基因工程的基本操作程序(修改)VIP

1.2基因工程的基本操作程序,补充：基因的结构,（1）原核生物基因结构,编码区,非编码区,非编码区,编码区上游,编码区下游,编码蛋白质,调控遗传信息的表达,（调控程序）,启动子,终止子,AATGTGCACGTAGTTA.GT.TACACGTGCATCAAT.C,编码区,非编码区,非编码区,启动子,终止子,ATGTGCACGTAGTTA,TACACGTGCATCAAT,RNA聚合酶,AUGUGCACGUAGUUA,启动子：位于基因首端一段能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列。没有启动子，基因就不能转录。,RNA聚合酶:能够识别启动子上的结合位点并与其结合的一种蛋白质.,终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，它能阻碍RNA聚合酶的移动，并使其从DNA模板链上脱离下来，使转录终止。,不能转录为信使RNA，不能编码蛋白质的序列。,：能转录相应的信使RNA，能编码蛋白质的序列。,编码区,非编码区,原核细胞的基因结构,是调控遗传信息表达的核苷酸序列，在该序列中，最重要的是位于编码区上游的RNA聚合酶结合位点。,（也就是启动子）,（2）真核细胞的基因结构,编码区,非编码区,与RNA聚酶结合位点,内含子,外显子,能够编码蛋白质的序列叫做外显子,不能够编码蛋白质的序列叫做内含子，内含子能转录为信使RNA,启动子,终止子,编码区上游,编码区下游,内含子：,外显子：,真核细胞的一个基因的编码区转录出前体mRNA，需把其中的内含子切除，外显子拼接成成熟mRNA。,真核细胞的基因结构,编码区,非编码区,外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列,：有调控作用的核苷酸序列，包括位于编码区上游的RNA聚合酶结合位点。,非编码序列：,包括非编码区和内含子,原核细胞与真核细胞的基因结构比较,思考,编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？,连续,不连续,编码区,非编码,真核基因长,1.2基因工程的基本操作程序,二.基因表达载体的构建,三、将目的基因导入受体细胞,四、目的基因的检测与鉴定,一.目的基因的获取,基本操作的四个步骤,一、目的基因的获取,1、目的基因主要是指_,编码蛋白质的结构基因,2、获取目的基因的方法,（1）从基因文库中获取,（2）利用PCR技术扩增,（3）人工合成,生物抗逆性相关基因、与优良品质相关的基因、与生物药物和保健品相关的基因、与毒物降解相关的基因、与工业用酶相关的基因等,将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库,1、基因文库,（一）从基因文库中直接获取,一、目的基因的获取,限制酶,基因组DNA,基因重组,转化细菌,体外包装,1)基因组文库(Genomiclibrary),是指将某种生物体的全部基因组DNA，用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围的DNA片段，再与合适的载体在体外重组后，导入受体菌的群体中储存，这个群体就称为该生物基因组文库。其目的是分离有用的目的基因和保存某种生物的全部基因。,cDNA(互补DNA)：是用某种生物发育的某个时期的mRNA反转录产生的多种互补DNA（也叫cDNA）片段，与载体连接后储存在一个受体菌群中，这个受体菌群就叫做这种生物的cDNA文库,2)cDNA文库(cDNAlibrary),基因重组,反转录酶,mRNA,cDNA,提取某种生物的全部DNA,一定大小的DNA片段,导入受体菌中储存,基因组文库,直接分离法(鸟枪法),多用于原核生物,2、基因组文库的建立方法,某种生物的单链mRNA,单链互补DNA,双链cDNA片段,导入受体菌中储存,与载体连接,cDNA文库,反（逆）转录酶,DNA聚合酶,3、cDNA文库的构建-反转录法,多用于真核生物,小,大,无,有,无,有,某种生物的部分基因,某种生物的全部基因,可以,部分基因可以,基因组文库和部分基因组文库(cDNA文库)比较,基因组文库与部分基因文库的关系,怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因呢?,依据：目的基因的有关信息。如：根据基因的核苷酸序列基因的功能基因在染色体上的位置基因的转录产物mRNA基因翻译产物蛋白质等特性,4、从基因文库中得到目的基因的方法,寻根问底为什么要构建基因文库？直接从含有目的基因的生物体内提取不行吗？,提示：构建基因文库是获取目的基因的方法之一，并不是惟一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通过PCR方式从含有该基因的生物的DNA中，直接获得，也可以通过反转录，用PCR方式从mRNA中获得，不一定要构建基因文库。但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想从一种生物体内获得许多基因，或者想知道这种生物与另一种生物之间有多少基因不同，或者想知道一种生物在个体发育的不同阶段表达的基因有什么不同，或者想得到一种生物的全基因组序列，往往就需要构建基因文库。,18,（二）利用PCR扩增目的基因,(二)利用PCR技术扩增,(二)利用PCR技术扩增,概念：PCR全称为_，是一项在生物_复制_的核酸合成技术,条件：_、_、_(做启动子)、_。,原理：_,方式：以_方式扩增，即_（n为扩增循环的次数）,结果：,聚合酶链式反应,体外,特定DNA片段,DNA复制,已知基因的核苷酸序列,四种脱氧核苷酸,一对引物,热稳定DNA聚合酶（Taq酶）,指数,2n,使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增,前提条件,过程：,a、DNA变性（90-96）：双链DNA模板在热作用下，_断裂，形成_,b、退火（复性55-65）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部_。,c、延伸（70-75）：在DNA聚合酶的作用下，从引物的5端3端延伸，合成与模板互补的_。,氢键,单链DNA,双链,DNA链,DNA合成方向总是从子链的5端3端延伸,PCR技术扩增与DNA复制的比较,碱基互补配对,四种脱氧核苷酸,模板、能量、酶,DNA在高温下变性解旋,解旋酶催化,体外复制,细胞核内,热稳定DNA聚合酶,细胞内的DNA聚合酶,大量的DNA片段,形成整个DNA分子,（三）、人工合成法：,基因较小，核苷酸序列已知，可以利用DNA合成仪人工合成,反转录法,目的基因的信使RNA,目的基因,化学合成法,肽链氨基酸序列,信使RNA序列,基因的核苷酸序列,目的基因,合成,逆转录,人工合成法,推测,推测,单链DNA,合成,1、下列属于获取目的基因的方法的是()利用mRNA反转录形成从基因组文库中提取从受体细胞中提取利用PCR技术利用DNA转录人工合成A.B.C.D.,2、有关基因工程的叙述正确的是（）A、限制酶只在获得目的基因时才用B、重组质粒的形成在细胞内完成C、质粒都可作为运载体D、蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料,D,1.作用：,二.基因表达载体的构建核心,IMN,2.组成：,使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给子代。,同时使目的基因能表达和发挥作用。,(3)终止子：,(4)标记基因：,(2)启动子：,(1)目的基因。,（5）复制原点：,不同受体细胞，目的基因导入受体细胞的方法不同，基因表达载体的构建有所差异。,是RNA聚合酶识别和结合部位。,是使转录在需要的地方停止。,是鉴别受体细胞中是否含有目的基因从而将含有目的基因的细胞筛选出来。,是复制的起点。,载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键启动子、终止子对于目的基因表达必不可少目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。,注意,寻根问底：将目的基因直接导入受体细胞不是更简便吗？如果这么做，结果会怎样？,提示：有人采用总DNA注射法进行遗传转化，即将一个生物中的总DNA提取出来，通过注射或花粉管通道法导入受体植物，没有进行表达载体的构建，这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定什么基因导入了受体植物。此法目前争议颇多，严格来讲不算基因工程。,思考与探究：1.作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？,不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由是：（1）生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达；（2）通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；（3）目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；（4）为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子等；（5）有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。,3、将目的基因导入受体细胞,转化,方法,将目的基因导入植物细胞,将目的基因导入动物细胞,将目的基因导入微生物细胞,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,显微注射法,感受态细胞法,目的基因进入_内，并且在受体细胞内维持_和_的过程,受体细胞,稳定,表达,常用的受体细胞：,有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。,1、将目的基因导入植物细胞的方法：（1）农杆菌转化法农杆菌特点：,易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力,原理：Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。,双子叶植物、祼子植物,适用生物?,目的基因,Ti质粒上的TDNA,插入,植物细胞,农杆菌,染色体DNA上,维持稳定和表达,并整合到,导入,感染,同时T-DNA导入,过程：,优点：,比较经济和有效,思考与探究：2.根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理,你能分析出不能导入单子叶植物的原因吗?若将一个抗病基因导入小麦中,理论上讲你应该怎样做?,要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物；要加趋化和诱导的物质，一般为乙酰丁香酮等，目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性）和激活农杆菌的Vir区（诱导）的基因，使T-DNA转移并插入到染色体DNA上。,37,（2）基因枪法：,利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法,操作方法：,金属粒：,将目的基因导入单子叶植物细胞,钨粉粒子和金粉粒子，粒子的直径一般在0.64um。,适用：单子叶植物,缺点：,成本较高,（3）花粉管通道法：,将目的基因导入植物细胞,操作方法：,特点：,在植物受粉后，花粉形成花粉管还末愈合前期，剪去柱头，然后，滴入DNA（含目的基因）使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞,十分简便经济,例：,转基因抗虫棉,2.将目的基因导入动物细胞,显微注射技术,提纯含目的基因的表达载体,取出受精卵,方法：,程序：,原核生物特点：,繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少，故早期常作为受体细胞。,大肠杆菌细胞,感受态细胞,重组表达载体DNA溶于缓冲液,转入,方法：,常用菌：,大肠杆菌,3.将目的基因导入微生物细胞,通过标记基因，进行筛选和检测,导入过程完成后，全部受体细胞都能摄入重组DNA分子吗？,真正能摄入重组DNA分子的受体细胞很少。,所以要对受体细胞作怎样的处理？,对受体细胞中是否导入了目的基因进行检测,怎样进行检测？,4、目的基因的检测与鉴定,检查是否成功,检测,鉴定,检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因,检测目的基因是否转录出了mRNA,检测目的基因是否翻译成蛋白质,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,方法,方法,方法,DNA分子杂交,分子杂交,抗原抗体杂交,DNA分子杂交示意图,采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。,碱基互补配对,原理：,1.检测,转基因生物的DNA,探针,15N,15N,14N,14N,（1）检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因,基因探针：,放射性同位素等标记含有目的基因的DNA片段,方法,DNA分子杂交技术,方法,分子杂交技术,（2）检测目的基因是否转录出了mRNA,探针,15N,15N,转基因生物的mRNA,14N,提取,（3）检测目的基因是否翻译成蛋白质,方法,Bt毒素蛋白,将Bt毒蛋白注射小鼠体内,从小鼠血管抽出血液分离出抗Bt毒素的抗体,抗体,Bt毒素蛋白（抗原）,出现杂交带,脱分化,组织培养,证明：提取蛋白质与Bt毒素蛋白质一样,抗原-抗体杂交,例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。,2.鉴定个体生物学水平的鉴定,（1）多细胞个体,抗虫、抗病结种实验，活性比较实验,不能，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了表达。,受体细胞摄入DNA分子后就说明目的基因完成了表达吗？,若不能表达，要对抗虫基因再进行修饰。,细菌的检测，将每个受体细胞单独培养形成菌落，检测菌落中是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产物的菌落，保留有表达产物的进一步培养、研究。,（2）单细胞生物,3.利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？,有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。,思考与探究：,53,（1）从小鼠中克隆出-珠蛋白基因的编码序列（cDNA）（2）将cDNA前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子和终止子，另外加上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。（3）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未进入大肠杆菌中