凝胶电泳技术PPT课件

.1，凝胶电泳，2，电泳：带电物质从电场转移到相反电极的现象。电泳技术是由于电场作用下要分离的样品的各种分子带电特性和分子本身的大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的移动速度，从而分离、鉴定或纯化样品的技术。3，自由接口电泳没有固定支持介质，因此扩散和对流都比较强，影响分离效果。因此，固定支撑体的电泳出现了，样品在固定介质中经过电泳过程，减少了扩散和对流等干扰作用。作为支持介质的凝胶的引入极大地促进了电泳技术的发展，电泳技术成为分析蛋白质、核酸等生物大分子的重要手段之一。原来使用的凝胶是淀粉凝胶，但现在最常用的是琼脂凝胶和聚丙烯酰胺凝胶。蛋白质电泳主要使用聚丙烯酰胺凝胶。4，电泳的基本原理：在电场中推动带电粒子运动的力(f)等于粒子带的纯电荷量(q)和场强(e)的乘积。F=QE粒子的前进也受阻力(f)的影响。对于球形粒子，请遵循Stoke法则。也就是说，在f=6 r 表达式中，r是粒子半径，是介质粘度，是粒子移动速度，当粒子在电场中进行稳定运动时，即f=f 是QE=6r球形粒子的移动速度首先取决于磁状态。也就是说，与持有功率成正比，与半径和介质粘度成反比。电泳系统的其他因素除了影响自身状态的因素外，还影响粒子的电泳迁移率。5，电泳移动率(m)意味着在单位场强(1V/cm)下，带电分子的移动速度移动率与带电分子拥有的净电荷成正比，分子的大小和缓冲液的粘度成反比。6，DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，并通过外加电场作用向阳极转移。DNA分子在凝胶中游泳时有电荷效应和分子筛效应。分子量和构成不同的DNA因电泳的游泳速度不同，条带分离也不同。要获得良好的电泳结果，必须尽量减少电荷效果，提高分子筛效果。7，常用凝胶电泳有两种：琼脂糖凝胶电泳。分辨率稍低，适合较大的分子。聚丙烯酰胺凝胶电泳：适用于高分辨率小分子。8，1，影响凝胶电泳迁移率的因素(a)样品的物理特性1，分子大小线性DNA分子长度(基本对编号BP)的对数(对数10)与移动距离成反比，测定DNA片段(线性双链)的分子量准确方便。到EB嵌合的迁移率下降了15%。如果DNA分子超过20kb，通常很难分离琼脂糖凝胶。此时电泳的迁移率不再依赖于分子大小，因此用琼脂糖凝胶电泳分离DNA时，分子大小不应超过这个值。9，2，分子的空间构成：分子量相同，但构成不同，迁移率不同。DNA分子的空间构成对质粒分子、游泳速度的大小顺序有很大影响。共享耦合环DNA(covalentlyclosecircularDNA，ccDNA，超高效配置) lDNA(线性结构，线性，质粒的两条链)线性分子) oc DNA(开环DNA、opencircularDNA、ocDNA、双股之一保持完整的环结构，其他单股有一个或多个切口)。但是，由于琼脂糖浓度、电场强度、离子强度和溴化乙烷等影响，可能出现相反的情况。10，3，带电：核酸分子是质子解离分子，pH3.5是碱基上的氨基解离，三个磷酸组中只有一个磷酸解离，因此分子带着正电从电场游向阴极。在PH8.0-8.3中，碱基很少理解，磷酸组分离了，因此核酸分子带着负电，在电场中向两极游去。每个核酸分子的电荷密度几乎相同，因此对游泳速度影响不大。4、碱基组成：对迁移率的影响不明显。单股DNA形成头部结构，影响移动速率，单股(1kb)比双股DNA (1kb)小。11，(2)载体介质(种类和浓度)，核酸电泳一般使用两种介质：琼脂凝胶和聚丙烯酰胺凝胶，琼脂糖是聚合链线性分子。琼脂糖浓度不同的凝胶构成的分子筛的网状大小适合于分离不同浓度的核酸分子。聚丙烯酰胺凝胶由N，N，N-四甲基乙烯四胺(TEMED)和和和硫酸铵(AP)的催化作用进行聚合，形成链N，N-甲基双丙烯酰胺(Bis)的交叉连接，网孔大小由Acr和Bis的相对比例确定。凝胶浓度越小，光圈越大，浓度越大，光圈越小。12、不同浓度琼脂糖凝胶有效分离范围。13，聚丙烯酰胺凝胶中DNA的有效分离范围，14，(3)场强场强场强表示单位长度(cm)的电位下降，也称为电位梯度。1-5V/cm(低电压)，低电压时线性DNA移动率与电压成正比，而大块电泳的0.5-1.0V/cm电泳也可以过夜。电场强度越大，带粒子的游泳速度越快。但是凝胶的有效分离范围随着电压的增加而减少。15，高电压影响凝胶的分离范围，降低分辨率。因为随着电压的提高，长度不同的DNA游泳的增加程度不同，凝胶有效分离范围随着电压的提高而减少。高压电泳(20-600V/cm(场强)，1000-2000V(电压)必须使用PAG作为介质。16，(4)电泳缓冲液(种类，pH，离子强度)，1，pH:决定带电粒子的离解程度，缓冲液pH往往是碱性或中性的，这时核酸分子带负电荷，向两极转移。2，离子强度：离子强度小，溶液导电性小，带电粒子游慢。离子强度大，溶液的导电性高，带电粒子游得快(过度的热生成、粘合剂熔化或DNA变质)。17，3，种类：TAE(Tris，acetate，EDTA):缓冲能力下降，电流容易变热，长时间阴极是碱性的，阳极是酸性的，必须循环才能使极地的pH均匀；但是价格便宜。TBE(Tris，硼酸，EDTA):缓冲能力强。偏好的TBE。TPE(Tris phosphate，EDTA):缓冲能力强，但DNA回收容易随DNA沉淀，影响酶反应。TNE(Tris乙酸钠，EDTA):适用于长时间低压电泳，分辨率高。将EDTA添加到缓冲液中，可以含有二价离子，抑制DNase，保护DNA。18，TBE一般使用10或5的存储溶液作为琼脂糖凝胶电泳的1TBE。但是0.5的溶液已经有足够的缓冲容量。具有聚丙烯酰胺凝胶垂直槽的缓冲罐体积小，通过缓冲液的电流一般较大，需要1TBE才能提供足够的缓冲容量。TBE溶液长期保存后形成沉淀物，为了避免这种情况，可以在室温下用玻璃瓶保存5溶液或高压杀菌。19、DNA电泳带糊原因：DNA降解，应避免核酸酶污染；电泳缓冲液多次使用旧电泳缓冲液后，离子强度降低，pH值提高，缓冲能力减弱，影响电泳效果。建议经常更换电泳缓冲液。使用的电泳条件不适于电泳时，电压不得超过20V/cm，温度不得低于30 。巨大的DNA链电泳，温度应为15；确保使用的电泳缓冲液有足够的缓冲能力。20，4)DNA样本量过多，可以减少凝胶的DNA样本数；5)在DNA等盐含量过高的电泳前，通过乙醇沉淀去除过多的盐；6)蛋白质污染电泳前苯酚的提取和蛋白质的去除；(7)在DNA变性电泳前不加热，用20mMNaCl缓冲液稀释DNA。21，2，核酸电泳指示剂和染色剂核酸电泳常用指示剂两种，溴酚蓝(bromophenolblue，Bb)是蓝紫色。二甲苯清澈(Xc)，蓝色，电荷比溴酚蓝少，凝胶中的迁移率比溴酚蓝慢。0.6%，1%，1.4%，2%琼脂糖凝胶电泳中溴酚兰的迁移率分别与1Kb，0.6Kb，0.2Kb，0.15Kb的双链线性DNA片段大致相同。在1%和1.4%琼脂糖中电泳时，二甲苯青绿的迁移速度与2Kb和1.6Kb的双链线性DNA几乎相同。22，指示剂一般与蔗糖、甘油或蔗糖400一起构成样品缓冲液(loadingbuffer)。样品缓冲液的作用：提高样品密度，增加其比重，使DNA均匀沉淀在样品孔里。在电泳中形成肉眼可见的指示带，可以预测核酸电泳的速度和位置。给样品上色，使样品工作更加方便。23，公式：加入0.25%溴酚蓝、0.25%二甲苯蓝FF，或分别加入30%甘油水溶液或40%(W/V)蔗糖(Ficoll400)或15%蔗糖水溶液。24，(2)染色剂核酸电泳后条带出现，需要使用染色剂，最常用的是溴化乙锭染色法，银染色后不仅安全，还有其他染色剂。最常用的溴锭(ethidiumbromide，EB)发出590nm橙红色，分别为260nm、300nm和360nm。25，溴化埃怪包含可夹在DNA积累碱基之间的三环平面组。与DNA结合几乎没有碱基序列特异性。在高离子强度的饱和溶液中，大约每2.5个碱基插入一个溴化乙烷分子。染料分子插入后，平面机垂直于螺旋的轴，通过范德华力与上下碱基相互作用。该组的固定位置和与碱紧密结合，使与DNA结合的染料呈荧光，其荧光产量比自由溶液中的染料增加。DNA吸收254奈米的紫外线辐射，传送到染料，而结合的染料本身吸收302奈米和366奈米的光辐射。在这两种情况下，吸收的能量在可见光谱红橙色区域的590nm处再次释放。26，溴化乙锭-DNA复合物的荧光产率比未结合DNA的染料高20-30倍，因此凝胶中含有玻璃溴锭(0.5ug/ml)时，可检测出小于10ng的NDA带。溴化埃怪可以用来检测单链或双链核酸(DNA或RNA)。但是染料对单链核酸的亲和力相对较小，因此荧光产率也相对较低。事实上，单股DNA或RNA染色的大部分荧光，都是通过染料与分子结合，形成短股内螺旋。最小检测量100ng，27，染色后一般不需要脱色。但在检测少量DNA(小于10ng)片段时，通常会对染色凝胶进行脱色。如果EB存在，线性DNA的电泳迁移率会下降约15%，因此需要知道DNA片段的准确大小(DNA限制性酶切图谱的确认等)时，凝胶必须经过电泳，在电泳结束后进行EB染色。在凝胶或染色液中，EB的浓度为0.5g/ml或0.1g/ml。28，注：exabyte容易分解，棕色试瓶应保存在4 。溴化埃怪嵌入碱分子中，会引起不一致。溴化埃怪是致癌性高的强突变物质！核酸吸收260nm紫外线，使DNA中断，因此DNA回收要在长波紫外线下仔细观察，减少DNA损伤。荧光容易淬火，观察时间注意，不能在紫外线下反复照射。29，由于溴化埃怪的毒性，实验结束后，为了污染环境，防止危害人体健康，必须净化含EB的溶液，然后丢弃。(1)对于EB含量大于0.5mg/ml的溶液，可按以下方式处理：将EB溶液稀释到低于0.5mm/ml的浓度，用水稀释。加入2倍体积的0.5mol/LKMnO4，均匀搅拌，然后加入等量的25mol/LHCl，将室温搅拌几个小时。加入体积两倍的2.5毫升/LNaOH，搅拌均匀后扔掉。30，(2)EB含量小于0.5mg/ml的溶液可按以下方式处理：以1mg/ml的量放入活性炭，偶尔轻轻混合，在室温下放置1小时；用滤纸过滤，密封活性炭牛和滤纸，然后销毁。31，银染色：银染色液中的银离子(Ag)可以与核酸形成稳定的复合物，然后用甲醛等还原剂将Ag还原为银粒子，在核酸电泳中染色黑棕色。主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色，也用于琼脂糖凝胶染色。比EB敏感200倍。但是染成银后，DNA不会被回收。，32，EB的替代品：GoldViewDNA染料是一种新的DNA染料，可以替代溴化乙锭(EB)，用途完全相同。通过琼脂糖凝胶电泳检测DNA时，GoldView可以与核酸结合，产生灵敏度类似exabyte，在某些波段超过exabyte的强荧光信号。在100ml琼脂糖胶溶液中添加5lGoldView，可在电泳缓冲区中以相同比例稀释后直接使用。在紫外线灯下，双链DNA代表绿色荧光，单链聚核酸链代表红色荧光。因此，金色视图不仅可用于双股DNA，还可用于染色RNA或单股DNA。GoldViewDNA染料在不同波长对灵敏度有一定影响，建议使用312nm波长。弱点是荧光组在紫外线灯下很容易浸泡，通常会消失5-10分钟带。33，GeneFinder具有安全、敏感、多种核酸电泳的染色剂，可代替溴化埃格(EB)的优点。与强大的致癌性EB不同，GeneFinder？属于华清染料，毒性很低，使用安全，可以有效地保护实验者和环境。GeneFinder？将荧光信号与dsDNA结合，可以提高800-1000倍左右，检测核酸的灵敏度平均比EB染色法高10倍左右，与美国MolecularProbe的SYBRGreenI染料的灵敏度差不多。GeneFinder？染料的最大吸收峰为470nm，与此染料结合的核酸呈绿色荧光。34，GelRedTM是美国生物球最近开发的优良红色荧光核酸染色剂，适用于电泳前凝胶染色和电泳后凝胶染色。与其他核酸染色剂不同，具有高灵敏度、高设计定性、低毒性、复合性等特性。该染发剂不仅灵敏度高，稳定性高，适应性广，可用于电泳前染色和电泳后染色。使用紫外线透视仪在300nm附近获得最佳激发结果，595nm附近显示红色发射光谱。因此，该染色剂使用常用的300nm紫外线透视仪，可以获得最佳激发光谱。35，与EB预制凝胶不同，GelRedTM预制凝胶基本上没有荧光，对低分子DNA片段的敏感度很高。与EB一样，使用GelRedTM创建的预制粘合剂可以长期存储，而不会降低性能。SYBRGreen1和SYBRGold染色剂不具有这些特性。如果凝胶edtm用于后凝胶染色剂，30分钟内可以完全着色，没有本底，不需要再次进行脱色或清洗过程。此外，格莱edtm的酸碱水解稳定性好，可以批量制造染发剂，供日后使用。GelRedTM的另一个重要特征是比EB安全，但