基因工程绪论

,基因工程,考核方式,平时课堂提问、作业、考勤占30%期中考试占10%期末考试占60%，闭卷考试。,问题：生物之所以体现出各种形态是基因表达的结果，各种生物间的性状千差万别是为什么呢？例：青霉菌能产生对人类有用的抗生素青霉素豆科植物的根瘤菌能利用空气中的氮气人的胰岛B细胞能分泌胰岛素调节血糖的浓度结论：这些都是基因特异性表达的结果问题：人类能不能改造基因呢？能不能使本身没有的某个性状的生物具有某个特定性状呢,历史回顾,乳汁中含有人生长激素的转基因牛(阿根廷),转基因动物,绿色萤光蛋白(greenfluorescentprotein),简称GFP,这种蛋白质最早是由下村修等人在1962年在一种学名Aequoreavictoria的水母中发现。其基因所产生的蛋白质,在蓝色波长范围的光线激发下,会发出绿色萤光。,基因工程产品,1996年7月5日由罗斯林研究所的伊恩威尔穆特教授等人通过体细胞克隆法培育问世，是世界上首只成年体细胞克隆动物。世界上第一只成年体细胞克隆羊“多利”,基因工程学课程内容,DNA重组的载体DNA体外重组重组DNA的转化与扩增转化子的筛选与重组子的鉴定目的基因的克隆大肠杆菌基因工程酵母基因工程高等动物基因工程高等植物基因工程第二代基因工程第三代基因工程,DNA重组克隆的单元操作,基因工程的基本概念,1基因工程的基本定义2基因工程的基本过程3基因工程的基本原理4基因工程在生物工程中的地位,常见混用名称,基因工程(geneengineering)常和以下名称混用:遗传工程(geneticengineering);基因克隆(genecloning);分子克隆(molecularcloning);基因操作(genemanipulation);重组DNA技术(recombinationDNAtechnique)克隆(clone):作名词时指含有某目的DNA片段的重组DNA分子或含有该重组分子的无性繁殖系.作动词时是指基因的分离与重组过程。,基因工程的基本过程,1工程菌（细胞）的设计构建2基因产物的生产,切,接,转,增,检,基因操作的过程（切）,1.基因的剪刀限制性内切酶（限制酶）,一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的切割点上将DNA分子切断。目前已发现的限制酶有200多种。,从供体细胞中分离出基因组DNA，用限制性核酸内切酶分别将外源DNA和载体分子切开。,重播,DNA被限制酶切断后有两个反向互补的“黏性末端”。被同一种限制切断的几个DNA具有相同的黏性末端，能够通过互补进行配对。,、基因操作的过程（连）DNA连接酶,连接酶的作用是：将互补配对的两个黏性末端连接起来，使之成为一个完整的DNA分子。,重播,用DNA连接酶将含有外源基因的DNA片段接到载体分子上，构成DNA重组分子。,3、基因操作的过程（转）运载体,借助于细胞转化手段，将DNA重组分子导入受体细胞中。,4、基因操作的过程（增）转化细胞,短时间培养转化细胞，以扩增DNA重组分子或使其整合到受体细胞的基因组中。细菌培养昆虫细胞培养植物组织培养高等动物细胞培养扩增重组分子或整合重组分子到受体细胞的基因组,5、基因操作的过程（检）筛选鉴定转化细胞,筛选和鉴定转化处理的细胞，获得外源基因高效稳定表达的基因工程菌或细胞。PCR鉴定目的基因抗生素筛选标记报告基因显色筛选,1965年，阿尔伯首次从理论上提出了生物体内存在具有切割基因功能的限制性内切酶。并于1968年成功分离出I型限制性内切酶，但这种酶的切割基因功能不理想。1970年，美国分子生物学家、遗传学家HO史密斯（1931）分离出了II型限制性内切酶。1971年，美国微生物遗传学家D内森斯（1928）使用II型限制性内切酶，首次完成了对基因的切割。,切,接,现代基因工程的创始人P伯格（1926）在1960年以敏锐的科学预见力提出一个大胆的设想：是否可以创造出一种人工方法，把外界的遗传基因引入动物体内，实现DNA重组，以达到改变遗传性状和治疗某些疾病的需要呢？,基因工程的研究意义,1第四次工业革命2第二次农业革命3第四次医学革命,中国已经批准进入大田的转基因植物,转黄瓜抗青枯病基因的甜椒,生长快、肉质好的转基因鱼(中国),乳汁中含有人生长激素的转基因牛(阿根廷),胰岛素从猪、牛等动物的胰腺中提取，100Kg胰腺只能提取4-5g的胰岛素，其产量之低和价格之高可想而知。,将合成的胰岛素基因导入大肠杆菌，每2000L培养液就能产生100g胰岛素！使其价格降低了30%-50%!,从人血中提取干扰素，300L血才提取1mg！,通过基因工程的方式创造了能合成人干扰素的大肠杆菌，每1Kg的培养液可提取204mg干扰素,人造血液及其生产,4基因工程与环境保护,环境监测：基因工程做成的DNA探针能够十分灵敏地检测环境中的病毒、细菌等污染。,1t水中只有10个病毒也能被DNA探针检测出来,环境污染治理：基因工程做成的“超级细菌”能吞食和分解多种污染环境的物质。,通常一种细菌只能分解石油中的一种烃类，用基因工程培育成功的“超级细菌”却能分解石油中的多种烃类化合物。有的还能吞食转化汞、镉等重金属，分解DDT等毒害物质。,但是，就在我们为扮演了上帝造物主的角色而沾沾自喜之时，一片阴云也袭上人们的心头：我们在干预具体某一生命过程的同时，是否也破坏了生命世界应有的和谐与秩序？,附1：推荐用参考书与杂志基因工程原理第二版上下册吴乃虎科学出版社分子生物学与基因工程习题集王金发等科学出版社PrincipleofGeneManipulation（影印版）Sixthedition高等教育出版社基因工程概论张惠展，华东理工大学出版社生物化学与分子生物学进展中国生物化学与分子生物学学报等等,附2：小综述推荐内容和写作要求1.每人从中任意选择一个大题目（也可以自己另选一个题目），或在大题目下自己立一个分题目，但不能与其他人重复。2.每个题目都要写出原理、产生、发展历史、现状、发展趋势、理论或实践意义。3.提倡手写。最好是幻灯片形式（也可以是文本格式）。,附3：推荐综述大题目1.单色和多色荧光原位杂交（FISH）2.RNA干扰（RNAi）及其应用3.生物芯片（chip）4.基因扩增（PCR）5.基因库（genebank）及序列的查询和分析6.DNA测序7.酶联免疫吸附测定（ELISA）8.遗传病的基因治疗9.噬菌体展示（phagedisplay）,10.酵母双杂交及其衍生系统11.基因疫苗12.基因打靶（genetargeting)13.随机多肽文库（RPLs）14.转基因植物14.转基因植物15.转基因动物16.定点突变17.细菌表面呈现（Bacterialsurfacedisplay）18.动物克隆19.胚胎干细胞（ESC）,20.差异显示21.内含肽（intein）及其应用22.限制性内切梅23.基因工程载体24.生物软件及其使用25.基因工程相关的网站26.人类基因组计划（HGP）27.基因工程产物的纯化策略（载体）28.基因工程对中国经济的影响,29.发达国家中的基因工程发展及现状30.基因工程的社会安全及伦理问题31.制作基因工程网站32.目前流行的传染性疾病的基因工程治疗思考33.核糖体展示技术（ribosomedisplay）,国内知名专家和单位,中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所复旦大学生命科学院遗传所上海生物工程研究所中国科学院遗传发育研究所扬州大学农学院西北农林大学畜牧兽医学院南京工业大学贺林院士曹雪涛院士杨胜利院士欧阳平凯院士,基因工程学习之分子生物学基础知识,基因表达调控,1基因表达的概念及调控特点2启动子调控模型3操纵子调控模型4感受应答调控模型5RNA结构调控模型6RNA剪切编辑调控模型,RegulationofGeneExpression,基因工程三大要素之一受体细胞,基因工程三大要素之一供体片段,基因工程三大要素之一载体片段,供体进入受体的几种方式,1、Conjugation中文翻译为“结合”2、Transformation中文翻译为“转化”3、Transfection中文翻译为“转染”4、Transduction中文翻译为“转导”5、Infection感染,1基因表达的概念及调控特点,A基因表达的概念,基因表达(geneexpression)是指基因经过转录、翻译，产生具有特异生物学功能的蛋白质分子的过程。基因表达可分为组成性表达和受调控表达两种形式。,影响蛋白质浓度的七个环节,基因表达的调控元件,复制阶段转录阶段翻译阶段,基因表达的调控元件,1基因表达的概念及调控特点,B基因表达调控的特点,基因的表达调控具有时空两重性,基因表达调控的生物学意义,基因表达调控的模式复杂性,按功能需要，某一特定基因表达的先后次序及相对强弱严格受时间的控制，称为基因表达的时间特异性(temporalspecificity),基因表达调控具有时空两重性,某种基因产物在个体生长过程中按不同组织、细胞乃至细胞器的空间顺序出现，称为基因表达的空间特异性(spatialspecificity),基因表达调控的模式复杂性,基因表达调控环节众多，其中转录调控是关键.真核生物与原核生物相比的基因表达调控范围要大基因表达调控元件可分为核酸和蛋白质两大类基因表达调控实质是两者之间的相互作用，包括核酸分子内或分子间的相互作用、核酸和蛋白质之间的相互作用、蛋白分子内或分子间的相互作用,DNA的复制可被分为三个阶段，即复制起始、延伸和终止。每个DNA复制的独立单元被称为复制子（replicon），主要包括复制起始位点（Origineofreplication）和终止位点（terminus）。原核生物的整个染色体上一般只有一个复制起始位点。,DNA复制起始位点和复制子的结构,大肠杆菌DNA的复制需要有20种左右的酶和蛋白质因子参与，整个DNA复制机器被称之为DNAreplicasesystem或replisome。Helicase，任何DNA在被复制前都必须解开双链，这个过程是由helicase可在ATP的作用下将DNA母链不断解开形成单链。Topoisomerase，主要功能是消除DNA解链过程中所产生的扭曲力。DNA结合蛋白，使新解链的DNA保持稳定结构。Primases，为DNA复制提供RNA引物。DNApolymerases，合成新生DNA链，切除RNA引物。DNALigases，使新生DNA链上的缺口（3-OH,5-p）生成磷酸二酯键。,DNA复制起始位点和复制子的结构,大肠杆菌中的复制起始位点是OriC，全长245bp，该序列在所有细菌复制起始位点中都是保守的。,DNA复制起始位点和复制子的结构,启动子,促进DNA转录的DNA顺序，这个DNA区域常在基因或操纵子编码顺序的上游，是DNA分子上可以与RNApol特异性结合并使之开始转录的部位，但启动子本身不被转录。,原核生物的启动子,DNA-蛋白质相互作用范例,1.HTH型,(Helix-turn-helix),2.Zinc-finger蛋白,3.Homeodomain,4.Leucine-zipper,5.Helix-loop-helix,基因表达调控的生物学意义,适应环境、维持生长和增殖维持个体发育与分化调控程序上的缺陷或紊乱将导致严重后果,基因表达失控会导致严重后果,2启动子调控模型,A启动子的组成及功能B启动子的顺式增强作用C启动子的反式协同作用D启动子结构的多样性选择,2启动子调控模型,A启动子的组成及功能,启动子的一般特性,原核生物的启动子,真核生物的启动子,RNA聚合酶结合并启动转录的特异DNA序列,启动子的一般特性,序列特异性方向特异性位置特异性种属特异性,原核生物的启动子,(1)转录起始位点(2)Pribnow盒(3)Sextama盒(4)间隔区,典型的细菌启动子组成,真细菌RNA聚合酶的基本特性,核心酶与DNA有与DNA序列无关的松弛性结合真正识别启动子的是因子,因子和核心酶在转录中的循环,核心酶随机结合在DNA上,因子和核心酶结合,全酶对DNA松散部位的亲和力下降,全酶对启动子的亲和力增高,因子解离,核心酶合成RNA,合成终止核心酶释放,真核生物的启动子,根据所对应的基因编码产物可分为三类：,型启动子（rRNA基因）型启动子（mRNA基因）型启动子（tRAN基因）,真核生物的启动子,根据所对应的基因编码产物可分为三类：,型启动子（rRNA基因）型启动子（mRNA基因）型启动子（tRAN基因）,型启动子,核心启动子：紧邻转录起始位点，足以使转录起始上游控制元件（UCE）：-180至-107处能大幅增强转录效率,型启动子,内源性启动子：5SRNA和tRNA所属的启动子位于+55至+80外源性启动子：snRNA基因所属的启动子位于起始位点的上游,型启动子,基本区：转录起始子（Inr）以及TATA盒（Hongness盒）/替代序列辅助区：有多种保守序列组成，不同启动子中其位置、种类、拷贝数不同,哺乳动物RNA聚合酶II的启动子元件及其相应转录因子,基本区：确定转录起始点位置，以极低的水平启动转录辅助区：各保守序列通过与相应的基本转录因子作用而大大提高转录启动的频率，这些保守序列(如CAAT盒和GC盒等)作用具有双向性,3操纵子调控模型,A操纵子调控的基本原理B乳糖操纵子C色氨酸操纵子D-噬菌体的操纵子,A操纵子调控的基本原理,操纵子的组成及功能,操纵子的调控网络模式,典型的原核操纵子(operon)结构,操纵子调控的网络模式（1）,依据操纵子对新出现蛋白调节因子的响应机制可分为：负控制系统：没有调节蛋白因子存在时操纵子原本是开放的，调节蛋白因子的出现使该操纵子关闭。该调节蛋白因子称为阻遏蛋白，作用机制是与操作子结合阻止RNA聚合酶启动转录或与新合成的mRNA结合阻止核糖体启动翻译正控制系统：没有调节蛋白因子的存在时操纵子原本是关闭的，加入一种调节蛋白因子后即可使该操纵子开放。这种调节蛋白因子称为激活蛋白，它与操作子和RNA聚合酶作用，协助转录的启动。,操纵子调控的网络模式（2）,可诱导操纵子：小分子物质的出现使其由关闭状态进入开放状态，此过程叫做操纵子的诱导作用，该小分子物质叫做诱导物。在某些条件下，如调节蛋白编码基因突变时，可诱导操纵子会变得不可诱导；糖代谢利用操纵子多属此类可阻遏操纵子：小分子物质的出现使其由开放状态转入关闭状态，此过程叫做操纵子的阻遏作用，这种的小分子物质称为共阻遏物。在某些条件下使可阻遏操纵子无法去阻遏，这种现象称为超阻遏。氨基骸合成的操纵子多属此类,根据操纵子对具有调控基因表达功能的小分子物质的响应机制可分为：,B乳糖操纵子,乳糖操纵子的结构及性质,诱导物与阻遏蛋白的相互作用,阻遏蛋白与操纵子的相互作用,乳糖操纵子的正调控作用,乳糖操纵子的结构及性质,LacY,LacZ,没有乳糖存在时,阻遏蛋白与操纵子的相互作用,大肠杆菌lac操纵子上的对称序列,Lacrepressor(阻遏蛋白)与DNA的结合,lacoperon上共有三个repressor结合位点,有乳糖存在时,诱导物与阻遏蛋白的相互作用,C色氨酸操纵子,TrpR是一同源四聚体阻遏蛋白，色氨酸的结合可使其与操作子Otrp的亲和力提高几个数量级,阻遏蛋白TrpR与操作子Otrp的相互作用,Trp高于一定值时,Trp低于一定值时,O,P,trpR,调节区,结构基因,RNA聚合酶,RNA聚合酶,色氨酸操纵子,D-噬菌体的操纵子,-噬菌体的操纵子的组成及性质,-噬菌体溶原状态的建立与维持,-噬菌体溶菌状态的形成,-噬菌体溶原状态与溶菌状态的选择,噬菌体基因图谱：六大功能区域,四个操纵子结构,阻遏蛋白操纵子含结构基因cI，有两个启动子PRM(阻遏蛋白维持溶原状态)和PRE(阻遏蛋白建立溶原状态)，前者与宿主RNA聚合酶作用时还受到早期右向操纵子中的操作子OR的控制。cI基因编码cI阻遏蛋白，后者分别作用于早期左向操纵子和早期右向操纵子的操作子OL和OR，阻止转录启动早期左向操纵子由9个基因组成7个编码与重组有关的蛋白质，负责-DNA在宿主基因组中的位点特异性整合，另外两个基因cIII和N则与噬菌体的溶菌途经有关。该操纵子所属的启动子PL和操作子OL部分重叠。,早期右向操纵子由8个基因组成，包括3个编码调控蛋白因子的基因cro、cII和Q，两个噬菌体DNA复制基因O和P。该操纵子中的启动子PR和操作子OR在DNA序列上也部分重叠。晚期右向操纵子包括10个头部蛋白编码基因、11个尾部蛋白编码基因(AJ)以及3个负责裂解宿主细胞的溶菌酶类基因S、R和RZ，其所需启动子为PR。,增强子激活转录启动的机制,2启动子调控模型,B启动子的顺式增强作用,增强子的作用特点,增强子的作用机理,增强子的作用特点,由一组与启动子关系密切的DNA顺式调控元件组成，可增加真核/病毒启动子转录启动的频率,(1)组成增强子的各元件排列较为密集(2)它们分别是特定蛋白型转录因子的结合位点，其中有些位点是典型启动子结构中的共有元件(3)增强子的位置不固定，且其作用与方向性无关(4)组织特异性转录启动机制既可由启动子决定，也可能由增强子决定,增强子区域碱基突变对基因表达活性的影响,增强子的促进转录的工作原理,是邻近效应而非模板结构效应，即增加启动子邻近区域转录因子的浓度，增强子上的蛋白结合因子增加了它们与结合在启动子上的转录因子的相互作用机会。增强子尽管可作用于线性距离很远的启动子，但两者在DNA的空间结构中却是相邻的，两者之间的DNA链形成环状结构是必不可少的。,2启动子调控模型,C启动子的反式协同作用,I型启动子的转录启动程序,III型启动子的转录启动程序,II型启动手的转录启动程序,反式调控元件与RNA聚合酶,反式调控元件与RNA聚合酶,真核生物基因表达的顺式调控元件都是依赖众多特定蛋白因子的协同作用而工作的，后者统称为反式调控元件,分三类：1.基本因子参与所有启动子控制下的转录启动过程，在转录起始位点周围与RNA聚合酶形成复合物，确定转录的起始部2.上游因子识别转录起始位点上游的专一性短小保守元件的DNA结合蛋白，普遍存在于细胞内，活性不受其他蛋白因子控制，作用于所有含有合适结合位点的启动子，提高转录启动效率，并精确调控基因表达3.诱导因子其功能与上游因子相同，但具有可调控性，它们的合成或激活具有严格的时空特异性，使基因转录调控模式具备时空特异性,真核生物细胞核中的三种RNA聚合酶,I型启动子的转录启动程序,一、转录因子UBF1（上游结合因子）序列特异性地与I型启动子的核心启动子部分及其上游控制元件UCE结合；二、另一个转录因子SL1协同结合在UBF1紧邻的DNA链上,SL1本身对启动子区域无特异性，它对DNA的结合依赖于UBF1在启动子区域中的定位；三、一旦这两种辅助蛋白因子结合在DNA上的相应位点之后,RNA聚合酶I便与核心启动子结合，同时启动转录。,I型启动于所属的rRNA基因由RNA聚合酶I负责转录整个转录启动过程经历三个阶段：,整个转录启动过程需要两种蛋白转录因子,UBF1是一个单聚体蛋白，其特征是与I型启动子两大元件的GC丰富区专一性结合，它与RNA聚合酶I均可使用外源DNA模板有效工作。SL1的作用则有种属特异性。SL1由四种蛋白质组成的复合物，其一为TBP(TATA盒结合蛋白)，通过其空间构象作用于RNA聚合酶I，SL1的种属特异性来自其他二种蛋白组分。SL1在UBF1的协同下作用于启动子，为RNA聚合酶I在转录起始位点的准确定位提供了保证，实质上是一种定位因子。,III型启动子的转录启动程序,III型启动子所属的5sRNA、tRNA以及部分snRNA基因均由RNA聚合酶III责转录三种不同结构的III型启动子拥有不同的转录启动程序,5sRNA基因启动子：AC盒内源启动子tRNA基因启动子：AB盒内源启动子部分snRNA基因：外源启动子,AC盒内源启动子,TFIIIA先结合在包括C盒的DNA序列上,TFIIIB的结合是RNA聚合酶III定位在转录起始位点上的唯一前提条件。此时TFIIIA和TFIIIC已不再影响转录的启动。,然后指导TFIIIC与更远的下游序列作用,TFIIIC的结合保证了TFIIIB在转录起始位点附近序列上的准确定位,（TFIIIA和TFIIIC也称为装配因子）,（TFIIIB是因子式的定位因子）,AB盒内源启动子,TFIIIC识别B盒，但结合在A盒和B盒的整个区域上,TFIIIC的结合保证了TFIIIB在转录起始位点附近序列上的准确定位,TFIIIB的结合是RNA聚合酶III定位在转录起始位点上的唯一前提条件,（TFIIIB由TBP和其他