胰蛋白酶活性测定

实验1胰蛋白酶活性测定实验目的：掌握测定胰蛋白酶浓度、活性、比活的原理和方法。实验原理：胰蛋白酶相对分子量23.7 KD，主要是水解肽链中碱性氨基酸与其他氨基酸结合的肽键，以及人工合成的N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯(N-benzuyl-L-argine ethyl ester，BA在胰蛋白酶催化的上述反应中，产物BA吸收253 nm的光远大于Bee，因此在实验的开始点将253 nm的消光值设为零，记录反应体系的253 nm的消光值的增量，可以将该增量作为测定胰蛋白酶活性的指标。酶活性单位的定义：基质Bee浓度1m mol/L，光路长度1 cm，波长253nm，温度25c，测定体积3mL，条件下的吸光值每分钟增加0.001 (da/min=0.001 )。胰蛋白酶制剂中蛋白质浓度的意思：胰蛋白酶含量一般表达为E1%。 该值意味着浓度为1%的酶蛋白质在1cm光径下在紫外具有280nm的消光值。 根据制造商和产品的不同，E1%的值有很大的差异。 E1%的值越高，表示酶制剂中的酶蛋白质含量越高。由于酶制剂中蛋白质的含量各不相同，用酶制剂调制E1%的蛋白质溶液时，按制造商产品的E1%的测定值调制溶液。在本实验中，胰蛋白酶酶蛋白质样品采用SIGMA公司生产的产品，生产公司对展品的描述为280nm的紫外吸收值15.3，制备胰蛋白酶标准溶液根据制造商的说明。器材为试剂：器材、电子天平、紫外分光光度计、微量取样器。 试剂：标准胰蛋白酶、N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯、HCI、Tris。1 .胰蛋白酶活性测定：1 )调制1)e1%胰蛋白酶溶液各组将10 mg E1 %=15.3的胰蛋白酶样品放入1ml去离子水，充分溶解后，放入冰中保存。2 )按照表1的要求调制试验系统所需的其他各种溶液3 )按照表1的顺序测定了标准胰蛋白酶的活性。表1胰蛋白酶活性测定样品的顺序试剂工序1 :空白零调整工序2 :样品测定0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液、ph8.0、1.5ml1.5ml2.0毫米/l baee1. 5毫米1.5毫米250C预热5min 250C预热5min胰蛋白酶： 10毫升/毫升0毫升10毫升蒸馏水10毫升0毫升请充分摇动，充分摇动。步骤1:da 253纳米/最小调整0-步骤2:da253-nm/min-记录在步骤2的样品测定中，加入酶液后立即盖上盖子迅速混合，每一半读取一次，合并34min。 测定的结果最好将A253nm/min控制在0.050.100之间，如果超出该范围，则适当地增减酶量(5 mL -20 mL之间，空白试验的增减等体积水)，然后测定到A253nm/min的值在0.050.100之间3各计算：1 )与标准胰蛋白酶溶液(浓度10mg/mL )的酶活性相比活：计算方法：I )胰蛋白酶活性单位数的计算：ii )胰蛋白酶比活计算： (用beee单位数/mg胰蛋白酶表示比活)实验胰蛋白酶动力学测定实验目的初步掌握米氏常数Km、最大反应速度Vmax、转换数kcat、特异常数kcat、/Km的酶动力学参数的测定和计算方法。实验原理：已知胰蛋白酶遵循米氏方程式，可以通过测定基质浓度与反应速度的关系，测定并求出该酶的各动力学参数。 胰蛋白酶水解碱性氨基酸的羧基生成的多肽键、酰胺键、酯键。 本实验利用胰蛋白酶水解酰胺键活性的性质，以苯甲酰-L-精氨酸-对亚硝基胺(BAPA )为基质测定该酶的动力学参数，反应式如下反应为最佳pH8.1、最佳温度25c。 反应产物之一：对亚硝基胺(p-Nitroaniline，4 -NA )为黄色，对405nm波长的光的摩尔吸光系数为9870，但基质BAPA和另一产物BA对405nm波长的光几乎不吸收，因此在本实验中光波的波长当L-BAPA的最大浓度低于5104mol/L时，该酶反应符合米氏方程，用Hanes作图法求出动力学参数。 Hanes作图法是单倒数作图法，把米氏方程式变形如下在实验中，设定一系列基质浓度Si，测定每个基质浓度条件的反应速度ni，用Si/ni对Si作图时，得到线段在y轴上的切片为Km/Vmax，线段的延长线在x轴上的切片为-Km的线段，由此得到Km和Vmax的值Et是酶的初期浓度，由于实验上已设定为已知，因此kcat可以得到的特异常数Km/kcat可以根据上述已知数计算出。器材和试剂：器材： 756紫外可见分光光度计、恒温水浴锅、分析天平、秒表、容积瓶、移液管。试剂：1.0.1mol/L pH8.1的Tris-HCI缓冲液(含0.4 l2):0.2 mol/l tris (Mr=121.14 ) 100 ml和0.2mol/L HCI 52.4mL混合，加入0.8gCaCl2，将蒸馏水固定在200ml2.1mmol/L DL-BAPA(Mr=434.9 )水溶液：称量bapa43.49mg，溶解蒸馏水加热至80c以上，用完全溶解后的冰水冷却，定容为100mL。 将该浓度为1mmol/L的DL-BAPA溶液命名为第六组母液，并按逐渐稀释的方式制备了以下溶液浓度系列： 0.8m mol/L (第五组母液，25mL )。 0.6m摩尔/l (25 ml，第四组母液) 0.4m摩尔/l (25 ml，第三组母液) 0.2 m摩尔/l (10 ml，第二组母液) 0.1 m摩尔/l (10 ml，第一组母液)。3.60%(V/V )乙酸溶液4 .胰蛋白酶溶液，该酶的比活1.0104 BAEE单位/mg蛋白质实验步骤：1 .计算胰蛋白酶样品体积：本实验加入胰蛋白酶的量为60mg，用实验1测定胰蛋白酶的比活和浓度(mg/mL )，由这些值计算加到系统中的酶液体积的mL数。2 .实验溶液系统：本实验有6组实验组成。 实验顺序按照表2的样品程序执行。测量距离曲线ianIMEI表2.km和Vmax值的样品表集团公司bapa(bapa )母液浓度(米摩尔/l )加入BAPA母液(PS )追加PR PS(PS )追加胰蛋白酶(PS )追加乙酸60%(PS )反应体系基质BAPA浓度(米摩尔/l )nA405系列1.0.1样品1，2.0对照1，2.01.51.6n00.40.4S10.0520.2样品2，2.0对照2，2.01.51.6n00.40.4S20.130.4样品3，2.0对照3，2.01.51.6n00.40.4S3 0.240. 6样品4，2.0对照4，2.01.51.6n00.40.4S40.350.8样品5，2.0对照5，2.01.51.6n00.40.4S50.461 .0样品6，2.0对照6，2.01.51.6n00.40.4S60.525 0C保温5 min后，摇摆，秒表计时，正确反应2min后，加入0.4ml的60%乙酸溶液，摇摆停止反应。 反应溶液总量应达到4mL，不足部分可以用蒸馏水补充。 对照试管不加入胰蛋白酶，加入0.4 ml 60 %的乙酸溶液。 最后，分别记录样本和对照点A405的值，如果将每组的两者之差D A405代入下式，则获得对应于Si的ni表2显示了6个实验，但现在的实验室还没有12个枪支样品，所以各实验可以独立进行。需要特别注意：1 )比较活性大于1.0104 BAEE u/mg protein的胰蛋白酶制剂，纯度范围为90%-100%，一般达到95%-97%。 计算动力学参数时，如果没有特别精确的要求，可以根据胰蛋白酶的100%近似值来计算。 本试验中，浓度胰蛋白酶浓度为10mg/ml，纯度为100%，因此，每个试管的品质数要求为60mg，可以计算每个试管添加的胰蛋白酶溶液的微升数。2 )在进行动力学参数的计算时，进行了胰蛋白酶的质量-摩尔数转换，但如果没有特别要求，也可以将胰蛋白酶的纯度近似为100% .3 )虽然要求精密，但产品说明中未显示胰蛋白酶在固体成分中的含量时，调制一定浓度的固体成分溶液，首先测定蛋白质浓度，并求出蛋白质总量，从而得到酶制剂中蛋白质的重量比。 然后将双向电泳、图像扫描、扫描结果输入计算软件，按照软件程序求出胰蛋白酶在所有蛋白质样品中的比例。将实验中设定的每个Si测量的对应的Vi换算为Si/Vi，填写在表3中，绘制了Km、Vmax表3. Hanes图的数据si/ni : s1/n1s2/n2s3/n3s4/n4/n5s6/n 6si : S1 S2 S3 S4 S5 S6用s