分子生物学实验2015.ppt

分子生物学实验,华中师范大学生命科学学院,实验目录,实验一植物基因组DNA提取及纯化实验二PCR克隆目的基因实验三PCR产物琼脂糖凝胶电泳实验四PCR产物凝胶回收实验五目的基因片段与载体连接实验六E.coliDH5和DE3感受态细胞制备实验七连接产物转化转化大肠杆菌实验八阳性单菌落筛选实验九重组质粒DNA提取实验十重组质粒及表达载体pET酶切分析与电泳实验十一目的片段回收及与表达载体连接实验十二连接产物转化DH5,质粒提取实验十三阳性质粒转化表达菌株BL21实验十四蛋白质的诱导表达及蛋白质样品制备实验十五SDS-PAGE检测诱导表达的蛋白质,实验一植物基因组DNA提取,基本原理1.基因组DNA的提取通常用于构建基因组文库、Southern杂交及PCR分离基因等。2.不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA的提取方法有所不同;不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异。3.在提取某种特殊组织的DNA时必须参照文献和经验建立相应的提取方法,以获得可用的DNA大分子。尤其是组织中的多糖和酚类物质对随后的酶切、PCR反应等有较强的抑制作用,因此用富含这类物质的材料提取基因组DNA时,应考虑除去多糖和酚类物质。,4.核酸是生物有机体中的重要成分，在生物体中核酸通常与蛋白质结合在一起，以核蛋白的形式存在。核酸分为DNA和RNA，在真核生物中，前者主要存在于细胞核中，后者主要存在于细胞质和核仁里。在制备核酸时，通过研磨破坏细胞壁和细胞膜，使核蛋白被释放出来。,5.植物基因组DNA的提取程序：（1）破碎组织（2）破坏细胞膜（3）去除杂质（4）沉淀基因组DNA,6.DNA的检测方法（1）紫外分光光度法（2）电泳检测DNA的质量,本实验是通过SDS法提取拟南芥基因组DNA。,1.通过SDS提取拟南芥基因组DNA;2.为从拟南芥基因组DNA克隆目的基因作准备,二实验目的,仪器及耗材：研钵、微量移液器及吸头、EP管、台式离心机。材料：拟南芥小苗试剂：DNAExtractBuffer(0.2MNaCl,25mMEDTA,0.5%SDS,pH7.5);70%乙醇；酚；氯仿；异丙醇;RNase,仪器、材料和试剂,实验步骤,1.取一定量的拟南芥组织;2.加入600l抽提缓冲液（0.2MNaCl,25mMEDTA,0.5%SDS,pH7.5），室温下快速研磨;3.把抽提液从研钵中移至1.5ml离心管中，混匀;4.12,000rpm,离心10min(RT)。取上清，加等体积的酚/氯仿（1：1）混合液，上下颠倒混匀；5.12,000rpm,5min(RT)，取上清，加等体积的异丙醇，上下颠倒混匀；6.12,000rpm,10min(RT)，弃上清，倒置于吸水纸上待壁上液体流尽后加入1ml的70%乙醇洗沉淀；7.12,000rpm,5min(RT)，弃上清，倒置于纸巾上待其干燥；8加20lddH2O溶解沉淀;,9.在溶解DNA中加入3-5lRNase，37消化2-3h；10.补充ddH2O至总体积400l，加入等体积的酚/氯仿，混匀；11.12000rpm，5min（RT），12.取上清，加入1/10体积的乙酸钠和2倍体积的无水乙醇，-20放置10min;13.12000rpm，4离心10min；14.去上清，70%乙醇洗涤沉淀,12000rpm，4离心5min;15.去上清，沉淀干燥后，加入20lddH2O溶解DNA；16.分光光度计法检测DNA的浓度和纯度。,实验报告分析,A260=1时相当于50g的双链DNA。A260/A280=1.8，DNA纯度高。A260/A2801.9,有RNA的污染或者降解。A260/A230在2.02.5，DNA纯度高。A260/A2302.0,有糖类，盐类或者有机溶剂污染。,注意事项,（1）选用幼嫩植物组织，可减少淀粉类的含量。（2）植物组织充分匀浆。（3）DNA的二级结构和双链易受多种因素的影响引起双链解开，即“变性”，因此抽提时避免使用变性的条件。（4）抑制内外源DNase的活力。（5）防止化学降解。（6）防止物理因素降解。,思考题,.1在拟南芥基因组提取缓冲液中，EDTA和SDS的作用分别是什么？1溶液I溶菌液：溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的-1,4糖苷键，因而具有溶菌的作用。当溶液中pH小于8时，溶菌酶作用受到抑制。葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切力作用而降解。EDTA：（1）螯合Mg2、Ca2等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用（DNase作用时需要一定的金属离子作辅基）;（2）EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。2溶液IINaOHSDS液：NaOH：核酸在pH大于5，小于9的溶液中，是稳定的。但当pH12或pH3时，就会引起双链之间氢键的解离而变性。在溶液II中的NaOH浓度为0.2mo1L，加抽提液时，该系统的pH就高达12.6，因而促使染色体DNA与质粒DNA的变性。SDS：SDS是离子型表面活性剂。它主要功能有：,（1）溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。（2）解聚细胞中的核蛋白。（3）SDS能与蛋白质结合成为R-O-SO3-R-蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它去除干净，防止在下一步操作中（用RNase去除RNA时）受到干扰。3.溶液III-3molLNaAc（pH4.8）溶液：NaAc的水溶液呈碱性，为了调节pH至4.8，必须加入大量的冰醋酸。所以该溶液实际上是NaAc-HAc的缓冲液。用pH4.8的NaAc溶液是为了把pH12.6的抽提液，调回pH至中性，使变性的质粒DNA能够复性，并能稳定存在。而高盐的3molLNaAc有利于变性的大分子染色体DNA、RNA以及SDS-蛋白复合物凝聚而沉淀之。前者是因为中和核酸上的电荷，减少相斥力而互相聚合，后者是因为钠盐与SDS蛋白复合物作用后，能形成较小的钠盐形式复合物，使沉淀更完全。,4为什么用无水乙醇沉淀DNA？用无水乙醇沉淀DNA，这是实验中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的优点是可以任意比和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA很安全，因此是理想的沉淀剂。DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。一般实验中，是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混合，其乙醇的最终含量占67左右。因而也可改用95乙醇来替代无水乙醇（因为无水乙醇的价格远远比95乙醇昂贵）。但是加95的乙醇使总体积增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA损失也增大，,实验二PCR克隆目的基因,一实验原理PCR(PolymeraseChainReaction,聚合酶链式反应)是一种选择性体外扩增DNA的方法.它包括三个基本步骤:(1)变性(Denature):目的双链DNA片段在94下解链;(2)退火(Anneal):两种寡核苷酸引物在适当温度(56左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对;(3)延伸(Extension):在TaqDNA聚合酶合成DNA的最适温度下,以目的DNA为模板进行合成.由这三个基本步骤组成一轮循环,理论上每一轮循环将使目的DNA扩增一倍,这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板,所以经25-35轮循环就可使DNA扩增达待扩目的基因扩增放大几百万倍。,PCR原理FLASH演示,PCR技术发展,PCR是20世纪80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍。PCR技术是生物科学领域中的一项革命性创举和里程碑。,1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。Mullis因发明了“聚合酶链式反应”而获得1993年度诺贝尔化学。,Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段，其缺点是：Klenow酶不耐高温，90会变性失活，每次循环都要重新加。引物链延伸反应在37下进行，容易发生模板和引物之间的碱基错配，其PCR产物特异性较差，合成的DNA片段不均一。Klenow这些缺点给PCR技术操作程序添了不少困难。这使得PCR技术在一段时间内没能引起生物医学界的足够重视。,TaqDNAPolymerase1988年Saiki等从水生嗜热杆菌(thermusaquaticus)中提取耐高温的TaqDNA多聚酶(TaqDNAPolymerase)，此酶在93下反应2h后其残留活性是原来的60%。缺点：TaqDNAPolymerase只有53聚合酶活性，但没有35外切活性，无法消除突变和错配，碱基错误掺入率可达10-4/碱基/循环,PfuDNAPolymerasePfuDNA聚合酶是已知保真度最高的聚合酶，来自于Pyrococcusfuriosis菌株，不仅具有掺入反应迅速及热稳定性高的优点，更是当前市场上所有DNA聚合酶中掺入出错率最低的一种。优点：Pfu具有35校阅功能，其错配率分别仅为10-7。缺点：效率低，扩增片段较短,TaqPlusDNAPolymerase是Taq和PfuDNA聚合酶的混合物，与TaqDNA聚合酶相比，具有扩增长度增加（简单模板可有效扩增20kb,复杂模板可有效扩增10kb),保真度好的特点；与PfuDNA聚合酶相比，具有扩增速度快，反应效率高的优势。,PCR反应体系组成,模板5引物和3引物4种dNTPDNA聚合酶Mg2+反应缓冲液,1.模板,PCR反应必须以DNA为模板进行扩增,模板DNA可以是单链分子,也可以是双链分子,可以是线状分子,也可以是环状分子就模板DNA而言,影响PCR的主要因素:纯度:蛋白、多糖、酚类等杂质会抑制PCR反应完整性:模板降解会导致PCR扩增无产物浓度:加量过多导致非特异性扩增增加,2.引物,PCR反应产物的特异性由一对上下游引物所决定。引物的好坏往往是PCR成败的关键引物影响因素：特异性：长度适当、避免二级结构和二聚体完整性：避免反复冻融浓度：应适当,过高导致非特异性增加,过低则扩增产物太少,引物设计原则,(1)引物长度：约为16-30b(2)G+C含量：G+C含量通常为40%-60%,较短引物可粗略估计Tm4(G+C)+2(A+T).(3)四种碱基随机分布，在3端不存在连续3个G或C,因这样易导致错误引发。(4)在引物内及两引物之间,尤其在3端应不存在二级结构。(5)引物5端对扩增特异性影响不大,可在引物设计时加上限制酶位点。(6)引物不与模板结合位点以外的序列互补,4种dNTP,浓度适当，避免反复冻融dNTP原液配成10mM或者2.5mM分装,-20oC贮存。一般反应中每种dNTP的终浓度为20-200M。当dNTP终浓度大于50mM时可抑制TaqDNA聚合酶的活性.4种dNTP的浓度应该相等,以减少合成中由于某种dNTP的不足出现的错误掺入。,Mg2+,过高非特异性严重，过低无扩增产物Mg2+浓度对DNA聚合酶影响很大,它可影响酶的活性,影响引物退火和解链温度,影响产物的特异性以及引物二聚体的形成等。通常Mg2+浓度范围为0.5-3mM。试剂公司通常会将Mg2+加入到DNA聚合酶的反应缓冲液中：10ReactionBuffer(includingMg2+)10ReactionBuffer(withoutMg2+),DNA聚合酶,TaqDNAPolymerase活性半衰期为9540min,975min.TaqDNA聚合酶的酶活性单位定义为74下,30min,掺入10nmol/LdNTP到核酸中所需的酶量。TaqDNA聚合酶的一个致命弱点是它的出错率,一般PCR中出错率为210-4核苷酸/每轮循环,100lPCR反应中,1.5-2单位的TaqDNA聚合酶就足以进行30轮循环.反应结束后，如果需要利用这些产物进行下一步实验,需要预先灭活TaqDNA聚合酶,灭活TaqDNA聚合酶的方法有：(1)PCR产物经酚:氯仿抽提,乙醇沉淀。(2)加入10mmol/L的EDTA螯合Mg2+。(3)99-100加热10min.目前已有直接纯化PCR产物的Kit可用。,Taq/Pfu/TaqPlusDNAPolymerase,DNA聚合酶单位定义：1个酶单位是指在以下分析条件下，于74，30min内使10nmol/L的dNTP掺入核酸中所需的酶。不同公司提供的酶U的定义也不同。,反应缓冲液,各种DNA聚合酶都有自己特定反应缓冲液；TaqDNAPolymerase反应缓冲液一般含：10-50mMTrisCl(20下pH8.3-8.8)50mMKCl适当浓度的Mg2+,缓冲液10mmol/lTris.Cl提供适合反应的pH值（pH8.4）50mmol/lKCl促进引物退火10g/ml明胶或血清白蛋白为Taq酶的保护剂,PCR反应主要参数：1.预变性：94C，3-5min2.变性：94C，30s-1min3.复性：56C，20s-2min4.延伸：72C，30s-3min5.总延伸：72C，10min,预变性和变性,在第一轮循环前,在94下变性35min非常重要,它可使模板DNA完全解链。变性不完全,往往使PCR失败,因为未变性完全的DNA双链会很快复性,减少DNA产量.一般变性温度与时间为941min。在变性温度下,双链DNA解链只需几秒钟即可完全,所耗时间主要是为使反应体系完全达到适当的温度。,退火,引物退火的温度和所需时间的长短取决于引物的碱基组成，引物的长度、引物与模板的配对程度以及引物的浓度.实际使用的退火温度比扩增引物的Tm值约低5。通常退火温度和时间为55左右,1-2min。,延伸,延伸反应通常为72,接近于TaqDNA聚合酶的最适反应温度75.实际上。延伸反应时间的长短取决于目的序列的长度和浓度。TaqDNA聚合酶每分钟约可合成2kb长的DNA。一般在扩增反应完成后,都需要一步较长时间(10-30min)的延伸反应,以获得尽可能完整的产物,这对以后进行克隆或测序反应尤为重要。,循环次数,循环次数主要取决于DNA浓度。一般而言25-30轮循环已经足够。循环次数过多,会使PCR产物中非特异性产物大量增加。,1.通过PCR从拟南芥基因组中扩增目的基因片段2.学习PCR仪等仪器的使用,实验目的,材料：拟南芥基因组DNA器材：移液器及吸头，PCR管，PCR仪，台式离心机。,实验材料和器材,所需试剂,10PCR反应缓冲液dNTPMix:每种10mM5和3引物：各10pmol/l（10mmol/L）TaqDNA聚合酶5U/l无菌去离子水；,实验步骤,1.在PCR管中依次混匀下列试剂(总体积50l)5l10Buffer(IncludingMgCl2)1ldNTPmix（各10mM）1l5上游引物（10M）1l3下游引物（10M）模板DNA(1000ng)0.25lTaqDNA聚合酶补充ddH2O至50l混匀后短暂离心（点离）。,2.将PCR管放置到PCR仪中，盖好盖子3.用94oC预变性3-5分钟；94oC变性1分钟，58oC退火1分钟,72oC延伸2分钟,30个循环；最后一轮循环结束后,于72oC下保温10分钟，4.终止反应，从PCR仪取出PCR管，放置4oC存,1.PCR非常灵敏,尽可能避免污染。吸头、离心管应高压灭菌,每次吸头用毕应更换,不要互相污染试剂；2.加试剂前,应短促离心10秒钟,然后再打开管盖,以防手套污染试剂及管壁上的试剂污染吸头侧面；3.应设含除模板DNA所有其它成分的负对照。,注意事项,思考题,简述PCR技术克隆的主要原理。,实验三PCR产物琼脂糖凝胶电泳,一、实验原理,琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同DNA的分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带,影响DNA迁移速率因素,DNA分子泳动主要的因素分两方面：DNA分子特性和电泳条件。1.DNA的分子大小:2.DNA分子的构象3.琼脂糖浓度4.电源电压5.嵌入染料的存在6.离子强度影响,琼脂糖是从琼脂中分离得到，由1,3连接的吡喃型b-D-半乳糖和1,4连接的3,6脱水吡喃型阿a-L-半乳糖组成，形成相对分子量为104105的长链。琼脂糖加热溶解后分子呈随机线团状分布，当温度降低时链间糖分子上的羟基通过氢键作用相连接，形成孔径结构，而随着琼脂糖浓度不同形成不同大小的孔径,琼脂糖凝胶的浓度与DNA分离范围,核酸电泳缓冲液有三种Tris-乙酸(TAE)、Tris-硼酸(TBE)和Tris-磷酸(TPE).,DNA电泳上样缓冲液,DNALoadingBuffer作用1.螯合Mg2，防止电泳过程中DNA被降解，一般上样缓冲液中含10mMEDTA。2.增加样品密度以保证DNA沉入加样孔，一般上样缓冲液中加入一定浓度的甘油或蔗糖，这样可以增加样品的比重。3.指示剂监测电泳的行进过程，一般加入泳动速率较快的溴酚蓝指示电泳的前沿，它的速率约与300bp的线状双链DNA相同。,DNA电泳的标准分子量,目前各厂商开发了各种类型的标准分子量，有广泛用于PCR产物鉴定的小分子Marker，也有常规用的大分子Marker,常用的DNA标准分子量电泳图,二、实验目的,1掌握琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理和方法2通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增的目的基因,仪器及耗材：天平、电泳设备、台式离心机、称量纸、药勺、微量移液器及吸头、EP管、封口膜、三角瓶、微波炉、凝胶成像系统。材料：PCR产物试剂：琼脂糖，1TAE电泳缓冲液、溴化乙锭（EB）、6Loadingbuffer、无菌去离子水、DNAMarker；,三、实验仪器、材料和试剂,四、实验步骤,1.1g琼脂糖加入100ml0.5TAE电泳缓冲液中，摇匀。在微波炉中加热至琼脂糖完全溶解。2.将制胶板放好，插入适当梳子，将溶解的琼脂糖（约50）倒入，室温冷却凝固3.充分凝固后将胶板取出，小心垂直向上拔出梳子，置入电泳槽中，加0.5TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶1-2mm。,4.用移液器吸取3l的6loadingbuffer于封口膜上，再加入5lDNA样品，混匀后，小心加入点样孔。5.打开电源开关，一般红色为正极黑色为负极，调节电压至3-5V/cm，可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，电泳约30min-60min。6.在瓷盘中加入适量的水，再加入510lEB，将凝胶放入盘中510分钟7.将凝胶置于凝胶成像仪内，在紫外灯下检测PCR产物的DNA条带,思考题,琼脂糖凝胶电泳中DNA分子迁移率受哪些因素影响？1、DNA的分子大小及构型2、琼脂糖浓度3、DNA分子的构象4、电源电压5、嵌入染料的存在6、离子强度影响,实验四目的基因与载体连接,一、实验原理,目的基因与载体连接,平末端连接粘性末端连接T载体策略连接,平末端连接,TaqDNA聚合酶往往在PCR产物3端加上多余的非模板依赖碱基,在用平末端连接克隆PCR产物前,可用Klenow片段或T4DNA聚合酶处理补平末端。有些DNA聚合酶（pfuDNA聚合酶）扩增的PCR产物为平端，可以直接用于平端连接,粘性末端连接,利用引物中附加在5端的限制酶位点,直接将PCR产物经适当的限制酶切割后产生粘性末端,与载体连接,产生重组DNA.如果下游两个引物中含有两个不同的限制酶位点.经酶切后定向克隆到载体中。,T-载体连接,TaqDNA聚合酶能在平端双链DNA的3末端加一个非模板依赖碱基(A或T),所加碱基多为A。利用这一特点,可以经限制酶(如EcoRV)切割载体,使其产生平末端,再利用TaqDNA聚合酶向载体双链DNA的3末端加上T,使载体与PCR产物末端互补并进行连接,pMD18-TVector,pMD18-TVector是一种高效克隆PCR产物（TACloning）的专用载体。用EcoRV进行酶切反应后，再在两侧的3端添加“T”而成。，本制品中的高效连接液SolutionI可以在短时间内（约30分钟）完成连接反应，大大方便了实验操作。,pMD18-TVector的结构,二、实验目的,1.通过T载体策略进行目的基因与载体的连接,仪器及耗材：台式离心机、微量移液器及吸头、EP管、封口膜、水浴锅。材料：PCR产物试剂：无菌去离子水；pMD18-T,三、实验仪器、材料和试剂,四、实验步骤,1.将PCR产物移入1.5mLEP管中，加去离子水至400l，加入1/10倍体积的3MNaAc和2.5倍体积的无水乙醇，混匀，-20放置10min；2.12000rpm，4，离心10min；3.去上清，将EP管倒置于吸水纸上；4.向EP管加入适量70%乙醇，将DNA沉淀重悬；5.12000rpm，4，离心5min；6.去上清，倒置吸水纸上，晾干，加入10l去离子水溶解DNA。,7.测定DNA的浓度；8.沉淀的目的基因DNA与T载体连接：取一新的PCR管，加入下列反应成分(总体积10l)：目的DNA4.5l(0.1pmol0.3pmol)pMD18-TVector0.5l加入5l（等量）的SolutionI；9.16OC水浴中反应30分钟。10.将连接产物-20保存。,思考题,简述目的DNA片段与载体连接的不同策略。,实验五大肠杆菌感受态细胞制备,一实验原理,在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种转移所必需的mob基因,因此不能凭自己的能力进入细菌。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。,感受态细胞制备方法,化学法:CaCl2处理后细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞;物理法:大肠杆菌暴露在电荷中时，其细胞膜会不稳定而诱导形成孔洞，于是DNA分子可由该孔进入细胞。,感受态细胞制备中应注意因素,细胞生长状态和密度不要用经过多次转接或储于的培养菌，最好从70或-20甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600来控制。DH5菌株的OD600为0.5时,细胞密度在5107个/ml左右(不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。2.试剂的质量所用的试剂,如CaCl2等均需较高纯度，冰箱保存。3.防止杂菌和杂DNA的污染整个操作过程均应在无菌条件下进行,所用器皿,如离心管,tip头等最好是新的,并经高压灭菌处理,所有的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染。,二实验目的,1.学习以E.coliDH5菌株为受体细胞，用CaCl2处理受体菌使其处于为感受态；2.制备大肠杆菌感受态细胞，为转化实验作准备。,仪器及耗材：培养皿、细菌投布器、三角瓶、牙签、恒温摇床、电热恒温培养箱、分光光度计、冷冻离心机、1.5mL离心管、无菌工作台材料：E.coliDH5菌株试剂：LB固体和液体培养基、100mMCaCl2、甘油。,三、实验仪器、材料和试剂,LB液体培养基(Luria-Bertani)配方：蛋白胨(Tryptone)1g酵母提取物(Yeastextract)0.5gNaCl1g加去离子水至总体积100mL，用NaOH调pH至7.0,高压灭菌LB固体培养基配方：每100mLLB液体培养基中加1.2g琼脂粉,高压灭菌。,四实验步骤,菌株活化1用接种环直接取冻存的大肠杆菌DH5，在LB培养基平板表面划线，于37培养16小时；2挑取一个单菌落，转到10mlLB培养基中，于37培养35小时；3将培养液全部转到100mlLB培养基中培养23小时，到OD6000.45-0.55,感受态细胞制备4.将1.5ml菌液转入离心管中，冰上10min;4oC，4,000rpm，离心5min；6.去上清，将沉淀重悬于0.5ml用冰预冷的100mMCaCl2中，置于冰上10min；7.4oC，4,000rpm，离心5min；8.去上清，将沉淀重悬于100L用冰预冷的100mMCaCl2溶液中，再加入75%甘油至终浓度为15-20%(25l),混匀；9.即成感受态细胞，-70oC冰箱中保存.,思考题,感受态细胞有什么特点？简述感受态细胞制备的原理,特点：处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态CaCl2法：操作：1.将快速生长的大肠杆菌置于经低温（0）预处理的低渗氯化钙溶液中，便会造成细胞膨胀，细胞膜通透性发生变化，极易与外源DNA相粘附并在细胞表面形成复合物。2.此时，将该体系转移到42下做短暂的热刺激，外源DNA就可能被细胞吸收。进入细胞的外源DNA分子通过复制、表达，实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。3.将转化后的细胞在选择性培养基上培养，筛选出带有外源DNA分子的阳性克隆。意义：将构建好的载体转入感受态细胞进行表达，不仅可以检验重组载体是否构建成功，最主要的是感受态细胞作为重组载体的宿主可以进行后续实验，如蛋白质表达纯化等工作。,实验六连接产物转化大肠杆菌,一实验原理,转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。,大肠杆菌感受态细胞与重组质粒DNA放置在冰浴(0oC)，CaCl2低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形。转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经突然热激（42oC）处理，更有利于细胞对DNA复合物的摄取，外源DNA分子通过吸附、转入、自稳而进入细胞内，并且开始进行复制和表达。,将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型(如Ampr等)得到表达，然后将此细菌培养物涂在含有氨苄青霉素的选择性培养基上。,分子转化分以下几步:吸附双链分子吸附于受体菌表面；转入双链分子解链。一条链进入受体菌，另一条降解；自稳外源质粒分子在细胞内复制成双链；表达一供体基因随同复制子同时复制，分裂，转录翻译。,二实验目的,将目的基因与质粒的连接产物转入大肠杆菌（DH5）感受态细胞，为重组载体的筛选最准备,仪器及耗材：培养皿、细菌投布器、三角瓶、恒温摇床、电热恒温培养箱、水浴锅、无菌工作台材料：目的基因与载体的连接产物；大肠杆菌感受态细胞试剂：LB固体和液体培养基、氨苄青霉素(100mg/mL)、IPTG(200mg/mL)、X-gal(20mg/mL),。,三、实验仪器、材料和试剂,氨苄青霉素(Amp)配置：无菌水配制氨苄青霉素成100mg/mL溶液，过滤除菌，-20oC冰箱保存；X-gal配置：将X-gal溶于二甲基甲酰胺中，配成20mg/mL浓度的溶液，装于玻璃或聚丙烯管中，以锡铂纸包裹避光保存于-20oC，X-gal不需要过滤除菌；IPTG配置：将2gIPTG溶于8mL水中，用水调节体积到10mL,过滤除菌，-20oC冰箱保存。,固体LB平板的准备1.固体LB培养基的配置：每100mL液体LB培养基加入1.2g琼脂粉，pH7.0，高温灭菌；2.固体LB培养基融化后，冷却到50oC，加入氨苄青霉素（100g/mL），再倒入灭菌的平板内；3.在LB固体培养基表面均匀投布4LIPTG(200mg/mL)和40Lx-gal(20mg/mL),吹干;,四实验步骤,4.从-70oC冰箱中取出感受态细胞,置冰上解冻；5.在超净台上，取10l连接产物加入到感受态细胞中，充分混匀，冰上放置30min；6.42oC热激处理90sec，热击后迅速置于冰上冷却3-5分钟；7.加入600800l无抗生素的LB液体培养基，37oC，5060rpm温育45min，使细菌恢复正常生长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因；8.菌液均匀涂布到含有抗生素（Amp100g/ml,并均匀的涂布有IPTG和X-gal）的LB平板上吹干，将培养皿倒置于37oC，培养16h；,思考题,观察实验结果，你的平板上出现单菌落没有？分析总结一下影响转化效率的因素。4.2.1细胞的生长状态和密度最好从-70甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以每毫升培养液中的细胞数在5107个左右为佳。即应用对数期或对数生长前期的细菌，可通过测定培养液的OD600控制。4.2.2质粒DNA的质量和浓度用于转化的质粒DNA主要是超螺旋态的，转化率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但外源DNA的量过多时，则会使转化率下降。一般来说，DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%，1ng的超螺旋DNA即可使50ul的感受态细胞达到饱和。对于以质粒为载体的重组分子而言，分子量大的转化效率低。此外，重组DNA分子的构型与转化效率也密切相关，环状重组质粒的转化率较分子量相同的线性重组质粒高10100倍。,4.2.3试剂的质量化合物及无机离子的影响：所用的CaCl2等试剂均需是最高纯度的，并用最纯净的水配制，分装保存于4。在Ca2+的基础上联合其他二价金属离子（如Mn2+或Co2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，可使转化效率大大提高。4.2.4防止杂菌和杂DNA的污染整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管、移液枪头等最好是新的，并经高压灭菌处理。所有的制剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染，否则均会影响转化效率或杂DNA的转入。,实验七阳性克隆的鉴定和筛选,将目的基因与载体进行连接形成重组子并转化后，在连接产物中既有载体和目的基因的连接，也有载体的自连和目的基因的自连，更多的是未发生连接反应的载体和目的DNA片断。这就需要我们对阳性克隆进行鉴定和筛选，将含有外源DNA的宿主细胞和不含外源DNA的宿主细胞分开，将含有正确重组子的宿主细胞和含有其他外源DNA的宿主细胞分开。,一实验原理,在我们的实验中，目的基因与T载体(pMD18-T)连接产物,转化E.coliDH5菌株。由于pMD18-T上带有Ampr和lacZ基因,故重组子的筛选首先采用Amp抗性筛选与-互补现象筛选相结合的方法。,pMD18-TVector的结构,因pMD18-T带有Ampr基因而外源片段上不带该基因,故转化受体菌后只有带有pMD18-TDNA的转化子才能在含有Amp的LB平板上存活下来（质粒自身环化和重组载体）;而只带有自身环化的外源片段的转化子则不能存活。此为初步的抗性筛选。,-互补,pMD18-T上带有-半乳糖苷酶基因(lacZ)的调控序列和-半乳糖苷酶N端146个氨基酸的编码序列。这个编码区中插入了一个多克隆位点,但并没有破坏lacZ的阅读框架,不影响其正常功能。E.coliDH5菌株带有-半乳糖苷酶C端部分序列的编码信息。在各自独立的情况下,pMD18-T和DH5编码的-半乳糖苷酶的片段都没有酶活性。当这种载体转入可编码半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞中时，在异丙基-D硫代半乳糖苷（IPTG）的诱导下，宿主可同时合成这两种肽段，虽然它们各自都没有酶活性，但它们可以融为一体形成具有酶活性的蛋白质。所以称这种现象为-互补现象。,由互补产生的半乳糖苷酶(LacZ)能够作用于生色底物5溴4氯3吲哚D半乳糖苷(X-gal)而产生蓝色的菌落，所以利用这个特点，在载体的该基因编码序列之间人工放入一个多克隆位点，当插入一个外源DNA片段时，会造成LacZ()基因的失活，破坏-互补作用，就不能产生具有活性的酶。所以，有重组质粒的菌落为白色，而没有重组质粒的菌落为蓝色。,重组DNA转化细菌过程示意图,菌落PCR鉴定阳性克隆,并不是所有白斑菌落是含有重组质粒的阳性菌落，存在假阳性现象。可以通过菌落PCR进一步鉴定含有重组质粒的阳性菌落。,常规的PCR鉴定需要进行细菌培养、质粒提取等多步操作后才能进行基因扩增，操作繁琐，耗时较长，为了简化操作程序，Gussow和Clackon提出菌落PCR方法，即用无菌牙签挑取单菌落到TE缓冲液中，煮沸5min，涡旋振荡后短暂离心，用12L裂解液作DNA模板，这样就省去了抽提模板DNA这一步，大大节省了时间和成本。后来该方法进一步改进，利用牙签直接沾取一点单菌落作为模板进行扩增反应更大量节省了时间，简化了操作程序，单菌落PCR可以有效的筛选阳性重组克隆。,二实验目的,1.学习通过蓝白斑筛选阳性重组菌落；2.学习菌落PCR技术及通过菌落PCR鉴定白斑菌落。,仪器及耗材：培养皿、电热恒温培养箱、无菌工作台、牙签、PCR管、各种tip、PCR仪。材料：连接产物转化后的菌落平板,三、实验仪器、材料和试剂,试剂：LB液体培养基氨苄青霉素(100mg/mL)10PCR反应缓冲液;dNTPMix(每种2.5mM);5和3引物（10mM）;TaqDNA聚合酶2.5U/l;无菌去离子水；,1.建立PCR体系(总体积20l)可以以小组为单位，现将上述各试剂混合，再分装，如小组为4人，就在EP管中加入4倍体积的上述各组分（除菌液），在分装到PCR管，这样便于试剂取样。ddH2O16.482l10Buffer(IncludingMgCl2)2.010ldNTPmix（各10mM）0.42l5上游引物（10M）0.42l3下游引物（10M）0.42lTaqDNA聚合酶0.42l2.用牙签从LB固体平板上挑取白斑单菌落在PCR管中搅拌。,四实验步骤,3.将PCR管放置到PCR仪中，盖好盖子；4.用94oC预变性3-5分钟；94oC变性1分钟，58oC退火1分钟,72oC延伸2分钟,32个循环；最后一轮循环结束后,于72oC下保温10分钟；5.终止反应，从PCR仪取出PCR管，放置4oC存。,五注意事项,1.X-gal是5-溴-4-氯-3-吲哚-b-D-半乳糖以半乳糖苷酶水解后生成的吲哚衍生物显蓝色。IPTG是异丙基硫代半乳糖苷为非生理性的诱导物，它可以诱导lacZ的表达。3.在含有X-gal、IPTG的筛选培养基上，携带载体DNA的转化子为蓝色菌落，而携带插入片段的重组质粒转化子为白色菌落，平板如在37培养后放于冰箱3-4小时可使显色反应充分，蓝色菌落明显。,思考题,简述利用蓝白斑筛选重组子的原理,实验八重组质粒的提取,一、实验原理,从细菌中分离质粒DNA方法包括3个基本步骤:1.培养细菌使质粒扩增；2.收集和裂解细胞;3.分离和纯化质粒DNA。,1.细菌培养,质粒的扩增与质粒在细菌细胞内的拷贝数和细菌个数正相关。质粒拷贝数是指在正常生长条件下，每个细菌细胞所对应的平均质粒数。在质粒复制子调控下，质粒拷贝数可随细菌培养条件变化而在较窄的范围波动，生长条件恒定，质粒增殖速度与宿主细胞增殖速度完全一致，拷贝数保持不变。,2.细菌的收获与裂解,细菌的收获可以通过离心来进行；细菌的裂解可以采用多种方法，这些方法包括非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及加热处理等。采用何种方法取决于三个因素：质粒的大小、大肠杆菌菌株和裂解后用于纯化质粒DNA技术。,大质粒（15kb）采用温和方法小质粒（15kb）可采用较剧烈方法有些大肠杆菌菌株不能采用加热的方法裂解；,3.分离和纯化质粒DNA,当用强热或酸、碱处理时，细菌的线性染色体DNA变性,而共价闭合环状DNA的两条链不会相互分开，当外界条件恢复正常时，线状染色体DNA片段难以复性,而是与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起,而质粒DNA双链又恢复原状,重新形成天然的超螺旋分子,并以溶解状态存在于液相中。,在细菌细胞内,共价闭环质粒以超螺旋形式存在。在提取质粒过程中，除了超螺旋DNA外，还会产生其它形式的质粒DNA。如果质粒DNA两条链中有一条链发生一处或多处断裂,分子就能旋转而消除链的张力,形成松驰型的环状分子,称开环DNA；如果质粒DNA的两条链在同一处断裂,则形成线状DNA。当提取的质粒DNA电泳时,同一质粒DNA其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的泳动速度快。,二、实验目的,1了解质粒各种提取方法2通过碱法提取重组质粒,仪器及耗材：三角瓶、超净工作台、台式离心机、微量移液器及吸头、EP管、DNA振荡器。材料：含有重组质粒的培养细菌,三、实验仪器、材料和试剂,碱法提取质粒需要的试剂：溶液：50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris.Cl(pH8.0)，10mmol/LEDTA(pH8.0)。溶液配制后高压灭菌15分钟,储存于4冰箱。溶液：0.2mol/LNaOH，1SDS(临用前用10mol/LNaOH和10SDS现配)。溶液：5mol/LKAc60ml，冰醋酸11.5ml，H2O28.5ml，定容至100ml,并高压灭菌。,试剂,（一）、碱法1.接种少许通过PCR鉴定含有重组质粒DH5菌液到液体LB培养基(含100g/mlAmp)中,37振荡培养约12小时至对数生长后期；。2、取菌液于1.5mlEP,4，12,000rpm,1min;3、弃上清,将管倒置于吸水纸上数分钟,使液体流尽；4、每管菌体沉淀重悬浮于100l溶液中(吸打混匀，务必充分)；5、每管加入新配制的溶液200l,轻柔上下颠倒EP管数次,以混匀内容物(不要振荡),冰浴5分钟。6、每管加入150l预冷的溶液,轻柔上下颠倒EP管数次，可见白色絮状沉淀出现，冰浴中5分钟,4，12,000rpm,10min;,四、实验步骤,7.上清液（每管400l）移入干净EP管中,加0.8倍体积5MLiCl（每管320l）,混匀,-20,20min;8.4,12,000rpm，5min9.将水相（约700l）移入干净EP管中,加入0.6倍体积的异丙醇（420l）,振荡混匀后，室温放置5分钟，然后4,12,000rpm，5min；10.弃上清,将管口敞开倒置于吸水纸上使所有液体流出,加入70乙醇洗沉淀一次,4,12,000rpm，5min；11.吸除上清液,将管倒置于吸水纸上使液体流尽,室温干燥。12.将沉淀溶于20lddH2O中,加入1-2lRNaseA,37水浴中温育2-3h.,思考题,质粒提取实验中，溶液，溶液，溶液各起什么作用？,实验九重组质粒酶切分析,一、实验原理,限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。限制性内切酶可分为三类:,类和III酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作用且依赖于ATP的存在。类酶结合于识别位点并随机的距离切割识别位点一定距离的DNA；III类酶在特定的非识别位点上切割DNA分子,然后从底物上解离。类由两种酶组成:一种为限制性内切核酸酶(限制酶),它切割某一特异的核苷酸序列;另一种为独立的甲基化酶,它修饰同一识别序列。,分子克隆中广泛应用的是：类中的限制性内切酶。绝大多数类限制酶识别长度为4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列(如EcoR识别六个核苷酸序列:5-GAATTC-3),有少数酶识别更长的序列或简并序列。类酶切割位点在识别序列中,有的在对称轴处切割,产生平末端的DNA片段(如Sma:5-CCCGGG-3);有的切割位点在对称轴一侧,产生带有单链突出末端的DNA片段称粘性未端,如EcoR切割识别序列后产生两个互补的粘性末端（5-GAATTC-3）。,BamHI,pET28多克隆位点上有EcoR和Sal位点,克隆基因引物也加入了EcoRI,SalI位点,Primer5:GCGGAATTCATGGGTTATTGGAAGTCGAAPrimer3:GCGGTCGACTCAAGCCTTTTGTGTGGCGCA,影响酶切反应的因素,1.DNA纯度2.缓冲液3.温度条件4.甘油含量,Takara公司提供的不同缓冲液,温度：37OC甘油：控制在10以下,二、实验目的,1掌握限制性内切酶酶切反应原理和方法；2将上一实验获得的重组质粒及表达载体pET进行限制性内切酶消化（注：不需要酶切pET质粒，老师已经为大家切好了）,仪器及耗材：台式离心机、微量移液器及吸头、EP管、恒温水浴锅。材料：重组质粒和载体质粒,三、实验仪器、材料和试剂,内切酶：EcoRI,SalI内切酶缓冲液:10*BufferHddH2O,试剂,限制性内切酶在各种缓冲液中的相对活性,四、实验步骤,1.重组质粒双酶切酶切反应体系如下(20l)：10*BufferH2l质粒DNA10lEcoRI0.5lSalI0.5l补充ddH2O到总体积20l,2.将上述反应体系混匀后，短暂离心，于37OC反应2-3小时,思考题,限制性核酸内切酶有什么特点？,限制性核酸内切酶是可以识别特定的核苷酸序列，并在每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的一类酶，简称限制酶。根据限制酶的结构，辅因子的需求切位与作用方式，可将限制酶分为三种类型，分别是第一型（TypeI）、第二型（TypeII）及第三型（TypeIII）。型限制性内切酶既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解；而型限制性内切酶只催化非甲基化的DNA的水解。III型限制性内切酶同时具有修饰及认知切割的作用。用于DNA基因组物理图谱的组建；基因的定位和基因分离；DNA分子碱基序列分析；比较相关的DNA分子和遗传工程。限制性核酸内切酶是由细菌产生的，其生理意义是提高自身的防御能力.限制酶一般不切割自身的DNA分子，只切割外源DNA。,实验十电泳分析酶切反应,一、实验原理,1.琼脂糖凝胶电泳原理同实验二,1.DNAMarker2.重组质粒pMD18-Gene酶切之前对照3.重组质粒pMD18-Gene酶切之后产生较大的质粒带和较小的目的基因带,2.重组质粒pMD-Gene酶切分析,3.表达载体pET32a酶切分析,pET系统是有史以来在E.coli中克隆表达重组蛋白的功能最强大的系统。pET载体使目的蛋白的克隆、检测以及纯化更加容易。,载体大致可分为两大类：转录载体和翻译载体。转录载体用以表达本身带有原核核糖体结合位点和AUG起始密码子的目的基因。只有3种转录载体：pET-21(+)、pET-24(+)和pET-23(+)。翻译载体包括来自T7噬菌体主要衣壳蛋白的高效核糖体结合位点，用于表达那些不带有核糖体结合位点的目的基因。,翻译载体在命名上与转录载体不同，多一个字母后缀，例如pET-21a(+)，表示相对于BamHI克隆位点识别序列GGATCC的阅读框。所有带后缀a的载体从GGA三联密码子开始表达，带b的从GAT开始，带c的从BamHI识别序列ATC三联密码子开始。带d后缀的载体阅读框和带c的一样，不同的是它们有一个