发酵工程原理与技术

发酵工程原理与技术,第一章总论,一、发酵工程的概念发酵的定义：利用生物细胞（含动物、植物和微生物细胞），在合适的条件下，经特定的代谢途径转变为所需产物或菌体的过程。发酵工程：是发酵原理与工程学的结合，是研究由生物细胞参与的工艺过程的原理和科学，是研究利用生物材料生产有用物质，服务于人类的一门综合性科学技术。,发酵工程利用微生物进行产品生产,抗生素、生物制药、氨基酸、核苷酸、有机酸、饲料添加剂、微生态制剂、生物农药、生物肥料等,医药、轻工、食品、农业、环保、能源等行业,基因工程药物、疫苗及抗体产品,化学工程生物化工生物加工行业,传统生物技术,现代生物技术基因工程菌发酵,一、发酵工程的概念一般的，发酵工程又可称为微生物工程，但严格来说，发酵（微生物培养）只是发酵工程的一部分，而不是全部，但是其核心内容。通常，发酵工程分为两大部分：发酵部分：主要是通过一系列的环节，提供条件，使菌体生长繁殖，并产生发酵所要的目的产物（代谢产物）。提纯部分：这部分是通过一些物理的、化学的手段、方法，将代谢产物从发酵醪中提纯出来，获得最终产品。,一、发酵工程的概念现代发酵工程是以天然生物体和人工修饰的生物体为加工对象，集现代化高新技术为一体，生产产品或服务于人类社会的一种工程技术。现代发酵工程加工的对象生物，除天然生物菌种和变异微生物菌株外，还有基因工程菌、细胞融合菌以及动植物细胞株。发酵工程的无菌概念已由原来的将杂菌排除再发酵系统外的单向概念转变为同时要求发酵系统内的生物体不能逸出系统外的双向概念。发酵的培养技术已不是简单的通气搅拌培养技术，而是要根据生物的类型、目的产物的特征不同而采用更复杂的培养技术，并引入了生化工程放大概念。,二、发酵过程的特点和分类获得发酵产品的条件：适宜的微生物、保证或控制微生物进行代谢的各种条件、进行微生物发酵的设备、精制成产品的方法的设备。发酵过程的特点：1）发酵过程一般都在常温常压下进行的生化反应，反应条件比较温和。2）可采用廉价原材料，甚至可以利用废物为发酵原材料生产高附加值的产品。3）发酵过程是通过生物体的自适应调节来完成的，反应的专一性强，因而，可以得到单一的代谢产物。4）发酵工业相对投资较少，见效较快，具有经济和效能的统一性。,二、发酵过程的特点和分类发酵过程分类：根据发酵对氧的需要：厌氧和有氧发酵根据发酵原料:糖质原料和烃类原料发酵根据发酵状态：液体和固体发酵根据发酵工艺类型：分批发酵和连续发酵根据产物类型：食品发酵、有机酸发酵、氨基酸发酵、维生素发酵、抗生素发酵等,三、发酵工业生产流程发酵工业生产过程主要包括：原料预处理培养基配制无菌空气的制备微生物菌种制备和扩大培养发酵发酵产品的分离和纯化,发酵的流程,空气,空气净化处理,保藏菌种,斜面活化,扩大培养,种子罐,主发酵,碳源、氮源、无机盐等营养物质,灭菌,产物分离纯化,成品,三、发酵工业生产流程发酵原料的预处理原料不同处理方法也有所差异。1.淀粉利用前需变成糊精或葡萄糖。方法：酸水解（高压、耐酸）、酶水解法2.糖蜜加热杀菌和用水冲稀，也可加酸处理后再补充无机盐。3.碳氢化合物：石油脱蜡一定馏分的石油经冷却脱蜡而获得的凝固点在-10的油，加入适量无机盐进行接种发酵。,三、发酵工业生产流程发酵培养基的配制与灭菌（1）目的要明确；（2）培养基的营养要协调；（3）pH要适宜。灭菌:主要采用高压水蒸汽直接对培养基进行加热灭菌，多采用121保温20-30min，然后冷却，这样称之为实罐灭菌；也可采用连续灭菌。,三、发酵工业生产流程无菌空气制备一般采用无菌空气作为氧气来源，高空采风，经空气压缩机加压后采用加热灭菌或过滤除菌。微生物种子的制备一般都是由保存于冷冻管及砂土管或冰箱中的斜面菌种开始，在正式使用前要先转接到新鲜斜面培养基上活化后，再用于种子扩大培养。扩大培养的方法可以根据需要采用固体培养或液体培养两级不同方式。,菌种筛选,摇瓶试验,发酵罐试验,三、发酵工业生产流程发酵过程的操作方式三种模式：间歇发酵、连续发酵和流加发酵间歇发酵又称分批发酵，在发酵过程中，除气体进出外，与外界没有其它的物料交换。分批发酵是一种操作简单并且广泛使用的发酵方式。连续发酵是指以一定的速度向培养系统内添加新鲜的培养基，同时以相同的速度流出培养液，从而使培养系统内培养液的体积维持恒定，使微生物细胞处于近似恒定状态下生长的微生物发酵方式。流加发酵是介于分批发酵和连续发酵之间的发酵形式。发酵产品及分离提纯工艺固液分离技术、细胞破碎技术、浓缩分离技术、精制技术、结晶技术等,四、发酵工程的发展历史发酵现象酿造食品工业非食品工业青霉素抗菌素发酵工业氨基酸,核酸发酵（代谢控制发酵）基因工程菌动物细胞大规模培养植物细胞大规模培养藻类细胞大规模培养转基因动物1、发酵现象的早期认识1680年制成显微镜微生物的存在1857年巴斯德证明了酒精是由活的酵母发酵引起的1897年毕希纳发现磨碎的酵母仍使糖发酵形成酒精酶,四、发酵工程的发展历史2、发酵工程的早期阶段人们的对发酵技术的认识起始于19世纪末，主要来自于厌氧发酵，如利用酵母菌、乳酸菌生产酒精、乳酸和各种发酵食品。20世纪初期，1916年英国采用梭状芽孢杆菌生产丙酮丁醇，德国采用亚硫酸盐法生产甘油（第一次世界大战）由食品工业向非食品工业发展。3、发酵工程的重大转折点二十世纪四十年代初，第二次世界大战爆发，青霉素的发现，迅速形成工业大规摸生产。抗生素工业的发展，建立了一套完整的好氧发酵技术，推动了整个发酵工业的深入发展，现代发酵工程奠定了基础。,四、发酵工程的发展历史3、发酵工程的重大转折点20世纪70年代，细胞融合技术、基因技术等生物技术发展，打破了生物种间障碍，能定向地制造出新的有用的微生物：增加微生物体内控制代谢产物产量的基因拷贝数，可以大幅度地提高目标产物的产量。将动、植物或某些微生物特有产物的控制基因植入细胞中，快速经济地大量生产这些产物。将具有不同性能的多种质粒植入，使新菌株在清除污染或以非粮食物质为原料进行发酵生产或环境保护。,四、发酵工程的发展历史4、发酵工程产业化发展目前，全球发酵产品的年销售额在400亿美元左右，并以每年约78的速率增长。我国发酵行业生产企业有5000多家，主要发酵产品的年产值高达1300亿元。发酵工程技术给人类社会生产力的发展带来了巨大的潜力，涉及到解决人类所面临的食品与营养、健康与环境、资源与能源等重大问题。,五、生物工程与发酵工程的关系发酵工程是生物技术产业化的基础和关键技术，是生物技术四大支柱的核心。发酵工程是生物技术产品走向工业化的必由之路。,生物工程,基因工程,细胞工程,酶工程,产品,发酵工程,产物,产品,第二章发酵工业微生物菌种制备原理和技术,第一节发酵工业微生物菌种的选育第二节工业微生物种子的扩大培养第三节种子培养基及其制备,一、工业微生物的特点工业微生物是指在发酵工业上已经应用的或具有潜在应用价值的微生物，其范围随科学技术的发展而不断扩展。工业微生物的特点：个体小、种类多、繁殖快、分布广、代谢能力强、易变异改造。,第一节发酵工业微生物菌种的选育,二、发酵工业常用微生物菌种及要求（一）发酵工业对菌种的要求1、能在廉价原料制备的培养基上迅速生长并生成所需的代谢产物，且产量高；2、培养条件易于控制；3、生长迅速，发酵周期短；4、满足代谢控制的要求；5、抗噬菌体和杂菌能力强；,二、发酵工业常用微生物菌种及要求（一）发酵工业对菌种的要求6、遗传性状稳定，菌种不易变异退化；7、在发酵过程中产生的泡沫要少；8、对需要添加的前体物质有耐受能力；并且不能将这些前体物质作为一般碳源使用；9、不是病原菌，同时在系统发育上与病原菌无关，不产生任何有害的生物活性物质（包括抗生素、激素和病毒）以保证安全。,（二）工业生产常用的微生物菌种,1、细菌（Bacteria）,细菌是单细胞原核生物，具有环状DNA染色体，以典型的二分分裂方式繁殖。,工业上常用的有枯草芽孢杆菌、醋酸杆菌、乳酸杆菌、棒状杆菌、短杆菌等。,放线菌是介于细菌与丝状真菌之间而又接近于细菌的一类丝状单细胞原核生物。,因菌落呈放射状而得名,2、放线菌（Actinomycetes）,抗生素有60以上是放线菌产生的工业生产常用的放线菌主要来自以下几个属：链霉菌属、小单孢菌属、诺卡菌属,3、酵母菌（Yeast）,酵母菌是单细胞真核生物，常以出芽方式进行无性繁殖。,工业上常用的有：啤酒酵母、假丝酵母、类酵母等,4、霉菌（mould）,霉菌非系统演化分类的单元。凡生长在营养基质上形成绒毛状，网状或絮状菌丝的真菌统称霉菌。,5、担子菌（Basidiomycetes）,担子菌是会产生担子和担孢子的真菌。,担子菌主要用于多糖、橡胶物质和抗癌药物的开发。,6、藻类（Alga）许多国家已把它作为人类保健食品和饲料。还可通过藻类将CO2转变为石油；国外还有从“藻类农场”获得氢能的报道。,6、藻类（Alga）,螺旋藻,栅列藻,单孢藻,三、发酵工业微生物菌种的分离和选育,（一）微生物菌种的分离,1、施加选择压力分离法,施加选择压力分离法是利用不同种类的微生物的生长繁殖对环境和营养（如温度、pH、渗透压、氧气、碳源、氮源等）的要求不同，人为控制这些条件，使之利于某类或某种微生物生长，而不利于其它种类微生物的生存，以达到使目的菌种占优势，而得以快速分离纯化的目的。,使用高糖或高盐培养基进行培养，可获得耐高渗透压的微生物,控制培养基的各种营养成分（如使某种碳源、氮源成为唯一的碳源、氮源），可使能利用此种营养的微生物富集，从而大量获得,控制不同的pH条件，可分离出嗜酸和嗜碱微生物,在高温下培养，将嗜热微生物和非嗜热微生物分开,控制培养时的氧气，将好氧微生物和厌氧微生物分开,在分离培养基中加入不同的抗生素或试剂来增加选择性,具体培养方法有两种方式：,1、分批式富集培养（摇瓶培养）,2、恒化式富集培养（连续培养）,重复移植几次后，接种已富集的培养物到固体培养基，可将优势微生物分离出来。移种时间是关键，应在所需菌占优势时移种。,用于连续发酵生产的菌种选育特别适合。改变限制性基质浓度可以控制两种菌的比生长速率。,2、随机分离方法,（1）抗生素产生菌的分离,抑菌圈法:工具菌采用抗生素的敏感菌。若被检菌能分泌某些抑制工具菌生长的物质，如抗生素等，便会在该菌落周围形成工具菌不能生长的抑菌圈，很容易被鉴别出来。如春雷霉素和青霉素等。除使用高灵敏度的工具菌外，可以利用专一性很强的酶，酶抑制剂，激活剂，抗体等建立高灵敏度，专一的筛选技术。,（2）抗肿瘤药物产生菌的分离,临床上抗肿瘤药物大部分是直接作用于核酸或抑制核酸生物合成的物质，由于微生物和人的核酸结构与生物合成方式有许多共同之处，所以大部分抗肿瘤药物也具有抗菌活性，据此发展出利用微生物筛选作用于DNA的抗肿瘤药物的方法。,生化诱导分析法（BIA）,SOS显色法,原理一：,生物体中都存在两个以上的DNA修复基因，如果一个DNA修复基因损伤或变异，通常仍能存活，但对能引起DNA损伤的化合物十分敏感，易发生死亡，所以可以利用DNA修复能力突变株筛选抗肿瘤药物。,实践中常使用大肠杆菌或枯草芽孢杆菌的重组缺失DNA修复基因突变株和亲株作为测试菌来筛选抗肿瘤药物。,原理二：,（3）酶抑制剂产生菌的分离,酶抑制剂的生产主要是为了治疗某些疾病，如为治疗糖尿病需要糖苷酶抑制剂（阻止淀粉等分解为可被吸收的单糖），为治疗肥胖需要脂肪酶抑制剂（阻止对摄入的脂肪物质的消化吸收）等等。,酶抑制剂产生菌的筛选，主要以所需抑制的酶为靶酶进行筛选。,如果某种化合物能在体外抑制某种关键的人体酶，它就可能在体内有药理作用，所以可以在体外进行筛选。,例：糖苷酶抑制剂产生菌分离,糖苷酶包括淀粉酶、蔗糖酶和麦芽糖酶将待筛菌的菌丝提取物加入含-淀粉酶和1淀粉的溶液中，在适合淀粉酶水解淀粉的条件下经过一段时间，然后通过于540nm处比色测定OD值，确定淀粉的酶活力，如果酶活力被明显抑制则证明此菌可产生-淀粉酶抑制剂。,例：脲酶抑制剂产生菌的分离（阻止土壤中尿素分解损失）,将不同地点分离的水稻土和厩肥中的待筛微生物的单菌落菌株接种在含2尿素和0.1酚红的琼脂培养基上形成单菌落（每一皿可以多接些菌株，如10株），培养一段时间后在培养基表面倒一层一定浓度的脲酶溶液，由于脲酶分解尿素产生碱性物质会使含酚红的培养基由黄色变为红色，如果某个菌落周围的培养基不变红，则证明此菌会产生脲酶抑制剂。,（4）抗病毒药物产生菌的分离,b、用小平板测定由病毒引起的细胞变性效应（CPE：Cytopathiceffect），更多称细胞病变效应。,c、检测病毒复制中特有的DNA复制酶和核酸合成酶的酶抑制剂。,a、利用作用于核酸的方法，如噬菌斑法。如：壳二孢氯素、衣霉素的分离,（5）生长因子产生菌的分离,通过观察分离菌能否促进营养缺陷型菌株的生长，来检出生长因子产生菌。,例如氨基酸产生菌的筛选：首先将待试菌接入加了抗真菌化合物（如亚胺环己酮）的分离培养基中生长，然后采用影印法，将菌落复印到能支持氨基酸产生菌生长的培养基中，培养2-3d后，用紫外线杀死长好的菌落，再往此平板上面铺一层含有相应氨基酸营养缺陷的营养缺陷型菌株悬液，培养16h后，被杀死的氨基酸产生菌的菌落周围应有一检测菌的生长圈。这样在另一个复印的平板相应的位置上便可以找出产生菌。,（6）免疫激活剂产生菌的分离,现已经发现抑制细胞表面的氨基肽酶B，氨基肽酶A，碱性磷酸脂酶会增强细胞性免疫或抗体产生能力，所以可以利用细胞表面酶的抑制法来筛选免疫激活剂产生菌。,（7）多糖产生菌的分离,一般认为制糖工业，食品加工厂等产生的污水中，可能含有较多的多糖产生菌，并且这类菌的菌落外观一般比较粘稠，可以通过菌落外观的观察来识别。,（二）微生物菌种的选育,1、自然选育,不经过人工处理，利用微生物自然突变进行菌种选育的过程称为自然选育。,自然选育的一般程序是将菌种制成菌悬液，用稀释法在固体平板上分离单菌落，再分别测定单菌落的生产能力，从中选出高水平菌种。,自然选育简单易行，可以达到纯化菌种，防止菌种退化，稳定生产，提高产量的目的。,2、诱变选育,诱变育种是利用各种被称为诱变剂的物理因素和化学试剂处理微生物细胞，提高基因突变频率，再通过适当的筛选方法获得所需要的高产优质菌种的育种方法。,（1）诱变育种的原理,诱变育种的理论基础是突变，主要包括染色体畸变和基因突变两大类。,染色体畸变指的是染色体或DNA片段发生缺失，易位，逆位，重复等。,基因突变指的是DNA中的碱基发生变化即点突变。,（2）诱变育种的基本方法,诱变育种一般包括诱变和筛选两个部分，是诱变和筛选过程的不断重复，直到获得高产菌株。,A、诱变,诱变的关键包括出发菌株的选择，诱变剂种类和剂量的选择以及合理的使用。,a、出发菌株的选择,出发菌株要有一定的目标产物的生产能力。其它生产性能如生长繁殖快，营养要求低，产孢子多而早，对诱变剂敏感，变异幅度大等。,可以选择已经诱变处理的菌株，因为其对诱变剂的敏感性会有所提高。,b、诱变剂种类的选择,单一诱变剂处理,复合诱变剂处理,c、诱变剂剂量的选择,诱变剂的剂量与致死率有关，而致死率又与突变率有一定的关系，因此可用致死率作为诱变剂剂量选择的依据。,一般突变率随诱变剂剂量的增加而提高，但达到一定的程度以后，再提高剂量反使突变率下降。,B、筛选,诱变处理后，正向突变的菌株通常为少数，要用各种方法筛选出来,a、营养缺陷型突变株的筛选,某些菌株发生突变（自然突变或人工诱变）后，失去合成某种（或某些）对该菌株生长必不可少的物质（通常是生长因子如氨基酸，维生素）的能力，必须从外界环境获得该物质才能生长繁殖，这种突变型菌株称为营养缺陷型。,（a）营养缺陷型定义,（b）营养缺陷型的意义,在营养缺陷型突变菌株中，生物合成途径中的某一步发生了酶缺陷，合成反应不能完成，末端产物不能积累，因此末端产物的反馈调节作用被解除。只要在培养基中限量加入所要求的末端产物，克服生长障碍，就能使中间产物积累。,营养缺陷型突变株具有明显的遗传标记，在杂交育种中作为出发菌株，有利于杂交重组的分析。,营养缺陷型突变株具有明显的遗传标记，可以作为基因工程中的受体菌，检出克隆基因的表达。,（c）营养缺陷型的筛选,首先：淘汰野生型，浓缩缺陷型,经诱变处理后，缺陷型还是相当少的，必须设法淘汰野生型细胞，提高营养缺陷型细胞所占比例，以达到浓缩缺陷型的目的。,有青霉素法和制霉菌素法等数种。青霉素法适用于细菌，青霉素能抑制细菌细胞壁的生物合成，杀死正在繁殖的野生型细菌，但无法杀死正处于休止状态的营养缺陷型细菌。制霉菌素法则适合于真菌，制霉菌素可与真菌细胞膜上的甾醇作用，从而引起膜的损伤，也是只能杀死生长繁殖着的酵母菌或霉菌。在基本培养基中加入抗生素，野生型生长被杀死，营养缺陷型不能在基本培养基中生长而被保留下来得以浓缩。,(1)抗生素法,适用于进行丝状生长的真菌和放线菌。其原理是：在基本培养基中，野生型菌株的孢子能发芽成菌丝，而营养缺陷型的孢子则不能。通过过滤就可除去大部分野生型，保留下营养缺陷型。,(2)菌丝过滤法,然后：检出缺陷型,先在培养皿底部倒一薄层不含菌的基本培养基，待凝，添加一层混有经诱变剂处理菌液的基本培养基，其上再浇一薄层不含菌的基本培养基，经培养后，对首次出现的菌落用记号笔一一标在皿底。然后再加一层完全培养基，培养后新出现的小菌落多数都是营养缺陷型突变株。,(1)夹层培养法,把诱变处理后的细胞接种在含有微量（0.01%）蛋白胨的基本培养基平板上，野生型细胞就迅速长成较大的菌落，而营养缺陷型则缓慢生长成小菌落。若需获得某一特定营养缺陷型，可再在基本培养基中加入微量的相应物质。,(2)限量补充营养法,(3)影印平板法,可以将诱变后的菌液稀释后接种在完全培养基上，使之形成单株菌落，然后将菌落分别影印到基本培养基和完全培养基上继续培养，那些在基本培养基上不能生长的菌落就是营养缺陷型菌株的菌落，到完全培养基的相应位置就可以得到营养缺陷型菌株。,完全培养基上长成单孢菌落,无菌丝绒布,橡皮箍,圆木柱,轻压在绒布上,接上所有菌落的绒布,转印在新鲜的培养基上,基本培养基,完全培养基,所有菌都长,营养缺陷型不长,(3)影印平板法,b、抗反馈阻遏和抗反馈抑制突变菌株的筛选,末端产物的反馈调节在生物合成途径中普遍存在。抗反馈阻遏和抗反馈抑制两种突变均是由于代谢失调，它们有共同的表型，即在细胞中已经有了大量的末端产物时仍不断合成这一产物。,（a）因为调节基因或操纵基因发生突变，使产生的阻遏蛋白不再能和终产物结合或结合后不能作用于已突变的操纵基因。因此不再起反馈阻遏作用。,（b）由于编码酶的结构基因发生突变，使变构酶不再具有结合终产物的能力，但仍具有催化活性，从而解除反馈抑制。,代谢失调的原因：,筛选方法1：,通常抗反馈阻遏和抗反馈抑制突变菌株是通过抗结构类似物突变的方法筛选出来的。结构类似物与末端产物具有相似的结构，能与阻遏蛋白或变构酶结合，阻止产物的合成，引起反馈调节作用，但它们不能代替末端产物参与生物合成，它们的浓度不会降低，因此，它们与阻遏蛋白或变构酶的结合是不可逆的。未突变的细胞因代谢受阻，不能合成某种产物而死亡。抗反馈调节的突变株则即使在结构类似物存在的条件下仍可以合成末端产物形成菌落。,筛选方法2：,可以从营养缺陷型的回复突变株获得抗反馈突变株。营养缺陷型突变株是因为对反馈调节作用敏感的酶钝化或缺失等原因所致，发生回复突变后，虽然酶的催化活性恢复了，但酶的结构发生了改变，对反馈调节作用不敏感，因此可过量积累末端代谢产物。,c、组成型突变株的筛选,微生物的产酶过程通常都受到底物诱导、终产物或分解代谢物的阻遏等机制的调节，为了解除对诱导物的依赖，摆脱阻遏调节，须筛选组成型突变株。突变发生在调节基因或操纵基因,解除对诱导物的依赖,可获组成型突变株。筛选方法：设计条件使组成型优势生长，或通过菌落分辨。加诱导酶合成抑制物交替培养法显色反应法,例1：加诱导酶合成抑制物以-半乳糖苷酶生产为例，将诱变处理后的菌种培养在含有抑制物邻硝基-D-岩藻糖苷和乳糖的培养液中。在这种培养液中，-半乳糖苷酶的合成被抑制，因此诱导型菌株不能利用乳糖，则不能生长，而组成型菌株能够合成-半乳糖苷酶，利用乳糖生长，使组成型被富集。,例2：交替培养法将诱导型菌株经诱变处理后，先在含诱导剂如乳糖的培养液中培养，由于组成型的菌株不需诱导物就能合成-半乳糖苷酶，利用乳糖，因此它会先于诱导型开始生长，在一段时间内，它们的菌数会增加很快。当诱导型在诱导物的诱导下合成-半乳糖苷酶，开始利用乳糖生长时，就将细菌全部转入葡萄糖培养基中，在葡萄糖培养基中两类菌同样生长繁殖，但是组成型菌株仍能合成-半乳糖苷酶，而诱导型菌株的-半乳糖苷酶合成停止，并且酶活力逐渐丧失。这时再将全部细菌转入乳糖培养基，组成型菌株又获得一次优势生长。如此反复多次后，组成型菌株数量大大超过诱导型菌株，然后用平板培养基分离出组成型菌株的单菌落。,例3：显色反应法利用显色反应在平板上识别组成型菌株。在不含诱导物的平板上进行培养，由于组成型菌株能产生酶，培养后加入适当的所产生的酶的底物反应。常采用经酶解后有颜色变化的底物，以便快速检出组成型菌落。如：用邻硝基苯半乳糖苷来筛选-半乳糖苷酶组成突变型。(邻硝基苯半乳糖苷被分解后生成黄色的硝基苯酚)如：用刚果红来筛选纤维素酶组成突变型。（刚果红可使纤维素酶水解纤维素露出的还原基被染上色）,包括：抗生素、金属离子、温度、噬菌体抗生素抗性突变：提高产量抗噬菌体突变：消除噬菌体污染条件抗性突变：如温度，可提高产量物敏突变：提高产量,d、抗性突变株的筛选,抗性突变菌株的筛选,抗生素抗性突变株,在抗生素产生菌选育中，通过筛选抗生素抗性突变可提高抗生素产量。,抗生素抗性突变株除能提高抗生素的产量外，还能提高其它代谢产物的量。,条件抗性突变株,因环境不同，能表现为野生型菌株的特性和突变型菌株特性的突变称为条件抗性突变或称为条件致死突变。,温度敏感突变常用于提高代谢产物产量,致死,营养缺陷,抗性突变菌株的筛选方法,一次性筛选法,一次性筛选法就是指在对出发菌株完全致死的环境中，一次性筛选出少量抗性变异株。,噬菌体抗性菌株,耐高温菌株,阶梯性筛选法,梯度平板法,纸片扩散法,用打孔器将较厚的滤纸（如新华六号）打成小圆片，并使纸片吸收一定浓度的药物，经干燥或不经干燥，放入涂布了菌悬液的平板上，一般9厘米的培养皿中等距放置三片为宜。经培养后观察围绕纸片的抑菌圈，抑菌圈内出现的可能就是抗性菌。,3、杂交育种,（1）杂交育种的优点,a、通过具有不同遗传性状菌株的杂交，使遗传物质进行交换和重新组合，改变亲株的遗传物质基础，扩大变异范围，使两株的优良性状集中在重组体内，获得新品种。,b、通过杂交后获得具有新遗传特性的重组体，不仅可克服因长期诱变造成的生活力下降，代谢缓慢等缺陷，也可以提高对诱变剂的敏感性，降低对诱变剂的疲劳效应。,c、通过杂交可以总结遗传物质的转移和传递规律，丰富并促进遗传学理论的发展。,（2）杂交育种的方法,微生物常规杂交形式,4、原生质体融合,（1）原生质体融合法的定义,原生质体融合法是首先用酶分别酶解两个出发菌株的细胞壁，在高渗的环境下释放出原生质，将它们混合，在助融剂或电场的作用下，使它们互相凝集，发生细胞融合，实现遗传重组。,（2）原生质体融合法的优越性,a、受接合型和致育型的限制小，两亲株没有供体和受体之分，有利于不同种属微生物的杂交。,b、重组频率高于其他杂交方法。,c、遗传物质的传递更加充分、完善，既有核配又有质配。,d、可以用温度、药物、紫外线等处理纯化亲株的一方或双方，然后使其融合，筛选再生重组子菌落，提高筛选效率。,e、用微生物的原生质体进行诱变，可明显提高诱变频率。,（3）原生质体融合法的步骤,a、原生质体制备,b、原生质体融合,c、原生质体再生,d、融合子的检出,5、基因工程育种,基因工程是用人为的方法将所需的某一供体生物的遗传物质DNA分子提取出来，在离体的条件下进行“切割”，获得代表某一性状的目的基因，把该基因与作为载体的DNA分子连接起来，然后导入某一受体细胞中，让外来的目的基因在受体细胞中进行复制和表达，从而获得目的产物。由于该受体细胞即包含了原有的一整套遗传信息，同时也含有外来基因的遗传信息，是一个自然演化中根本不存在的全新物种。,携带人血清白蛋白基因的转基因试管牛“滔滔”,（1）基因的分离,去垢剂（如SDS）溶解细胞；,用酚和蛋白酶除去蛋白质；,核糖核酸酶除去RNA；,乙醇沉淀。,a、总DNA提取：,b、分离特定的目的基因：,物理分离法；互补DNA分离法；“鸟枪法”,（2）DNA分子的切割与连接,（a）粘性末端连接：用同一种限制性内切酶或者用能够产生相同粘性末端的两种限制性内切酶分别消化外源DNA分子和载体，所形成的DNA末端彼此互补，用DNA连接酶共价连接起来，形成重组体DNA分子。,（b）平头末端连接：将平末端的DNA分子在T4DNA连接酶催化下，使DNA分子的3OH和5P进行共价结合。,（c）人工接头法：指利用人工接头加在平端DNA片段的两端，然后用相应限制酶切割人工接头以产生黏性末端，再与带相同黏性末端的载体相连。,（d）同源多聚尾连接法：在末端脱氧核苷酸转移酶催化下，在线型载体分子的两端加上单一核苷酸如dG组成的多聚尾；而在目的DNA分子的两端加上dC尾，两者混合退火，然后经DNA聚合酶或Klenow填补裂口处缺失的核苷酸，再通过DNA连接酶修复成环状的双链DNA。,（3）载体,a、常用的载体,质粒,噬菌体,黏粒,单链噬菌体M13,b、载体应具备的特点,（a）载体本身是一个单独的复制子，在共价连接了外源DNA后仍能自我复制。,（b）对某些限制酶只有一个切口，并在酶作用后不影响其自主繁殖能力。,（c）从细菌核酸中分离和纯化很容易。,（d）在宿主中能以多拷贝的形式存在，有利于插入的外源基因的表达，能在宿主中稳定地遗传。,（4）引入宿主,（5）重组体的选择和鉴定:分两步,a、先根据载体的遗传标记等选择出含有重组分子的细胞。,b、进一步根据外源DNA的遗传特性进行鉴定。,（6）外源基因的表达,影响外源基因表达的因素,四、发酵工业微生物菌种的退化、复壮与保藏,（一）微生物菌种的退化及原因,2、引起菌种退化的原因,（1）基因突变,（2）变异菌株性状分离（广义的退化）,（3）连续传代,（4）其它因素,（二）防止菌种的退化和退化菌种的复壮,1、防止菌种退化的方法,（1）控制传代次数,（2）选择合适的培养条件,（3）利用不同类型的细胞进行传代,（4）选择合适的保藏方法,2、退化菌种的复壮,复壮：使衰退的菌种重新恢复原来的优良特性称为复壮。常用方法：对已退化菌株用一定培养条件进行单细胞分离纯化，淘汰已退化菌落而使原菌株得以复壮。,（三）菌种的保藏,1、菌种保藏的意义,2、菌种保藏的原理,3、菌种保藏的方法,（1）斜面低温保藏法,（2）石蜡油封保藏法,（3）砂土管保藏法,（4）冷冻干燥法,（5）超低温保藏法,第二节工业微生物种子的扩大培养,种子扩大培养：是指将保存在砂土管、冷冻干燥管等中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过摇瓶或静置培养及种子罐逐级放大培养而获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。,发酵工业生产过程中的种子的必须满足以下条件：,1、菌体培养物总量适宜，以保证在发酵罐中有适当的接种量。,2、菌种的生命力旺盛，移接到发酵罐中后能迅速生长，延滞期短。,3、菌种能保持稳定的生产性能，生理状态稳定。,4、无杂菌和噬菌体污染。,一、菌种扩大培养的任务,菌种扩大培养的任务就是要为每只发酵罐的投料提供相当数量代谢旺盛的种子。,二、种子制备的过程,1、种子扩大培养的工艺流程,2、实验室种子培养,实验室种子培养阶段目的是为种子罐提供种子，包括琼脂斜面、固体培养基扩大培养或摇瓶液体培养。,（1）固体斜面菌种培养,（2）固体培养基扩大培养,（3）摇瓶液体培养,3、生产车间种子制备,（1）种子罐培养基,（2）种子罐接种,微孔接种法：利用注射器在罐的接种口橡皮膜上注入罐内进行接种。,（3）种子罐级数,种子罐级数是指制备种子需要逐级扩大培养的次数。,二级发酵；三级发酵,细菌：生长快，种子用量比例少，级数也较少，二级发酵。茄子瓶种子罐发酵罐霉菌：生长较慢，如青霉菌，三级发酵。孢子悬浮液一级种子罐（27C,40小时孢子发芽，产生菌丝）二级种子罐（27C,1024小时，菌体迅速繁殖，粗壮菌丝体）发酵罐放线菌：生长更慢，采用四级发酵。酵母：比细菌慢，比霉菌，放线菌快，通常用一级种子。,确定种子罐级数需注意的问题,级数受发酵规模、菌体生长特性、接种量的影响；,级数大，难控制、易染菌、易变异，管理困难，一般2-4级。,在发酵产品的放大中，反应级数的确定是非常重要的一个方面。,种子级数越少越好，可简化工艺和控制，减少染菌机会；,（4）菌种的种龄,菌种的种龄是指种子罐中的培养物移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。种龄短：菌体太少；种龄长：易老化。原则：对数生长期，细胞活力强，菌体浓度相对较大，但是最终由实验结果定。,（5）种子罐和发酵罐的接种量,双种法：用两只种子罐接种一只发酵罐的接种方法。,倒种法：从一只发酵罐中倒出适宜的，适量的发酵液给另一发酵罐做种子的方法。,（5）接种量接种量的大小决定于生产菌种在发酵罐中生长繁殖的速度。通常接种量，细菌15%，酵母菌510%，霉菌715%、有时2025%。,移入种子的体积接种量接种后培养液的体积,三、发酵工业种子培养,1、种子扩大培养的方法,静置培养法（厌气性发酵）通气性培养（好气性发酵）作为种子扩大培养的方法：表面培养法固体培养法液体培养法（三角瓶摇床震荡或转式培养）载体培养法,浅盘固体培养深层固体培养,固体培养法（曲法培养）,优点：（1）酶活力高。（2）生产过程中无菌程度要求不很严格。（3）对于固体发酵，由于产物浓度大，易于分离，可以有效的降低产品分离成本。缺点：（1）生产劳动强度较大，占地面积大，不宜自动化生产。（2）周期长。（3）培养过程中环境条件控制较难。（4）生产过程中，由于无菌程度较低，其菌种不纯。,液体深层培养法,优点：（1）生产效率高，便于自动化管理。（2）生产过程中温度、溶氧、pH值等参数可以实现全面控制。（3）通常生产液体种子，整个生产周期较短。缺点：（1）无菌程度要求高，相对生产设备投资较大。（2）对于某些种类的发酵，液体培养因投资大、生产密度大而难以实现。,几种深层培养法,放大法两步法控制培养法分批培养法(间歇发酵法)连续培养法补料分批培养法(流加法),种子质量的最终指标是考察其在发酵罐中所表现出来的生产能力。菌种稳定性的检查无杂菌检查,种子液生化分析项目主要有：营养基质的消耗速度、pH变化、溶氧变化、色泽和气味等。,四、影响种子培养的因素和种子质量的控制,1、种子质量的判断,2、种子质量标准,影响种子质量的因素,接种量,种龄,染菌控制,培养基,培养条件,3、影响种子质量的因素,主要是碳源、氮源、无机盐、生长素和水等。糖份少而氮源多些(菌体增殖为主要目的)。与发酵培养基的主要成分相近。,*培养基：,*种龄和接种量：,温度过低，菌种生长发育缓慢。温度过高，会使菌丝过早自溶。湿度低，孢子生长快。湿度大，孢子生长慢。,*培养温度和湿度：,选择最适种子培养pH的原则是获得最大比生长速率和适当的菌量。培养最后一级种子的培养基的pH应接近于发酵培养基的pH，以便种子能尽快适应新的环境。,*pH：,溶解氧的作用：参与菌体呼吸作用搅拌：促进氧的溶解与营养物质及代谢产物的分散。通气量的多少以溶解氧的多少来衡定（溶解氧浓度应不低于临界溶氧浓度）。通气过程中，影响溶解氧的因素：菌种（丝状影响最大）；培养基性质；培养阶段；发酵罐的结构。,*通风和搅拌：,危害：影响微生物对氧的吸收；妨碍CO2的排除；减少设备利用率（有效容积减少）；造成跑料，导致染菌；消泡方法：（1）消泡剂：天然动植物油、石油化工矿物油；改性油，表面活性剂（有机硅聚合物）；（2）机械消泡（3）改变培养基成分,*泡沫：,染菌原因：设备、管道、阀门漏损、发酵罐结构“死角”、灭菌不彻底、空气净化不好、无菌操作不严、菌种不纯,*染菌的控制：,种子罐级数越少，越有利于简化工艺，便于控制，减少染菌。种子罐级数取决于：种子的性质（生长繁殖性能）孢子瓶中孢子的密度（密度大则级数少）孢子发芽及菌丝繁殖速度发酵罐中种子的最低接种量种子罐与发酵罐的容积比,*种子罐级数的决定：,4、种子异常的分析,第三节种子培养基及其制备,一、菌体组成和细胞外代谢产物,1、菌体组成,2、细胞外代谢产物,微生物的代谢产物可分为：初级代谢产物定义：微生物通过代谢活动所产生的、自身生长和繁殖所必需的物质。举例：氨基酸、核苷酸、多糖、脂类、维生素、有机酸、蛋白质等。特征：不同的微生物初级代谢产物基本相同；初级代谢产物合成过程是连续不断的；与菌体的生长呈平行关系。,次级代谢产物定义：微生物生长到一定阶段才产生的化学结构十分复杂、对该微生物无明显生理功能，或并非是微生物生长和繁殖所必需的物质。举例：抗生素、毒素、激素、色素等。特征：不同的微生物次级代谢产物不同；次级代谢产物的通常在菌体的生长后期合成；发酵分两个阶段进行，营养增殖期和生产期。在多数情况下，增加前体是有效的。,两种代谢产物的不同：,1、次级代谢通常在生长后期合成。不是微生物生长所必需的，不参与微生物的生长和繁殖。2、次级代谢对环境条件的变化很敏感，其产物的合成往往会因环境条件的变化而停止。3、不同微生物的次级代谢产物有很大区别。基于菌种的特异性。4、催化次级代谢产物合成的某些酶专一性不强。,3、微生物的营养类型,二、种子培养的培养基选择和配置原则,1、种子培养基的营养成分及来源,（1）碳源物质,a、碳源物质作用,b、种子培养基的碳源物质：葡萄糖、糊精等,（b）提供能源,（2）氮源物质,a、氮源物质作用,核酸,蛋白质,（a）提供合成细胞结构物质所需氮素,（b）碳源不足时可为某些厌氧微生物提供能源,（3）无机盐类,a、无机盐类的作用,（a）提供合成细胞结构物质所需元素,（b）作为酶的组成部分或维持酶的活性,（c）调节渗透压、pH、氧化还原电位等,（4）生长因子,维生素、生物素、硫胺素、肌醇等,（5）水,水的作用,（a）细胞重量的绝大部分,（b）良好的溶剂,（c）各种生化反应必须在水溶液中进行,2、培养基的类型和用途,天然培养基是利用动、植物或微生物体或其提取物制成的培养基，其化学成分还不清楚，比较复杂。,（1）根据原料划分,a、天然培养基,b、合成培养基,合成培养基是利用化学成分明确的物质配制而成的培养基。,缺点：价格较贵，配制繁琐。,优点：成分精确，重演性高,（2）根据培养基外观物理状态划分,固体培养基、液体培养基、半固体培养基,3、培养基的配制原则,（1）选择适宜的营养物质,（2）营养物质浓度及配比合适,氮源不足：菌体生长过于缓慢。,碳源不足：菌体衰老和自溶。,高浓度糖类物质和无机盐等有抑菌和杀菌作用。,营养物质间的浓度配比直接影响微生物的生长繁殖，其中碳氮比（C/N）尤其重要。,（3）选择合适的pH,（4）氧化还原电位,厌氧菌的培养基中往往要加入还原剂来降低氧化还原电位。,微生物的正常生长均需要合适的pH，一般霉菌和酵母菌比较适于微酸性环境，放线菌和细菌适于中性或微碱性环境。,4、培养基成分配比的选择,（1）种子培养基,种子培养基一般要求营养成分适当丰富和完全些，尤其是氮源的含量应该较高。（即C/N比值低）,营养缺陷型菌株应添加生长因子。,培养基的成分必须是一些容易被菌体直接吸收利用的物质，保证其旺盛生长。,种子罐种子还要考虑和发酵罐培养基尽量接近。,（2）孢子培养基,营养不能太丰富，碳、氮源不宜过多，特别是有机氮源要低，否则不易形成孢子。,无机盐的浓度要适当，否则会影响孢子的颜色和孢子的数量。,发酵工程的流程,空气,空气净化处理,保藏菌种,斜面活化,扩大培养,种子罐,发酵罐,培养基制备灭菌,灭菌,产物分离纯化,成品,原料预处理,第一节发酵工业原料的种类和成分第二节淀粉水解糖的制备第三节发酵培养基灭菌,第三章发酵工业原料及其处理,发酵培养基是要求最严格的培养基，它具有双重任务，一是供菌体生长繁殖，二是使菌种能够大量产生发酵产品。因此,发酵培养基的营养成分即要丰富和完全，有要求严格控制，尤其是那些对发酵产物的形成有严重影响的成分。发酵培养基中营养成分除碳源、氮源、无机盐、生长因子及水等物质外，还要有前体、促进剂和抑制剂等物质。,第一节发酵工业原料的种类和成分,一、发酵培养基中各种成分的定量及原料,1、碳源物质,一、发酵培养基中各种成分的定量及原料,第一节发酵工业原料的种类和成分,（1）碳源物质作用,a、提供合成细胞物质所需碳素,b、提供能源（生长及合成产物）,c、提供目的产物中的碳,（3）工业上常用作碳源的淀粉质原料,a、淀粉的性质,不同产地甘薯的淀粉颗粒,b、淀粉质原料,（a）工业淀粉,谷类淀粉：结构致密、颗粒较小,薯类淀粉：结构疏松，颗粒较大,常用工业淀粉：玉米淀粉、小麦淀粉、甘薯淀粉、马铃薯淀粉,（b）谷类,（c）薯类,2、氮源物质,a、提供合成细胞物质所需氮素。,（1）氮源物质作用,b、碳源不足时可为某些厌氧微生物提供能源,c、如果目的产物有氮素存在要提供目的产物所需氮素。,（3）工业上常用做氮源的蛋白质类原料,黄豆饼粉：抗生素,玉米浆：用量0.40.8,蛋白胨,酵母粉,蚕蛹粉：制霉菌素,3、无机盐,（1）发酵培养基中的无机盐,a、磷酸盐,（a）作用,I、提供某些蛋白质、核酸、ADP、ATP所需磷元素,II、缓冲作用,b、硫酸镁,（a）作用,I、提供酶的激活剂镁元素,II、为菌体提供合成含硫蛋白的硫源,（b）工业需要量,MgSO47H2O：0.251g/L,c、钾盐,II、是某些酶的激活剂,（2）培养基中无机盐的浓度,能直接结合到产物中，而自身结构没有多大变化，但是产物产量却有较大提高。青霉素生产中，加入玉米浆，产量增加，原因是玉米浆含有苯乙胺，被优先结合到青霉素分子中去。有些前体浓度过高时对菌体有毒性。此外，菌体还能分解前体，且前体相对价格较高，添加过多，容易引起挥发和氧化，因此常采用少量多次地加入。,青霉素：分子量356,苯乙酸:分子量136,4、前体,4、前体,促进剂指那些既不是营养物又不是前体，但却能提高产量的添加剂。例如：加巴比妥盐能使利福霉素单位增加，并能使链霉菌推迟自溶，延长分泌期。加酵母甘露聚糖可诱导甘露糖苷酶的产生，促使甘露糖链霉素转化为链霉素。控制生物素的加入量，可以促进谷氨酸从细胞内分泌到细胞外。加聚乙烯醇衍生物可防止菌丝结球，提高糖化酶的产量。,5、促进剂、抑制剂,抑制剂会抑制某些代谢途径的进行，同时会使另一代谢途径活跃，从而获得人们所需的某种产物，或使正常代谢的某一代谢中间物积累起来。例如：微生物发酵生产甘油，在发酵液中加入亚硫酸氢钠，它与代谢中产生的乙醛生成加成物，使乙醇的产生受阻，亚硫酸盐是乙醇代谢的抑制剂，促使甘油形成。溴化剂能抑制金霉素形成的代谢途径，促使四环素的生成。,5、促进剂、抑制剂,大多数微生物不能直接利用淀粉（所有的氨基酸生产菌不能直接利用）。有些微生物能够直接利用淀粉作原料，但必须在微生物产生淀粉酶后才能进行，过程缓慢，发酵周期延长。若直接利用淀粉作原料，灭菌过程的高温会导致淀粉结块，发酵液粘度剧增。因此，在发酵生产之前，必须将淀粉水解为葡萄糖，才能供发酵使用。在工业生产中，将淀粉水解为葡萄糖的过程称淀粉的糖化，制得的溶液叫淀粉水解糖。,第二节淀粉水解糖的制备,淀粉水解糖的制备方法及原理,淀粉水解的过程淀粉吸水膨胀糊化-淀粉酶或酸液化糊精糖化酶或酸低聚糖麦芽糖葡萄糖（由7-12个葡萄糖残基组成）3-6个2个1,淀粉水解糖的制备方法及原理,酸解法酶解法酸酶结合法,原料：薯类、玉米、小麦、大米等原料淀粉的性质和水解使用的催化剂的不同,第二节淀粉水解糖的制备,一、酸水解法,酸水解法是以酸（无机酸或有机酸）为催化剂，在高温高压下将淀粉水解为葡萄糖的方法。,水解过程：总反应式：(C6H10O5)n+nH2OnC6H12O6过程：(C6H10O5)n(C6H10O5)xC12H22O11C6H12O6淀粉糊精麦芽糖葡萄糖H+对作用点无选择性，-1,4-糖苷键和-1,6-糖苷键均被切断。,H+对淀粉的糖苷键作用没有一定顺序，糖链的断裂不规则，同时生成糊精，低聚糖，麦芽糖和葡萄糖。,随着水解进行，葡萄糖，麦芽糖等还原性糖越来越多，当葡萄糖值60后，葡萄糖复合与分解反应明显，会产生其它有味物质（如苦的龙胆二糖）以及色泽加深。,淀粉葡萄糖复合二糖5羟甲基糠醛复合低聚糖有机酸、有色物质在淀粉的酸水解过程中，三种反应同时发生,复合反应,分解反应,盐酸,副反应,酸解法,不利影响：复合反应：生成的多数复合糖不能被微生物利用，使发酵结束时残糖高。分解反应：生成的5羟甲基糠醛是产生色素的根源，增加了糖化液精制脱色的困难。总：降低了葡萄糖的收率。给产物的提取和糖化液的精制带来困难。,酸解法,如何控制分解反应和复合反应的发生？淀粉乳浓度酸浓度不能过高温度,酸解法,工艺流程原料（淀粉、水、盐酸）调浆通蒸汽糖化冷却中和（Na2CO3)、脱色（活性碳）过滤除杂糖液,2、淀粉酸水解法制糖的工艺过程,（1）淀粉酸水解法工艺流程,优点：工艺简单，水解时间短，生产效率高，设备周转快。缺点：副产物多，影响糖液纯度，一般DE值只有90左右。对淀粉原料要求严格，不能用粗淀粉，只能用纯度较高的精制淀粉。,酸解法,DE值：dextroseequivalentvalue（葡萄糖当量值）表示淀粉糖的含糖量。还原糖含量（）DE值100干物质含量（）,DE值,2、淀粉酸水解法制糖的工艺过程,（2）淀粉酸水解法工艺条件的确定,b、无机酸的选择和用量,国内普遍采用催化效能最高的盐酸。用量为干淀粉的0.60.7。,缺点：催化复合反应的能力也大；对设备腐蚀较大；中和后产生氯化物，增加糖液盐分,b、无机酸的选择和用量,c、水解的温度与压力,靠控制压力来控制加热蒸气的温度。,温度越高水解速度越快，但同时复合与分解反应也越快，且对设备腐蚀加强，对设备的耐压性能要求高。,据经验，宜控制在蒸气压力为0.280.32MPa（表压）为好。,d、淀粉乳浓度,淀粉乳浓度高可保证发酵配料需要并可提高生产效率，但复合分解反应多，糖液纯度降低，色泽加深。,易于水解的淀粉原料（薯类淀粉等）淀粉乳浓度要高些，不易于水解的淀粉原料（谷类淀粉等）淀粉乳浓度要低些。,e、糖化终点,糖化时间过短水解不完全，糊精含量高，葡萄糖含量低，糖液质量差，对发酵和产物提取都不利。,糖化时间过长复合分解反应强，复合糖多，色素增加，葡萄糖值也降低。,糖化终点检测：无水乙醇,（3）糖化设备结构对糖液质量的影响,（4）水解糖液的中和、脱色除杂,a、中和,（a）中和的作用,I、除酸,II、使蛋白质等呈胶体状态的杂质达到等电点