微生物遗传与菌种选育新

,遗传变异的物质基础基因突变和诱变育种基因重组和杂交育种（自学）基因工程菌种的衰退复壮和保藏,内容提要,第七章微生物的遗传变异和育种,遗传（heredityinheritance）：,亲代与子代相似,变异（variation）：,亲代与子代、子代间不同个体不完全相同,遗传（inheritance）和变异（variation）是生命的最本质特性之一,（1）遗传型（genotype）,生物的全部遗传因子及基因,又称基因型，指某一生物个体所含有的全部遗传因子即基因组（genome）所携带的遗传信息。遗传型是一种内在可能性或潜力，其实质是遗传物质上所负载的特定遗传信息,（2）表型（phenotype）,具有一定遗传型的个体，在特定环境条件下通过生长发育所表现出来的形态等生物学特征的总和。,又称表现型，指某一生物体所具有的一切外表特征和内在特性的总和，是其遗传型在合适环境下通过代谢和发育而得到的具体表现。,表型是由遗传型所决定，但也和环境有关。,（3）变异,遗传型变异（基因变异、基因突变）：指生物体在某种外因或内因的作用下所引起的遗传物质结构或数量的改变，亦即遗传型的改变。,遗传物质改变，导致表型改变特点：遗传性、群体中极少数个体的行为（自发突变频率通常为10-5-10-10）,表型饰变：指不涉及遗传物质结构改变而只发生在转录、转译水平上的表型变化。,表型的差异只与环境有关特点：暂时性、不可遗传性、表现为全部个体的行为,橘生淮南则为橘，生于淮北则为枳。,（4）饰变（modification）,表型饰变：,表型的差异只与环境有关暂时性、不可遗传性、表现为全部个体的行为,例如：粘质沙雷氏菌：25下培养，产生深红色的灵杆菌素；37下培养，不产生色素；重新将温度降25，又恢复产色素的能力。,斜面培养,液体培养,微生物是遗传学研究中的明星：,微生物细胞结构简单，营养体一般为单倍体，方便建立纯系,很多常见微生物都易于人工培养，快速、大量生长繁殖。,对环境因素的作用敏感，易于获得各类突变株，操作性强。,第一节遗传变异的物质基础,种质连续理论：18831889年间Weissmann提出。认为遗传物质是一种具有特定分子结构的化合物。,FCrick在研究DNA双螺旋结构,基因学说：1933年摩尔根（ThomasHuntMorgan）发现了染色体，并证明基因在染色体上呈直线排列，提出了基因学说，使得遗传物质基础的范围缩小到染色体上。DNA是遗传变异的物质基础的证明：1944年以后，先后有利用微生物为实验对象进行的三个著名实验肺炎球菌的转化试验噬菌体感染试验病毒的拆开与重建试验人们普遍接受核酸才是真正的遗传物质。,一、3个经典实验（一）经典转化试验,最早进行转化（transformation）实验的是F.Griffith（1928年），他以Streptococcuspneumoniae（肺炎链球菌，旧称“肺炎双球菌”）作为研究对象。,有荚膜菌落光滑分泌毒素致病,无荚膜菌落粗糙无毒不致病,实验材料：肺炎双球菌,转化实验,说明：加热杀死的S型细菌中有一种具有遗传转化能力的物质，它通过某种方式进入R型细胞，并使R型细菌获得表达S型荚膜形状的遗传特性,1928年Griffith进行的细菌转化实验,（1）动物实验,（2）细菌培养试验,（3）S型菌的无细胞抽提液试验,Avery在四十年代以更精密的实验设计重复了以上实验,（1）从活的S菌中抽提各种细胞成分（DNA，蛋白质，荚膜多糖等）（2）对各组分进行转化试验,只有S型细菌的DNA才能将S.pneumoniae的R型转化为S型且DNA纯度越高，转化效率也越高。说明：S型菌株转移给R型菌株的DNA是遗传因子。,1952年，A.D.Hershey和M.Chase发表了证明DNA是噬菌体的遗传物质基础的著名实验噬菌体感染实验,（二）噬菌体感染实验（p188）,步骤,1：用含同位素35,P32的培养基分别培养大肠杆菌,2：让T2感染上述大肠杆菌使其打上S35、P32标记,35S蛋白质外壳的噬菌体,32PDNA核心的噬菌体,在DNA中存在着包括合成蛋白质外壳在内的整套遗传信息。,（二）噬菌体感染实验,A.D.Hershey和M.Chase，1952年,（1）含32P-DNA的一组：放射性85%在沉淀中,上清液中含15%放射性,沉淀中含85%放射性,沉淀中含25%放射性,以35S标记蛋白质外壳做噬菌体感染实验,（2）含35S-蛋白质的一组：放射性75%在上清液中,10分钟后用捣碎器使空壳脱离,吸附,离心,沉淀细胞进一步培养后，可产生大量完整的子代噬菌体,上清液中含75%放射性,为了证明核酸是遗传物质，H.Fraenkel-Conrat（1956）用含RNA的烟草花叶病毒（TMV）进行了著名的植物病毒重建实验。,（三）植物病毒的重建实验（p189）,植物病毒蛋白质和RNA可以人为地分开,同时又可把它们重新组合成具感染性的病毒.,植物病毒的重建实验,甲乙r感染症状同甲病毒；分离得到甲病毒,乙甲r感染症状同乙病毒；分离得到乙病毒,原始株拆开重建感染分离纯化,植物病毒的重建实验,遗传物质类型,核染色体,核外染色体,真核生物细胞器,原核生物质粒,二、遗传物质在微生物细胞内的存在部位和方式,核外DNA的种类,核外染色体,真核生物的“质粒”原核生物的质粒,线粒体细胞质基因叶绿体中心体动体共生生物：卡巴颗粒酵母菌的2m质粒,F因子R因子Col质粒Ti质粒巨大质粒降解性质粒,（一）核酸存在的7个水平细胞水平：存在于细胞核或核质体，单核或多核细胞核水平:原核与真核生物的细胞核结构不同，核外DNA染色体水平:倍性(真核)和染色体数核酸水平：在原核中同染色体水平、存在部分二倍体DNA或RNA，复合或裸露，双链或单链基因水平：具自主复制能力的遗传功能单位，长度与信息量，转录翻译密码子水平：信息单位,起始和终止,核苷酸水平：突变或交换单位，四种碱基,（二)原核生物的质粒（p194）,功能：带有一些基因，如产生毒素、抗药性、固氮、产生酶类、降解功能等，并可进行细胞间转移。,结构与大小：质粒通常以共价闭合环状的超螺旋双链DNA分子状态存在于细胞中。约为11000kb，上面携带有数个到数十个甚至上百个基因。,定义：存在于细菌、真菌等微生物细胞中，独立于染色体外，能进行自主复制的遗传因子。,质粒核外环状小型DNA独立复制稳定遗传,F因子与有性接合有关,种类,R因子与抗药性有关,COL编码免疫蛋白,Ti质粒诱癌质粒,降解性质粒：编码降解有害物质的酶,用途基因工程中作为目的基因载体,质粒,原核生物遗传物质存在的另一种方式,基因突变,突变与育种,第二节基因突变和诱变育种,一、基因突变（genemutation）,一个基因内部遗传结构或DNA序列的任何改变,简称突变，是变异的一种，泛指细胞内（或病毒粒内）遗传物质的分子结构或数量突然发生的可遗传的变化，可自发或诱导产生。,突变几率一般很低（10-610-9）,从自然界分离到的菌株，简称野生型。,野生型经突变后形成的带有新性状的菌株，又称突变体或突变型。,突变株（mutant）,野生型菌株（wildtypestrain）,（一）突变类型,凡能用选择性培养基（或其他选择性培养条件）快速选择出来的突变株。,选择性突变株（selectivemutant）,非选择性突变株（non-selectivemutant）,反之。,突变株的表型,非选择性突变株,选择性突变株,抗性突变型（株）,营养缺陷型（株）,条件致死突变型（株）,形态突变型（株）,抗原突变型（株）,产量突变型（株）,1.营养缺陷型（auxotroph）,某一野生型菌株因发生基因突变而丧失合成一种或几种生长因子、碱基或氨基酸的能力，只有从周围环境或培养基中获得这些营养或其前体物（precursor）才能正常生长繁殖的变异类型，称为营养缺陷型。,营养缺陷型突变株在遗传学、分子生物学、遗传育种和遗传工程等研究中十分重要,表型判断的标准：,在基本培养基上能否生长,营养缺陷型的表示方法：,基因型：,所需营养物的前三个英文小写斜体字母表示：hisC（组氨酸缺陷型，其中的大写字母C同一表型中不同基因的突变）,表型：,同上，但第一个字母大写，且不用斜体：HisC,2.抗性突变型（resistantmutant）,指野生型菌株因发生基因突变，使菌株对对某化学药物或致死物理因子，特别是抗生素，产生抗性的抗性变异类型。,特点：,正选择标记（突变株可直接从抗性平板上获得在加有相应抗生素的平板上，只有抗性突变能生长。所以很容易分离得到。）,表示方法：,所抗药物的前三个小写斜体英文字母加上“r”表示。,抗性突变菌株在遗传学、分子生物学、遗传育种和遗传工程等研究中极为重要,3.条件致死突变型（conditionallethalmutant）,某菌株或病毒经基因突变后，在某种条件下可正常地生长、繁殖并呈现其固有的表型，而在另一种条件下却无法生长、繁殖，这种突变类型称为条件致死突变型。,在25下可感染其E.coli宿主在37却不能感染,Ts突变株即温度敏感突变株（temperaturesensitivemutant，Tsmutant）是一类典型的条件致死突变株。,E.coli的某些菌株,在37下正常生长不能在42下生长,某些T4噬菌体突变株,产生Ts突变的原因,在某特定的温度下具有功能,在另一温度（一般为较高温度）下则无功能,突变使某些重要蛋白质的结构和功能发生改变，,4.形态突变型（morphologicalmutant）,指由于突变而引起的个体或菌落形态的非选择性变异。,特点：,非选择性突变突变株和野生型菌株均可生长，但可从形态特征上进行区分。,举例：,菌落颜色变化,半乳糖苷酶基因的插入失活,5.抗原突变型（antigenicmutant）,指由于基因突变引起的细胞抗原结构发生的变异类型，一般也属非选择性突变。例如，细胞壁缺陷变异（L型细菌等）、荚膜或鞭毛成分变异等。,6.产量突变型（metabolitequantitativemutant）,通过基因突变而产生的在代谢产物产量上明显有别于原始菌株的突变株，称为产量突变型。,筛选高产正变株的工作对生产实践极其重要,在育种实践上,诱变育种重组育种遗传工程育种,突变率,每一细胞在每一世代中发生某一性状突变的几率,例如，突变率为10-8的，指该细胞在1亿次细胞分裂中，会发生1次突变。,某一单位群体在每一世代（即分裂1次）中产生突变株（mutant，即突变型）的数目来表示,例如，一个含108个细胞的群体，当其分裂为2108个细胞时，即可平均发生一次突变的突变率也是10-8。,（二）突变率（mutationrate）,基因突变的7个共同点,（1）自发性,各种性状的突变，可在无人为的诱变因素处理下自发地产生。,（三)基因突变的特点（p200）,（2）非对应性,突变的性状与引起突变的原因间无直接的对应关系。,这是突变的一个重要特点，也是容易引起争论的问题,（3）稀有性,自发突变虽可随时发生，但其突变率却是极低和稳定的，一般在10-610-9间。,某基因的突变率不受它种基因突变率的影响。,（5）可诱变性,自发突变的频率可因诱变剂（mutagen）的影响而大为提高（10105倍）。,（4）独立性,基因突变后的新遗传性状是稳定的、可遗传的。,野生型菌株某一性状可发生正向突变（forwardmutation），也可发生相反的回复突变（reversemutation或backmutation，也称回变）。,（7）可逆性,（6）稳定性,诱发突变简称诱变，是指通过人为的方法，利用物理、化学或生物因素显著提高基因自发突变频率的手段,1.诱发突变（inducedmutation）,凡具有诱变效应的任何因素，都称诱变剂（mutagen）。,（五）基因突变及机制p202,诱变机制,移码突变,染色体畸变,碱基的置换,（1）碱基的置换,直接引起置换的诱变剂,间接引起置换的诱变剂,碱基的置换,T：烯醇式,（2）移码突变,分子中缺失或增加少数几个碱基对而引起,造成突变点以后全部遗传密码转录与转释发生错误,增添一个碱基,缺少一个碱基,（3)染色体畸变,某些理化因子，如射线，紫外线，亚硝酸等，除能引起点突变外，还会引起DNA分子大损伤，包括染色体易位，倒位，缺失，重复等，即为染色体畸变。,2.自发突变（spontaneousmutation）(p206),自发突变（spontaneousmutation）是指生物体在无人工干预下自然发生的低频率突变。,自发突变的原因,（1）背景辐射和环境因素,（3）DNA复制过程中碱基配对错误,（2）微生物自身有害代谢产物,一个1000bp的基因自发突变频率约为10-6,例如，过氧化氢等,例如，天然的宇宙射线等,（六）紫外线对DNA的损伤及其修复,嘧啶（敏感性）嘌呤,紫外线（ultravioletray，U.V.）,嘧啶二聚体（TT，TC，CC）和水合物,二、突变与育种（p208）,（二）诱变育种（breedingbyinducedmutation）,诱变育种是指利用物理、化学等诱变剂处理均匀而分散的微生物细胞群，在促进其突变率显著提高的基础上，采用简便、快速和高效的筛选方法，从中挑选出少数符合育种目的的突变株，以供科学实验或生产实践使用。,筛选,诱变,诱变育种,定向的更重要,随机的,效价：指有效成分的浓度。1ug/ul称为1单位,从青霉素产量看诱变育种,可获得供工业和实验室应用的各种菌株；提高有用代谢产物的产量；减少杂质、提高产品质量、扩大品种和简化工艺等。,诱变育种具有重大的实践意义,1.诱变育种的基本环节（p209）,出发菌株,纯化、同步培养,培养液,离心收集细胞，洗涤，制菌悬液玻璃珠打散，过滤,细胞或孢子悬液,诱变处理,平板分离,初筛,复筛,保藏及扩大试验,活菌计数，诱变预备试验,存活细胞计数，致死率计算,变异率计算,2.诱变育种工作中应考虑的几个原则,选优良的出发菌株,选择简便有效的诱变剂,处理单孢子（或单细胞）悬液,选用最适剂量,设计或采用高效筛选方案或方法,利用复合处理的协同效应,利用和创造形态，生理与产量间的相关指标,（1）选择简便有效的诱变剂,利用回变检测致癌剂艾姆斯试验法（p210）,平板上无大量菌落出现，说明样品不含诱变剂；有抑制圈出现，并在外围长满大量菌落，说明浓度过高；在滤紙片周围长满菌落说明浓度合适。该法广泛用于监测食品饮料药物等试样中的致癌物时间3天，准确率85%。,（2）挑选优良的出发菌株（p211）,生产中用过的自发变异菌株,采用具有有利性状的菌株,采用已发生其他变异的菌株,采用前体或最终产物代谢高的菌株,采用增变菌株,（3）处理单孢子（或单细胞）悬液,芽孢杆菌应处理芽孢,放线菌，霉菌应处理孢子,细菌指数期，放线菌霉菌要稍加萌发后使用,出发菌株应制成均匀悬夜,（4）选用最适剂量,剂量以诱变剂浓度和处理时间来表示,合适剂量：能扩大变异幅度又能促使变异移向正变范围的剂量,（5）充分利用复合处理的协同效应,两种或多种诱变剂先后使用,同种诱变剂重复使用,两种或多种诱变剂同时使用,（6）利用和创造形态，生理与产量间的相关指标,淀粉酶变色圈试验,变色圈大的为淀粉酶高产菌落,在琼脂平板上，通过观察测定某突变菌落周围蛋白酶水解圈的大小、淀粉酶变色圈（用碘液使淀粉显色）的大小，氨基酸显色圈（将菌落用打孔机取下，转移到滤纸上，再用茚三酮试剂显色）的大小，柠檬酸变色圈（可在厚滤纸上培养，用溴甲酚绿作指示剂）的大小，抗生素抑制圈的大小，指示菌生长圈的大小（测定生长因子产生），纤维素酶对纤维素水解圈（用刚果红染色）的大小，外毒素的沉淀反应圈的大小等，均可为初筛工作中估计某突变株代谢产物量的“形态”指标。,（7）设计或采用高效筛选方案或方法,设计简便、高效的科学筛选方案。,初筛,筛选工作,复筛,以量为主（选留较多有生产潜力的菌株）,以质为主（对少量潜力大的菌株的代谢产物量作精确测定）,第一轮,第二轮,五个出发菌株,初筛,复筛,对产量突变株生产性能的测定方法,粗测为主,在培养皿平板上,在摇瓶中,（8）创造新型筛选方法,较精确的测定,摇瓶培养or台式自控发酵罐培养,3.突变株的筛选方法(p212）,高产突变菌株的筛选方法,抗性突变体的筛选方法,营养缺陷型的的筛选方法,与突变株的筛选相关的几个概念,（1）产量突变株的筛选,1971年，国外有人报道了筛选春日霉素（kasugamycin，即“春雷霉素”）生产菌时所采用的一种琼脂块培养法，一年内曾使该抗生素产量提高10倍。,此法的关键是用打孔器取出含有一个小菌落的琼脂块作分别培养。这样，各琼脂块所含养料和接触空气面积基本相同，且产生的抗生素等代谢产物不致扩散出琼脂块外。数据精确，效率高,（2）抗药性突变株的筛选,基因突变使菌株对某种或某几种药物，特别是抗生素，产生抗性。,特点：,正选择标记（突变株可直接从抗性平板上获得-在加有相应抗生素的平板上，只有抗性突变能生长。所以很容易分离得到。）,梯度平板法（gradientplate）是定向筛选抗药性突变株的一种有效方法，通过制备琼脂表面存在药物浓度梯度的平板、在其上涂布诱变处理后的细胞悬液、经培养后再从其上选取抗药性菌落等步骤，就可定向筛选到相应抗药性突变株。,梯度平板法（gradientplate）是定向筛选抗药性突变株的一种有效方法。,表示方法：,所抗药物的前三个小写斜体英文字母加上“r”。,strr,strs,对链霉素的,抗性,敏感性,（3）营养缺陷型突变株的筛选,营养缺陷型突变株（auxotrophicmutant）在生物学基础理论和应用研究以及生产实践上都有极其重要的意义。,营养缺陷型的表示方法：,基因型：,所需营养物的前三个英文小写斜体字母表示：hisC（组氨酸缺陷型，其中的大写字母C同一表型中不同基因的突变）,表型：,同上，但第一个字母大写，且不用斜体：HisC,在具体使用时多用hisC-和hisC+，分别表示缺陷型和野生型。,a.基本培养基（MM，符号为）,与筛选营养缺陷型突变株有关的3类培养基,仅能满足某微生物的野生型菌株生长所需的最低成分的组合培养基，称MM。,b.完全培养基（completemedium，CM，符号为）,凡可满足一切营养缺陷型菌株营养需要的天然或半组合培养基，称为CM。,一般可在基本培养基中加入一些富含氨基酸、维生素、核苷酸和碱基之类的天然物质，如蛋白胨或酵母膏等配制而成。,c.补充培养基（supplementalmedium，SM，符号为A或B等）,凡只能满足相应的营养缺陷型突变株生长需要的组合或半组合培养基，称为SM。,在基本培养基上再添加对某一营养缺陷型突变株所不能合成的某相应代谢产物所组成，可专门选择相应的突变株。,原养型（prototroph）,与营养缺陷型突变有关的3类遗传型个体,野生型（wildtype，wildstrain）,营养缺陷型（auxotroph）,从自然界分离到的原始菌株（AB）,经诱变剂处理后的突变株（AB）,经回复突变或重组后产生的菌株（AB）,营养缺陷型的筛选办法(p215),1.诱变剂处理,2.淘汰野生型,3.检出缺陷型,夹层培养法,限量补充培养法,逐个检出法,影印平板法,4.鉴定缺陷型,基本培养基（MM）-：凡是能满足野生型菌株营养要求的最低成分的合成培养基。完全培养基（CM）+：满足一切营养缺陷型菌株生长的天然或半合成培养基。补充培养基（SM）x：在MM中有针对性地加入一或几种营养成分以满足相应营养缺陷型菌株生长的合成培养基。,与筛选营养缺陷型突变株相关的3类培养基,三类遗传型,野生型A+B+,营养缺陷型型A+B-,原养型A+B+,与营养缺陷型突变相关的3类遗传型个体（p215）,夹层培养法（p216）,夹层培养法及结果,限量补充培养法,微量蛋白质的完全培养基上小菌落是营养缺陷型突变株,逐个检出法,逐个检出法,缺陷型的检出,影印接种法,生长谱法方法简便；回变和污染不影响结果测定物质可为粉末或纸片,补充：缺陷型的鉴定,测定一般应分两阶段：第一阶段：测定是哪类物质的缺陷型；第二节段：根据第一阶段确定的范围，进一步确定是哪种具体化合物的缺陷型；,组合营养物法,步骤（以氨基酸缺陷型的鉴定为例）：a.将多种营养因子编组；b.将组合液的纸片放在涂菌的基本培养基上培养；c.结果分析；,一组：12345二组：26789三组：37101112四组：48111314五组：59121415,营养因子分组编排时注意；1）每组内无重复的营养因子2）每组中应包含只出现一次的因子3）每组中其他因子应分别出现二次,如：,一组：12345二组：26789三组：37101112四组：48111314五组：59121415,缺陷型的应用,作为菌株的遗传标记：进行基因工程、诱变育种、研究代谢过程时用作亲本标记；作为生产菌种：aa、核苷酸等生产菌种；作为aa、维生素、碱基的测定菌株。,一、微生物菌种的衰退二、微生物菌种的复壮三、微生物菌种的保藏,第五节微生物菌种的衰退、复壮和保藏,P.231,性状稳定的菌种是微生物学工作最重要的基本要求，否则生产或科研都无法正常进行。,衰退的含义：由于自发突变的结果，而使某物种原有一系列生物学性状发生量变或质变的现象。,一、微生物菌种的衰退,衰退的表现形式1）原有的形态不典型2）生长速度变慢3）代谢产物生产能力下降4）致病力下降5）抗性下降,（一）衰退的防止方法,1）控制传代的次数,2）创造良好培养条件,3）采用有效的菌种保藏方法,4）采用不易衰退的细胞进行传代,P.232,复壮的含义,（二）微生物菌种的复壮,1）狭义：是一种消极的措施，它指的是菌种已发生衰退，再通过纯种分离和性能测定等方法，从衰退的群体中找出少数尚未衰退的个体，以达到恢复该菌种原有典型性状的一种措施。,2）广义：是一项积极的措施，即在菌种性能尚未衰退前就经常有意识地进行纯种分离和生产性能的测定工作，以期从中选择到自发的正突变体（以期菌种的生产性能逐步有所提高）。,复壮的方法,1.纯种分离；A、平板划线分离：主要适合细菌，酵母菌，可达到菌落纯的水平。B、单孢子分离：主要适合产孢子的微生物，例霉菌和放线菌。用显微操作器进行分离，可达到细胞纯的水平。,2.通过寄主主体复壮,3.淘汰已衰退的个体,P.232,二、微生物菌种的保藏,目的：不死亡，不污染，不变异三不原则随时为生产、科研提供优良菌种。,原理：选用优良的纯种（最好是休眠体，如分生孢子、芽孢等），在干燥、低温、缺氧、缺营养以及添加保护剂等环境条件下，降低微生物代谢活动强度，抑制微生物生长繁殖，并使其难以发生突变。,P.233,菌种保藏机构的任务：广泛收集科研和生产菌种、菌株，并加以妥善保管，使之达到不死、不衰、不乱以及便于研究、交换和使用的目的。菌种保藏机构：中国微生物菌种保藏委员会(CCCCM)美国的典型菌种保藏中心(ATCC)英国国家典型菌种保藏所（NCTC）法国里昂巴斯德研究所（IPL）,国内外菌种保藏机构：,国家设立专门的菌种保藏机构,菌种保藏