质谱分析法药品质量控制中的应用--李晓东2011.10济南.ppt

质谱分析法药品质量控制中的应用,2011年华东六省一市药物分析交流会李晓东2011-10-18，济南,提纲,一、质谱仪器的原理及分类,二、质谱法在药品质量控制中的应用,三、质谱法应用展望,一、质谱仪器的原理及分类,质谱法（MassSpectrometry）,通过将被测物质原子或分子离子化，利用电磁学原理，对荷电粒子或碎片粒子依其质量和电荷的比值（质荷比，m/z）进行分离和分析，以达到确认其元素组成及分子结构的目的。,一、质谱仪器的原理及分类,质谱法的特点,质谱不属波谱范围，质谱图与电磁波的波长和分子内某种物理量的改变无关。,质谱是分子离子及碎片离子的质量与其相对强度的谱,谱图与分子结构有关。,质谱法进样量少,灵敏,快速，特异，化学计量（Sensitivity，Speed，Specificity，Stoichiometry）,质谱是唯一可以给出分子量,确定分子式的方法,而分子式的确定对化合物的结构鉴定是至关重要的。,一、质谱仪器的原理及分类,因质谱技术获诺贝尔奖的五位科学家,一、质谱仪器的原理及分类,MS：MassSpectrometry,MassSpectrometer,质谱仪的分类：(1)有机质谱仪：-气质联用，液质联用，傅立叶质谱仪，激光解吸飞行时间质谱仪,(2)无机质谱仪-电感耦合等离子体质谱,同位素质谱仪，二次离子质谱,氦质谱检漏仪,一、质谱仪器的原理及分类,质谱仪分析标准程序：（1）样品的导入（2）样品的离子化（3）被测离子进入电场或磁场（4）离子按质荷比（m/z）进行分析（5）按质荷比m/z.进行检测,一、质谱仪器的原理及分类,质谱图,以荷质比m/z为横座标，以对基峰(最强离子峰，规定相对强度为100%)相对强度为纵座标所构成的谱图。,一、质谱仪器的原理及分类,质谱图,有机质谱图,无机质谱图,一、质谱仪器的原理及分类,同位素质谱图,氯苯质谱图,溴丙烷质谱图,一、质谱仪器的原理及分类,质谱图,质谱在有机结构分析上的应用主要有两方面：确定相对分子质量和分子式；在低分辨质谱中，由分子结构与裂解方式的经验规律，鉴定某些官能团，给出分子的结构信息；定量模式：GC/MSSIMLC/MS/MSSIMorMRMICP/MSSIM,一、质谱仪器的原理及分类,*2005版起中国药典二部附录收载质谱法,一、质谱仪器的原理及分类,*实现质谱技术的关键-高真空,离子源和质量分析器的压力在104105Pa和105106Pa或10-610-7mmHg和10-710-8mmHg*仪器类型：机械泵+涡轮分子泵,一、质谱仪器的原理及分类,*实现质谱技术的关键-高真空,-质谱是检测带电粒子,带电粒子在电磁场的作用下，加速运动。如果有空气，带电粒子可能和空气中的其他分子发生碰撞，使离子很快淬灭而达不到检测器，并引起额外的离子分子反应，改变裂解模型，谱图复杂化，影响分离及检测。,一、质谱仪器的原理及分类,*气质联用,一、质谱仪器的原理及分类,*液质联用,单四极杆和串联质谱。,空间串联：QQQ、Q-Trap、Q-TOF、TOF-TOF,时间串联：IonTrap、Orbitrap、FT-MS,ESIAPCI,-API是液相色谱/质谱联用仪最常用的离子化方式。,一、质谱仪器的原理及分类,*电感耦合等离子体质谱,四极杆，双聚焦、飞行时间质谱,*电感耦合等离子体质谱,二、质谱法在药品检验用的应用,*液相色谱-质谱联用法,*气相色谱-质谱联用法,*电感耦合等离子体质谱：可进行定性、半定量、定量分析及同位素比值的准确测量，还可与其他技术如HPLC、HPCE、GC联用进行元素的形态、分布特性等的分析，广泛应用于环境、半导体、医学、生物、冶金、石油、核材料分析等领域。,*气质联用：灵敏度高，适合于低分子化合物（分子量气溶胶-固体颗粒-气体分子-原子-离子,汽化去溶剂化气化原子化离子化,二、质谱法在药品检验用的应用,ICP-MS检测限及质量分析范围,二、质谱法在药品检验用的应用,市场上金属元素分析仪器对比,二、质谱法在药品检验用的应用,根据溶液的浓度举例如下，供参考：每个样品测定1-3个元素，元素浓度为亚或低于ppb级，如果被测元素要求能满足的情况下，G-AAS是最合适的。每个样品5-20个元素，含量为亚ppm至%，ICP-AES是最合适的。每个样品需测4个以上的元素，在亚ppb及ppb含量，而且样品的量也相当大，ICP-MS是较合适的。,电感耦合等离子体质谱仪，ICP-MS,（1）在中药材及中药注射剂检验中的应用阿胶，白芍，丹参，甘草，枸杞子，黄芪，金银花，山楂，西洋参人参总皂苷，人参茎叶总皂苷，薄荷脑，灯盏花素，茵陈提取物，三七总皂苷，共15个品种-铅不得过百万分之五；镉不得过千万分之三；砷不得过百万分之二；汞不得过千万分之二；铜不得过百万分之二十。,（2）在制品分析中的应用-Al、Ni、Pd等过程代入的金属元素,二、质谱法在药品检验用的应用,（1）在化妆品检验中的应用,气相色谱-质谱联用仪，GC/MS,（2）在塑化剂检验中的应用,（3）在农药残留检验中的应用,二、质谱法在药品检验用的应用,（1）在化妆品检验中的应用-风险及限用物质：二噁烷、苯酚等以二噁烷为例：SN/T1784-2006,顶空气相色谱-质谱法：-顶空进样，交联5%苯基甲基硅烷毛细管柱，质谱检测器,下限2.5mg/kg,二、质谱法在药品检验用的应用,（2）在塑化剂检验中的应用,GB/T21911-2008,含16中邻苯二甲酸酯类增塑剂，不包含邻苯二甲酸二异壬酯DINP和邻苯二甲酸二异癸酯DIDP.,二、质谱法在药品检验用的应用,（2）在塑化剂检验中的应用,DIDP1ppm,DIDP10ppm,二、质谱法在药品检验用的应用,GB/T19648-2006水果和蔬菜中500种农药及相关化学品残留的测定气相色谱-质谱法GB/T19426-2003蜂蜜、果汁和果酒中304种农药多残留测定方法气相色谱-质谱和液相色谱-串联质谱法GB/T19650-2005动物组织中437种农药多残留测定方法气相色谱-质谱和液相色谱-串联质谱法（已作废）,（3）在农药残留检验中的应用,二、质谱法在药品检验用的应用,2010年版中国药典一部附录收载“农药残留量测定法”采用气相色谱法，ECD，NPD检测收载品种：甘草，黄芪，人参总皂苷，人参茎叶总皂苷,（3）在农药残留检验中的应用,二、质谱法在药品检验用的应用,发展趋势：测定方法分两个层次：一为色谱法（GC、HPLC）方法包括样品前处理（提取、净化）、色谱测定、色谱验证和质谱确证二为色-质联机法（GC/MS、LC/MS）方法包括样品前处理（提取、净化）、色谱质联机测定,液相色谱-质谱联用仪，LC/MS,（1）在药典中的应用,（3）非法添加及有害残留检验中的应用,（2）主成分及有关物质分析中的应用,（4）基因工程药品检验中的应用,二、质谱法在药品检验用的应用,（1）在药典中的应用,2010年版中国药典一部收录三个品种,-川楝子及苦楝皮中的川楝素进行含量测定,川楝素(Toosendanin):C30H38O11MW.574.62,反相C18体系，乙腈-0.01%甲酸溶液（31:69）为流动相，采用单级四级杆质谱检测器，电喷雾离子化（ESI）负离子模式下选择质荷比（m/z）为573的离子进行检测。理论塔板数按川楝素计算应不低于8000。通过外标法，以川楝素两个峰面积之和计算川楝素的含量。,二、质谱法在药品检验用的应用,（1）在药典中的应用,2010年版中国药典一部收录三个品种,-千里光中的阿多尼弗林碱进行了杂质检查,阿多尼弗林碱AdonifolineC18H23NO7，MW=365,具有细胞毒性,反相C18体系，乙腈-0.5%甲酸溶液（7:93）为流动相,采用单级四级杆质谱为检测器，电喷雾离子化（ESI）正离子模式下选择质荷比（m/z）为366离子进行检测。理论塔板数按阿多尼弗林碱计算应不低于8000。以百合碱为内标，计算校正因子，测定阿多尼弗林碱的含量。,二、质谱法在药品检验用的应用,（1）在药典中的应用,USP32,血管升压素（Vasopressin）:ESI+，1084（单电荷）和543（双电荷）；人重组血清白蛋白（RecombinantAlbuminHuman）:585个氨基酸组成，分子量66,438Da，ESI+多电荷质谱图去卷积，20Da之内误差；醋酸去氨加压素（DesmopressinAcetate）:ESI+，m/z1069，MS/MS，m/z641、742和995子离子。,二、质谱法在药品检验用的应用,（2）主成分及有关物质分析中的应用,*药典中的定性鉴别（已知物的鉴别）,化学、红外、紫外、色谱保留时间,二、质谱法在药品检验用的应用,（2）主成分及有关物质分析中的应用,鉴定数据点系统,二、质谱法在药品检验用的应用,（2）主成分及有关物质分析中的应用,相对强度的容许量,二、质谱法在药品检验用的应用,（2）主成分及有关物质分析中的应用,相对强度的容许量,20%,20%,25%,30%,50%,二、质谱法在药品检验用的应用,（2）主成分及有关物质分析中的应用,-盐酸洛美沙星光降解分析,二、质谱法在药品检验用的应用,盐酸洛美沙星光降解分析,A,B,C,AM+H308.0,BM+H294.3,CM+H368.0,二、质谱法在药品检验用的应用,（2）非法添加及有害残留检验中的应用,2006年3月，SFDA通用补充检验方法及项目的批准-治疗肥胖症中成药（SFDA2006004）麻黄碱、芬氟拉明、西布曲明-治疗消渴症中成药（SFDA2006005）苯乙双胍、格列吡嗪、格列本脲-消肿止痛类中成药（SFDA2006006）双氯芬酸、氨基比林-止咳平喘类中成药（SFDA2006007）茶碱-镇静安神类中成药（SFDA2006008）地西泮、氯硝西泮-镇静安神类中成药（SFDA2006024）艾司唑仑-补肾壮阳类中成药（SFDA2006009）西地那非、他达拉非,二、质谱法在药品检验用的应用,（3）非法添加及有害残留检验中的应用,二、质谱法在药品检验用的应用,（3）非法添加及有害残留检验中的应用,*糖皮质激素的基本结构中均具有环戊烷骈多氢菲母核，其中C3的酮基、C20的羰基及C4-5的双键是保持生理功能所必需，结构上可通过在C12引入双键，在C6、C9、C16、C21引入结构修饰基团来增强其抗炎作用，减弱水盐代谢作用。,M1+准分子离子峰：泼尼松龙m/z361.2泼尼松m/z359.3地塞米松m/z393.2醋酸可的松m/z403.2醋酸泼尼松龙m/z403.2醋酸泼尼松m/z401.3醋酸地塞米松m/z435.1,二、质谱法在药品检验用的应用,（3）非法添加及有害残留检验中的应用,糖皮质激素类药物,HPLC-UVMS色谱图（a）七种糖皮质激素对照品；（b）供试品,*以泼尼松计算，柱上灵敏度达到0.5ng,二、质谱法在药品检验用的应用,保健食品：肥胖症、消渴症、消肿止痛、补肾壮阳,二、质谱法在药品检验用的应用,磷酸二酯酶5（PDE5）抑制剂类,Sildenafil(Viagra)MS:474.2,HomosildenafilMS:488.2,Hydroxy-homosildenafilMS:504.2,Acetildenafil（Hongdenafil）MS:466.3,TadalafilMS:389.1,VardenafilMS:488.2,AildenafilMS:488.2,HydroxysildenafilMS:490.2,二、质谱法在药品检验用的应用,西地那非M+1:475.2,Hydroxy-homosildenafil,-磷酸二酯酶5（PDE5）抑制剂类药物类似物分析,二、质谱法在药品检验用的应用,问题（1）成盐药物检验结论的描述,-改善药物理化性质-增强药物的稳定性，溶解性-影响药物的作用时间-减轻了毒副作用等功能，保持药物疗效是成盐的前提-氨茶碱，盐酸克伦特罗，双氯芬酸钠、枸橼酸西地那非等。,-例：检出双氯芬酸，以双氯芬酸钠计含量为_%,二、质谱法在药品检验用的应用,问题（2）最小检出限的确定,2ng,1ng,100ng,二、质谱法在药品检验用的应用,问题（3）未检出结论的描述,-仪器灵敏度的表述-LOD的重要性-残留与非法添加（底线的选取）,-未检出检出西地那非，LOD为以枸橼酸西地那非计为_ng,二、质谱法在药品检验用的应用,问题（5）定性的瓶颈,*液质联用定性鉴别需要对照品,*无对照品可选用参考品参考品-单晶衍射-NMR+HRMS+EA-验证的通用谱库的高分辨分子离子及特征碎片,问题（6）定性鉴别与基线分离（R1.5）,二、质谱法在药品检验用的应用,基因工程蛋白药物中抗生素残留检测,氨苄西林MS/MS,Conv.=0.0525g/mL，0.5ng（10L），SN4,二、质谱法在药品检验用的应用,食品中氯霉素的残留检测,HPLC&MRM（ODS，MeCN-H2O，Gradientprogram）ESI(-)，Q1=321,Q3=152,194and257,C11H12Cl2N2O5FW=323.13,二、质谱法在药品检验用的应用,食品中氯霉素的残留检测(样品),二、质谱法在药品检验用的应用,甲氨蝶呤中的长春新碱检测,“甲氨蝶呤”事件,二、质谱法在药品检验用的应用,“力百汀”塑化剂事件,定性方法重复