植物原生质体融合技术ppt课件

第十六章植物原生质体融合技术植物原生质体融合基本原理为什么技术应用技术方法如何微丝、叶绿体、线粒体、质膜、液泡、细胞核、内质网、微管、细胞壁、高尔基体、植物细胞模式、细胞壁由三种主要成分组成纤维素25-50%、半纤维素53%和果胶5%。什么是基本原理，去除植物细胞壁以获得大量原生质体，诱导原生质体融合形成杂交细胞，筛选，培养，促进杂交细胞分裂和分化，从细胞团，愈伤组织到最终植物形成，为什么技术的应用，以及植物原生质体融合的意义：克服物种间和以上属间有性杂交的不相容性障碍，为携带外源遗传物质的大分子渗入细胞创造条件，如何技术方法，第16章植物原生质体融合技术植物原生质体融合，植物原生质体培养的制备植物原生质体融合，1。植物原生质体的制备，原生质体的概念及原生质体培养纯化的意义，1。原生质体的概念和培养的意义，概念：除去植物细胞壁的裸细胞，称为原生质体的含义：(1)植物原生质体，能够再生完整的植物。(2)为细胞融合研究提供了可能。生产新的杂交品种是可能的。(3)当细胞壁被去除时，细胞的脱氧核糖核酸酶活性降低，从而有利于外源脱氧核糖核酸的进入。为新性状植株的再生提供有利条件。(4)是进行遗传学理论研究的材料。植物原生质体在理论研究和细胞工程中的地位，信息传递和能量转换的机制，细胞壁合成的机制，膜结构和功能性核质关系杂交或自交不亲和的机制，细胞间植物激素相互作用的机制，产生融合体细胞杂种的机制，各种细胞器的分离，各种细胞器的引入和外源基因诱导突变体的引入。植物叶-容易获得-相对容易通过酶水解分离植物根尖组织-植物花粉可以从各种植物的种子萌发后获得-单倍体原生质体愈伤组织产生，悬浮培养细胞-细胞壁容易解离，3、原生质体分离，一、原生质体分离法、机械分离法细胞先在高渗溶液中预处理，当细胞发生轻微的质壁分离时，原生动物收缩成球形，然后用机械方法研磨细胞，完整的原生质体可以从伤口中释放出来。优点：这种方法可以避免酶制剂对原生质体的破坏。缺点：获得的完整原生质体的数量相对较少。酶分离法中常用的细胞壁降解酶的种类有：纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、熊果酸酶等优点：可以获得大量原生质体，几乎所有的植物或其器官、组织或细胞都可以酶法获得。缺点：酶制剂含有核酸酶、蛋白酶、过氧化物酶和酚类。影响获得的原生质体的活力。b、影响原生质体数量和活力的因素，1)不同植物或不同组织和细胞的细胞壁组成和结构不同，2)渗透压稳定剂如甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖、盐(KCl、硫酸镁、水)等。3)质膜稳定剂：如葡聚糖硫酸钾、氯化钙、磷酸二氢钾等。增加质膜的稳定性4)酶溶液的ph值：一般为5.4-6.05)温度因子6)植物材料的生理状态：如植物年龄、发育状态、栽培条件等。对材料的选择有很大的影响，用于原生质体分离的酶溶液和稳定剂，96。烟草叶肉细胞：0.7M %纤维素酶-10果胶酶2%纤维素酶，0.7M甘露醇。海水。胡萝卜悬浮培养细胞：2%红小豆纤维素酶、0.5%干燥酶纤维素酶、0.5%半纤维素酶、1%果胶酶果胶酶；0.35毫升甘露醇、0.35毫升山梨醇、卷心菜等的根细胞：4%纤维素酶、2%半纤维素酶、0.3%果胶酶；0.7M甘露醇。番茄无菌苗的子叶和叶肉细胞：1.5%纤维素酶、0.3%果胶酶；102.6克/升蔗糖。水稻种子愈伤组织悬浮培养细胞：2%红曲纤维素酶、1%红曲纤维素酶、2%麦汁聚糖-10果胶酶、1%果胶酶；0.3M葡萄糖，4，纯化原生质体，除去杂质如破碎的原生质体、非壁细胞、细胞器和其它碎片，a，过滤方法b，漂浮方法c，离心方法，实施例：分离烟草叶肉细胞原生质体，1)。材料的制备和消毒：2)。酶解：3)。纯化：4)。原生质体活力的测定，1)。材料的制备和消毒。选择在温室中生长约两个月的烟草植物，从健康植物中采摘发育完全的嫩叶，用自来水冲洗，将叶片放入70%乙醇中进行表面消毒，然后将叶片放入2%次氯酸钠溶液中处理10分钟，然后用无菌水冲洗叶片3-4次以完全去除消毒剂，2)酶解，用一把尖镊子小心地撕下叶片的下表皮，将叶片切成2厘米长的小片，然后将小片放入含酶溶液中处理。(注：剥去表皮的一面朝下，在25-28下进行酶解反应3-4小时，在此过程中轻轻摇动培养皿数次)。3)。净化。将酶解悬浮液通过300-400目筛，以除去大的未消化片段。然后将含有原生质体的酶液收集在离心管中，低速离心，将原生质体沉入管底，倒出上清液，向离心管中加入适量洗涤液，然后离心；重复此步骤3次，完全去除酶解液；最后，将原生质体培养液离心一次，以分离、洗涤和纯化原生质体试剂。试剂分离、洗涤和纯化KH2PO 427.2MGK NO 3101 mg氯化钙2.2H 2O 1480 MGM GSO 4.7H 2O 240 MGKI 0.16mg硫酸铜4.5H 2O 0.025 mg甘露醇13%纤维素酶4%果胶酶0.4%蔗糖- 21%pH5.65.65.6，与分离试剂相同。(4)原生质体活力、形态的测定：将形态完整、细胞质丰富、颜色鲜亮的原生质体释放到渗透压浓度降低的洗涤液或培养基中，可以看到分离和还原的原生质体恢复到其原始状态，成为正常扩增的、通常有活力的原生质体。染色方法：用0.1%苯酚藏红花溶液染色。活的原生质体可以用荧光素二乙酸酯染成红色。荧光显微镜下，用荧光观察活的原生质体。美国食品和药物管理局方法的原理是，美国食品和药物管理局本身没有极性，不能发出荧光，可以自由进出细胞膜。在活细胞中，食品和药物管理局被酯酶切割，释放极性荧光素。荧光素不能自由穿透质膜并在活细胞中积累。荧光素不能在死细胞中积累。在紫外线照射下，活细胞中的荧光素发出绿色荧光。请想一想，活细胞和死细胞，美国食品和药物管理局首先用丙酮制备0.5%的母液，最终浓度为0.01%，原生质体分离和纯化流程图，第16章植物原生质体融合技术植物原生质体融合，植物原生质体培养植物原生质体融合，第二，植物原生质体培养，1。原生质体培养方法2，原生质体培养程序3，成功原生质体培养的技术关键，固体培养方法原生质体按照一定的细胞初始密度均匀分布在一薄层固体培养基中。这种方法的优点是便于单个原生质体的细胞壁再生和定点观察细胞团形成的整个过程。浅层液体培养法：将3-4毫升原生质体培养液注入培养皿或三角瓶中。然后按照一定的细胞密度注射纯原生质体，采用双层培养法进行培养。向固体培养基中加入适合原生质体细胞壁再生和细胞分裂的液体培养基。1.原生质体培养方法，2.原生质体培养程序。细胞壁再生：体积扩张，叶绿体重排，新细胞壁合成，细胞从球形到椭圆形。细胞分裂形成细胞团：通常在培养2-3天后，细胞质增加，细胞器增殖，DNA、蛋白质合成增加，细胞分裂形成小细胞团并发展器官形成植物再生：胚状体的发育是由愈伤组织诱导的。3。原生质体培养成功的技术关键和影响原生质体活力的因素：原生质体的制备方法、渗透压稳定剂的种类和浓度、质膜稳定剂的种类和浓度、原生质体在温度和保温时间下的初始密度一般为104-105个细胞/毫升、植株类型和材料的生理状态；细胞培养的时期；用于酶水解的质膜稳定剂的类型原生质体培养的营养和环境培养基中原生质体培养的环境：光、温度和湿度，第16章植物原生质体融合技术植物原生质体融合，植物原生质体的制备植物原生质体的培养植物原生质体的融合，综述：动物细胞融合技术的介绍，亲本来源，融合方法，融合细胞的选择，融合细胞的克隆，融合细胞的鉴定，3，植物原生质体的融合，1，植物细胞融合的概念和意义，2， 植物细胞融合的过程，3，诱导细胞融合的方法和融合剂，4，细胞融合的影响因素，5，细胞杂种的选择和鉴定，1，植物细胞融合的概念和意义，细胞融合的概念：也称为细胞杂交：一种在体外将不同细胞无性融合成杂种细胞的技术。 细胞融合的意义：克服种属间有性杂交的不相容性障碍，为携带外源遗传物质的大分子渗入细胞创造条件。2、植物细胞融合的程序、原生质体的分离和纯化、融合方法的选择、杂种细胞的选择、形成愈伤组织的器官分化植物的再生、杂种植物的鉴定。3、诱导原生质体融合的方法和融合剂。盐融合法高钙高酸碱度融合聚乙二醇融合法聚乙二醇与高钙高酸碱度结合融合法电融合法，综述：诱导动物细胞融合法，1、病毒诱导细胞融合法，2、化学融合剂诱导细胞融合法，3、电融合法，a .盐融合法，盐融合剂硝酸盐：纳米3、硝酸钾、氯化钙：氯化钠、氯化钙、MGC 2、 葡聚糖硫酸酯：葡聚糖硫酸钾，葡聚糖硫酸钠盐融合的优缺点：盐融合剂对原生质体活性的破坏力小缺点：融合频率低，液泡发育的原生质体难以诱导融合，高钙高酸碱度融合，钙浓度0.05毫升/升9.5-10.5，具体方法(以烟草为例)是将分离纯化的双亲原生质体以1:1的比例混合；加入0.05毫升/毫升二氧化氯和0.4毫升/升甘露醇；用甘氨酸钠缓冲溶液的酸碱度至10.5，得到融合液，并保持温度在37；0.5小时；用0.4摩尔/升甘露醇洗涤高氯化钙和高酸碱度；两种原生质体的融合率达到10%。聚乙二醇是一种多聚化合物，分子式为H(OHCH2-CH2)nOH，平均相对分子量为200-20000。融合机理：它可能是由于聚乙二醇分子间形成的静电键带有大量负电荷，与原生质体表面的负电荷在钙离子的连接下，促进异源原生质体间的粘附和结合，待处理的原生质体用相对分子量为1540的聚乙二醇处理40-50分钟；然后用培养液缓慢稀释聚乙二醇，最后洗去聚乙二醇，得到10%异核体，聚乙二醇与高钙高酸碱度融合法结合，先处理30分钟；(聚乙二醇是相邻原生质体表面之间的分子桥)然后用高钙和高酸碱度的溶液稀释聚乙二醇；(引起原生质体表面电荷的无序和再分布，从而促进融合)用培养液洗去高Ca2和高酸碱度，聚乙二醇诱导原生质体融合的过程，电融合法，原理：改变原生质体质膜表面的电荷和氧化还原电位，使异质原生质体结合并立即使质膜破裂，然后质膜开始连接，直至完全膜闭合形成融合体。优点：原生质体损伤小，融合率高，重复性强；该装置精巧、方便、简单，能在显微镜下观察或记录融合过程，避免了聚乙二醇诱导后的洗涤过程，诱导过程可控性强。在电融合的基本过程中，将制备好的亲本原生质体混合均匀，放入融合室中，微电极型只有一个室，平行电极型有四个室，两个电极相隔3毫米，将整个装置放入培养皿中，用5-12微安的脉冲电流间歇刺激微电极型1-5毫秒，原生质体在几秒至几十秒内暂时收缩，两个膜之间形成小孔，两个膜连接成桥。囊泡一个接一个地形成，并通过点连接到表面，最终形成融合体。整个过程约为10-30分钟，采用并联多电极聚变装置方法：通过1兆赫的交流电场产生双向电脉冲，如150伏/厘米。在电场力的作用下，原生质体被极化产生偶极子，原生质体紧密排列成珠。在适当时间和强度的直流电脉冲(50毫秒，1.2-2KV/cm)作用下，原生质膜被刺破进一步形成融合体，细胞电融合过程，原生质体融合过程包括三个主要阶段：1)两个或两个以上原生质体的原生质膜相互靠近；2)局部区域的质膜紧密贴合融合；3)融合完成，形成球形异核体或同核体。4、影响细胞融合的因素，聚乙二醇诱导方法：聚乙二醇规格，纯度，作用时间，电诱导方法：原生质体密度，交流电压，交流电场振幅频率，交流电场处理时间，直流高频电压脉宽脉冲数，5，杂交细胞的选择和鉴定，融合的A型，融合的B型，杂交细胞选择的方法C，细胞杂种的鉴定，融合的A型， 自体融合：亲本原生质体异源融合并相互兼容的细胞杂种：具有双亲染色体的异源二倍体部分兼容的细胞杂种：双亲染色体逐渐被排斥后，少量染色体重组，然后它们进入同步分裂，最后形成具有部分重组染色体的植物异胞体细胞杂种：亲本的所有染色体都被排斥。 但是细胞质是双亲的嵌合细胞杂种：不同物种双亲的原生质体经历了膜融合和细胞质融合，但核融合没有发生。 双亲的细胞核经历核分裂，然后形成细胞壁，最后形成嵌合植物。b、杂交细胞选择法、互补选择法(遗传或抗性):选择一种叶绿体缺失突变体，它能在有限的培养基上分化成植物。在上述有限的培养基上，叶绿素正常的植物不能分裂成大的细胞团(愈伤组织)。可见标记法：坑培养皿分离法：根据融合异核体和亲本原生质体的形态特征进行微管分离法：根据可见标记用微管吸取异核体，进行“呵护培养”获得杂种植株。生长特性选择法：利用原生质体对培养基成分的需求和反应的差异来选择杂交细胞。物理性状选择方法：根据亲本原生质体大小、颜色、漂浮密度和电脉冲差异率的差异选择杂种。其他方法：也可以通过显微操作分离和培