i r v o l u m e ) a n d 0 4 g t L c m3 ( a ir v o l u me ) ， r e s p e c ti v e l y T h e anti f u n g a l e f f e c t o f t e a tr e e o i l w a s w e a k ， wh i l e i t s i nhi b i t o r y e ff ect c o u l d b e e nh an c e d i n the a t t e n d a n c e o f e u g e n o l an d c i t r a 1 Ke y wo r d s ： t e a t r e e o i l ； e u g e n o l ； c i t r a l ；As pe r gi l l u s n i g e r ； b a c t e r i o s t a s i s 中图分类号：T S 2 0 1 6 文献标识码：A 文章编号：1 0 0 2 6 6 3 0 ( 2 o 1 2 ) 1 1 - 0 0 2 1 04 由于荔枝果 实特殊 的形态 生理结构 ， 以及在盛夏 高温季 节成熟等 原 因，采 后真菌 的繁殖生长 是导致荔 枝在存贮 运输期 间腐烂变质 的重要原 因 ，而 一般化学 保鲜剂 由于具有不 安全 因素，已经造成人们 的恐惧和 抵触 ，作为替代的天然保鲜剂则受 到越来 越多的关注 。 香 辛 料来 源 于 植物 的种 子 、花 蕾 、 叶茎 、根块 等 ，具有特殊 的生理药 理作用 ，其中一部 分还有抗菌 防腐作用。T h y a g a r a j a 等 2 1 研究发现香辛料 的乙醇提取 物对致腐真菌如 曲霉 、根霉 、毛霉有较强 的抑制效果 。 We e r a k k o d y等【 3 j 研 究高 良姜、藤黄 、山胡椒等 的体外 抑菌实验时发现香料 的抑菌效果与其在溶剂 中的溶解性 呈正相关 。C e r r u t t i 发现香草醛对苹果皮表面致腐酵 母菌的生长有抑制作用，并有助于延长苹果的保质期 。 Ni e l s e n等_ 5 1 发现香料精油对面包致霉微生物具有很明显 的抑 制作用 。此外 ，朱玉生 、吴克 刚 等利用香辛料 与致腐 真菌直接接 触 ，取 得 了较好 的抑菌效果 。张宽 朝等【 8 研究发现 ，直接用香料挥发 出来的香氛进行抑菌 简便 易行 ，可以避免 由于香料疏水性导致 的涂膜分布不 均 、抑 菌效果下 降的现象 ，且香氛抑 菌并不直 接接触 果蔬 表 面 ，安 全 可靠 。 本 实验 以茶树油 、丁香酚和柠 檬醛为抑菌 剂，研 究其 挥发性 香氛对 导致荔枝腐烂 的黑 曲霉 的抑菌效果 ， 以及 3种抑菌剂的协同增效作用，以期为挥发性香料用 于荔枝 保鲜提供 参考 。 收稿 日期 ：2 0 1 1 0 7 0 4 基金项目：广西科学研究与技术开发计划项目( 桂科攻 1 0 1 0 0 0 0 9 2 ) 作者简介：钟业俊( 1 9 8 2 -) ，男，助理研究员，博士，研究方向为食品科学。E ma i l ：z h o n g y u n n c u e d u c n $通信作者：刘成梅( 1 9 6 3-) ，男，教授，博士，研究方向为食品科学。E- ma i l ：c h e n g me i l i u y a h o o c o m c n 2 2 2 0 1 2 ， C o 1 3 3 ， N o 1 1 良 品 科 学 基础研究 1 材料 与 方法 1 1 材料与试剂 荔枝黑曲霉( A s p e r g i l l u s n i g e r ) 由南昌大学中德食 品 工程中心 自 腐烂荔枝果实上挑取少量病原菌孢子 9 J 经连续 稀释法分离筛选 1 O 】 得来。使用的培养基为马铃薯葡萄糖 琼脂培养基( P DA ) 以及查 氏酵母膏琼脂培养基( C Y A) C l 。 通 过对该菌株 菌落及菌体 的形态学观 察 ，根据 中国 真菌志 曲霉属及其相关有性型 1 1 】 以及 I d e n t i f i c a t i o n o f C o mm o n A s p e r g i l l u s S p e c i e s ) t 】 对分离出来的病原菌 进 行 分类鉴 定 ，符合 黑 曲霉特 征 。 丁香酚( 纯度9 5 ，批号 1 1 0 7 2 5 2 0 0 6 1 0 ) 、柠檬醛 ( 纯度 9 5 ，为其异构体栊牛儿醛( g e r a n i a 1 ) I 橙花醛 ( n e r s a 1 ) 的混合物，相对密度 0 8 9 3 ( 2 5 ) ，沸点2 2 8 2 2 9 ， 批号 1 1 3 8 9 8 2 0 0 9 1 2 ) 上海恒远生物科技有限公司 。 茶树油( Me l a l e u c a a l t e r n if o l i a ) ，无色液体，采用湛 江 市麻章区种植的白干层树，2 0 1 0 年 l 0月经中国热带农 业科学院农产 品加工研究所提取获得 ，各项指标均达到 国际标准 I S O4 7 3 0 1 9 9 6 白干层萜品醇油( 茶树油) 要求 。检出主要技术指标 ：异松油烯 3 8 3 、1 8 一 桉叶 素4 6 3 、 松油烯 1 0 4 2 、 ， 一 松 油烯 2 0 2 6 、对伞 花烃 2 3 4 、松油烯醇 4 3 5 6 2 、 。 松油醇 2 9 7 、葶 烯 1 6 4 、桧烯0 3 6 、香树烯 1 0 2 、 杜松烯0 6 4 、 蓝桉醇0 5 8 、绿花白干层醇 0 2 5 、 一 蒎烯 2 8 6 ；2 0 时折光指数 1 4 8 ，相对密度 0 8 9 0 ，旋光度 7 4 5 。 。 1 2 方法 1 2 1 培养基 的制各 采用马铃薯葡萄糖培养基( P DA培养基) 。称取去 皮洗净后的新鲜土豆 2 0 0 g ，加水 8 0 0 mL煮沸至土豆煮透 煮烂，此过程大约 2 0 3 0 mi n 。4层纱布过滤，取滤液。 向滤液中加入 3 0 0 m L蒸馏水 、2 0 g 葡萄糖 ，搅拌均匀后 继续加热煮沸 。称取 2 0 g琼脂 ，用剪 刀剪成小块后加入 沸腾 的滤 液中 ，同时不断用玻璃 棒进行搅拌 ，促进琼 脂溶解 均匀并防 止结底 。待全 部溶解后 分装入锥 形瓶 中 ， 灭 菌 备 用 。 1 2 2 霉菌菌饼 的制备 选用直径为 9 c m的无菌培养皿，倒入经高温灭菌的 P DA培养基 ，制成平板 。待冷凝后用 黑曲霉孢子 的生 理盐水悬浮液进行涂布 。3 0 培养 7 2 h ，使菌丝均匀生 长。用直径为 5 m m 的打孔器在上述长满菌丝的培养基上 打孔 ，切下带菌 培养基制取菌饼备 用 。 1 2 - 3 菌饼 的移植 准备直径 9 c m 的洁净无菌培养皿，倒入等量无菌 P D A培养基，立即将制备好的菌饼用挑针挑取后菌丝面 向上放置在培养 皿的 中央 ，待培养基 完全冷凝 后 ，将 培养 皿倒 置于无菌操作 台上。 1 2 4 单一香料挥发气氛对黑曲霉的抑制实验 倒有 P DA培养基的培养皿 内部体积基 本一致 ，约 为 3 0 c m， 。 由此进行实验设计 ，考 察茶树油 、柠檬 醛 和丁香酚浓度对黑 曲霉抑制 的影响，分为 3个实验组 ： 1 ) 分别加入 3 、6 、1 2、1 8 L茶树油 ，即茶树油的浓 度对应为 0 1 、0 2 、0 4 、0 6 B L c m3 ( 以空气体积计算， 下 同) 。2 ) 分别加入 3 、6 、9 、1 2 L柠檬 醛 ，对应浓 度 为 0 1 、0 2 、0 3 、0 4 u L c m 。3 ) 分别加入 3、6 、 9 、1 2 L丁香酚，对应浓度为0 1 、0 2 、0 3 、0 4 p L c m3 。 1 2 5 抑菌率的测定 采用茵丝生长速率抑菌率法【 9 作为抑菌效果的评价 指标。将香料溶液均匀添加到无菌棉纸( 5 5 m m 6 5 ram ) 上，迅速贴于移植 了菌饼 的培养皿 盖上 ，不接触培 养 基 ，置于 3 0 恒温培 养箱中培养 ，每天按照十字交 叉 法测量 菌饼直径 ，计算 生长量和抑 菌率l 9 1 ，实验重 复 3次，取平均 值 。对 照组 不添加任 何香料 ，其他操 作 一 致 。 纯生长量 ， c m2 =菌落的平均面积一菌饼面积 ( 1 ) 对照组纯生长量一处理组纯生长量 抑菌率 =1 0 0( 2 ) 对照组纯生长量 1 2 6 单 一香料挥发气氛 的最低抑菌浓度和 最低 杀菌 浓度 实验进行 到第 5天 时，观 察含有香料香 氛 的培养 皿 ，以菌 丝纯生长量 为 0的培 养皿中含有 的香料最 低 浓度 作为该香料挥 发气氛 的最低 抑菌 浓度 ( CM I c ) 。挑 取 上述菌丝纯 生长量为 0的培 养皿 中的黑 曲霉孢 子接 种 到 空 白 P DA 培养 基 中继续 培 养 5 d后 ， 以完全 没 有菌生长 的最低浓度 作为该香 料挥发 气氛 的最低 杀菌 浓 度( CM B C ) 。 1 2 7 香料挥发性香氛的协同抑菌实验 采用 L ( 3 3 ) 正交试验设计 ，研究茶树油 、丁香酚和 柠檬醛的香料配比对挥发性香氛抑菌性的影响。香料液 的复配 比例按因素水平表进行 ，混合后用涡旋振荡器进 行充分混匀，分别取 6 L 混合香料液( 即 0 2 p L c m ) 添 加到 P DA培养皿中，添加方法同 1 2 5节。 1 2 8 数据分析和处理 采用方差分析( A NO V A ) 在 5 置信度下比较香料配 比对抑菌效果 的影响 ，实验重复 3次 ，结果用 “ ” 表 示 。 2 结 果与 分 析 2 1 不同香料的挥发性香氛对荔枝黑 曲霉的抑制作用 基础研究 食 品 科 学 2 0 1 2 ， V o 1 3 3 ， N o 1 1 2 3 图 1 茶树油浓度对 黑 曲霉菌 丝生长 的影响 F i g 1 E ff e c t o f t e at r e e o i l c o n c e n t r a ti o n o nth e g r o w t h 0 f 山 r 暮 埘 喇 仃 采用菌丝生长速率抑菌率法检测不同香料的挥发性 香氛对黑 曲霉菌丝生长 的抑菌率。 由图 1 可知，培养 1 d 后，0 1、0 2、0 4、0 6 L c m 茶树油的抑菌率分别 为 7 8 7 、8 8 0 、9 1 6 、9 9 1 ，表明茶树油对黑 曲霉 的抑制有 浓度依赖性 ，浓 度越高 ，初始抑菌率越 高 ；而 随着培养 时间延长抑菌率逐渐 降低 ，第 5天 时， 0 1 、0 2 、0 4 、0 6 t L c m 3 茶树油的抑菌率分别为 2 0 1 、 2 1 7 、3 3 7 、3 4 6 ，表 明茶树油挥发性香氛对黑 曲霉 的抑制效果持续性 不长 。 图2 柠檬 醛浓度对黑 曲霉菌丝生长的影响 Fi g 2 Effe c t o f c i t r a l c o n c e nt r a t i o n o n t he g r o wt h 0 t As p e r g 硼us n i g e r 由图 2可知 ，柠檬醛挥发性香氛对黑曲霉有较好的 抑制作用 。当柠檬醛浓度为 0 1 L c m3 时，第 1 天对黑 曲霉的抑菌率达到 1 0 0 ，第 2天开始抑菌率逐渐下降， 第 5天时为 6 4 8 。0 2la L c m。 的柠檬醛在前 2天都可以 完全抑制黑 曲霉，第 3天开始抑菌率缓慢下 降，第 5天 时为 8 9 1 。0 3 la L c m3 的柠檬醛在第 4天开始未达到对 黑曲霉的完全抑制 。浓度为 0 4 t L c m3 时则实验期间抑 菌率均 为 1 0 0 。 图 3 丁香酚浓度对黑 曲霉菌丝生长的影 响 Fi g 3 Effe c t o f e u g e n o l c o n c e n t r a t i o n o n t h e g r o wth o f As pe r g i l l u s n i g e r 由图 3可知，丁香酚的挥发性香氛对荔枝黑曲霉的 抑菌率在这 3 种抑菌剂中最高，当丁香酚浓度为0 2 la I - , c m 3 时，实验第 4天才观察记录到有菌丝的生长 ，第 5天时 抑菌率为9 2 1 ；而 0 3 t L c m3 的丁香酚实验期间完全抑 制 黑 曲霉的生 长 。 2 2 不同香料挥发性香氛的 C c 和 C e c 分析 实验对不同香料挥发性 香氛抑制黑 曲霉的 C M t c 和 C 进行检测和分析。茶树油在 0 1 0 6 t L c m 浓度范 围未检测到 C M c 和 C n c 值；丁香酚 0 2 l a L c m。 浓度时在 实验的第 4 天观察到菌丝增长 。当丁香酚为0 3 l a L c m 和 0 4 la L c m 浓度时，在实验期间都没有菌丝增长 ；将这 两组菌饼上的孢子接种到 P D A培养基中连续培养 5 d 后 ， 发现霉菌孢 子均没有萌发迹象，表 明丁香酚的最低抑菌 浓度和最低灭菌浓度均为 0 3 l a L c m， ；柠檬醛在本次实 验检测中 C M i c 和 C B c 均为 0 4 L c m 。 2 3 香料的协 同抑菌实验 利用 L ( 3 3 ) 正交表进行试验设计 ，探讨茶树油、柠 檬醛和丁香酚挥发性香氛 的协同抑菌性，因素水平及结 果 见表 1。 表 1 正交试验及其结果分析 Ta bl e 1 Re s u l t s a n d a n a l y s i s o f O r t h 0 g 0 n a l t e s t s 由表 1 可知，各个香料添加量对抑菌率 的影响大小 为 ：茶树油浓度丁香酚浓度 柠檬醛浓度，最佳配方 为A s B C 3 ，即茶树油、柠檬醛、丁香酚浓度 比为 1 ： 1 ： 1 。 为进一步判断上述三 因素对正交试验 结果的影响是否存 在 ，将 正交试验 数据进 行方 差分析 。 由表 2可 知，当可信度 为 9 5 ，误差所在列为 因 素 ( 柠檬醛浓度) 时，因素A( 茶树油浓度) 和因素 c ( 丁香 酚浓度) 对抑菌率 的影 响显著 ，表 明茶树油和丁香酚 的 含量对复配香料液 的抑菌性起主要作用。 2 4 2 0 1 2 ， V o 1 3 3 ， N o 1 1 食 品 科 学 基础研究 表 2 方差分析 T a b l e 2 Va r i a n c e a n a l y s i s 注： 差异显著( PO 0 5 ) 。 对复合香料的最佳配 比进行验证 ，实验重复 3次 ， 得到的黑曲霉抑菌率分别为 9 7 8 、9 8 5 、9 7 7 ，其 平均值为 9 8 0 ，R S D值为 0 4 。验证实验 的结果表 明，复合香料 中茶树油 、柠檬 醛 、丁香酚 的浓度 比为 1 ： 1 ： 1 时，0 2 L c m 的挥发性香氛抑制黑曲霉效果明显， 第 5天 时抑菌率 为 9 8 ，高于茶树油 、柠檬醛 、丁香 酚单独使用 时的 2 1 7 、8 9 1 、9 2 1 ，可见 3种香 料 具有 明显的协 同增效作用 。 3 结 论 将具有抗菌作用的植物作为抗菌药物使用 已有很长 的历史，部分植 物精油 的抗菌特性也 已被人们所认 知。 茶树油是 由桃金娘科 白干层属灌木树种互叶 白干层的新 鲜枝叶经过水蒸气蒸馏得到的挥发性芳香精油 。近年 来对茶树油的研究表明，茶树油具有 良好的抗真菌【 】 活 性 ，温和无刺激 1 6 1 ，美国已经批准 茶树 油作为食 品香 料使用 ，F E MA 号为 3 9 0 2 9 。丁香酚和柠檬醛都为单离 食用香料，分别分离 自 常用的食用香料丁香和柠檬草 1 7 。 丁香酚( 4 烯丙基 2 。 甲氧基苯酚) 是丁香挥发油中的主要 成分 ，为有 机酚类 ，具有较 好的挥 发性 ，可 以作用 于 微生物细胞膜 的蛋 白质和脂质 ，对真菌具有较强的抑制 作用 1 8 。柠檬醛是柠檬草挥发油和 山苍子挥发油中的主 要成分 1 9 】 ，有破坏真 菌质膜 的作用 ，在食 品、医疗 卫生领域 的应用显示其对真菌有较好 的抑制效果。 本实验中，茶树油挥发性香氛在 0 1 0 6 p L c m s 的 浓度范围内对荔枝黑 曲霉的抑菌效果持续性稍差。丁香 酚和柠檬醛 的挥发性香氛对黑 曲霉有较强的抑制和杀灭 作用 ，c M I c 分别为 0 3 B L c m 和 0 4 t L c m，C M e c 分别 为0 3 L c m 3 和 0 4 L c m 3 。茶树油与丁香酚和柠檬醛复 配后 协同抑菌作用显 著增强 ，且效果持久 ； 当复合 香 料 中茶 树油 、柠檬醛 、丁 香酚 的浓度 比为 1 ： 1 ： 1时 ， 0 2 t L c m3 的挥发性香氛抑制黑 曲霉效果明显，第 5天 时抑菌率 为 9 8 ，高于相 同浓度 的茶树油 、柠檬 醛、 丁香酚单独使 用时抑菌率 。 参 考 文 献 ： F ALL I K E， GRI NBERG S ， GAM BOURG M，e t a 1 Pr e s t o r a g e h e a t t r e a t me n t r e d u c e s p a tho g e n i c i t y o f Pe n i c i l l i u m e x pa n s u m i n a p p l e f r u i t 【 J 1 P l a n t P a tho l o g y ， 1 9 9 6 ， 4 5 ( 1 ) ： 9 2 - 9 7 THYAGARAJ AN HOS ONOA Eff e c t o f s p ic ee x tr a c t o nf u n g a l i n h i b i ti o n J L e b e n s mi t t e l - Wi s s e n s c h a f t u n d - T e c h n o l o g i e ， 1 9 9 6 ， 2 9 ( 3 ) ： 2 8 6 2 8 8 W E ERAKKODY N S ，CAF F I N N， TURNER M S ，e t a 1 i n v i t r o a n t i mi c r o b i a l a c t i v i t y o f l e s s u t i l i z e d s p i c e a n d h e r b e x t r a c t s a g a i n s t s e l e c t e d f o o d - b o rne b a c t e r i a J F o o d C o n t r o l , 2 0 1 0 ， 2 l ( 1 0 ) ： 1 4 0 8 1 4 1 4 C ERRUT T I P ALZAM ORA S M I n h i b i t o r y e f f e c t s o f v a n i l l i n o n s o me f o o d s p o i l a g e y e a s t s i n l a b o r a t o ry me d i a a n d f r u i t p u r e e s J 】 I n t e rna t i o n a l J o u r n a l o f F o o d Mi c r o b i o l o g y ，1 99 6 ， 2 9 ( 2 ) ： 3 7 9 3 8 6 NI EL SE N P V， RI OS RI n h i b i t i o n o f f u n ga l g r o wt h o n b r e a d b y v o l a ti l e c o mp o n e n t s f r o m s p i c e s an d h e r b s ， an d the po s s i b l e a p p l i c a ti o n i n a c t i v e p a c k a g i n g ， wit h s p e c i a l e mp h a s i s o n mu s t a r d e s s e n ti a l o i l J I n t e rna t i o n a l J o u ma l o f Fo o d Mi c r o b i o l o g y ， 2 0 0 0 ， 6 0( 2 ) ： 2 1 9 2 2 9 朱玉生， 钟连招， 朱玉国， 等天然植物荔枝 、龙眼保鲜剂及其应 用： 中国， 1 5 8 6 2 3 1 A P 2 0 0 5 0 3 0 2 吴克刚， 柴 向华 用丁水果保鲜的香辛料精油组合物的配制及其使 用方法： 中国， 1 0 1 0 6 6 0 6 9 A P 】 2 0 0 7 - 1 1 - 0 7 张宽朝， 魏练甲，沈浩， 等肉桂醛 、柠檬醛抑制黑曲霉生长的比 较研究【 J 1 中国微生态学杂志， 2 0 1 l ， 2