HPLC使用常见问题.ppt

HPLC使用时常见问题分析,一、规范操作,3,HPLC的环境设置,HPLC的日常操作条件温度：1030；相对湿度80；最好是恒温、恒湿，远离高电磁干扰、高振动设备，有良好的通风设施。,4,流动相的配制,HPLC对流动相的基本要求不与固定相发生化学反应对样品有适宜的溶解度必须与检测器相适应。如用紫外检测器时，不能选用截止波长大于检测波长的溶剂避免卤素离子（不锈钢系统）粘度小的液体,5,溶剂的要求流动相所用溶剂必须为色谱级水为重蒸水或超纯水缓冲液的PH值范围一般为2-8（取决于所用柱子的性能）,6,HPLC用水可以通过以下几个方面来得到专门的纯水机或超纯水机；去离子水重蒸；二次或三次重蒸水；市场上瓶装的纯净水或蒸馏水不管采用何种途径，配制流动相应用新鲜水，水质越高放置时间越短。使用新鲜配制的流动相，特别是水溶剂或盐缓冲液建议不超过两天。,7,流动相的配制按色谱条件，以一定比例混合流动相后，抽滤（0.45m滤膜），超声脱气。,8,滤膜类型聚四氟乙烯滤膜：适用于所有溶剂，酸和盐。醋酸纤维滤膜：不适用于有机溶剂，特别适用于水基溶剂。尼龙66滤膜：适用于绝大多数有机溶剂和水溶液，可以用于强酸，不适用于二甲基甲酰胺。,9,常用的脱气方法氦气脱气法：利用液体中氦气的溶解度比空气低，连续吹氦脱气，效果较好，但成本高。加热回流法：效果较好，但操作复杂，且有毒性挥发污染。抽真空脱气法：易抽走有机相。超声脱气法：流动相放在超声波容器中，用超声波振荡10-15min，此法效果最差。在线真空脱气法：Agilent1100LC真空脱机利用膜渗透技术，在线脱气，智能控制，无需额外操作，成本低，脱气效果明显优于以上几种方法，并适用于多元溶剂体系。,10,脱气除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡气泡对测定的影响：1）泵中气泡使液流波动，改变保留时间和峰面积2）柱中气泡使流动相绕流，峰变形3）检测器中的气泡产生基线波动,11,为什么溶剂和样品要过滤?溶剂和样品过滤非常重要，它会对色谱柱、仪器起到保护作用，消除由于污染对分析结果的影响。色谱柱：由于填料颗粒很细，色谱柱内腔很小，溶剂和样品中的细小颗粒会使色谱柱和毛细管容易堵塞。仪器：溶剂和样品中的细小颗粒会增加进样阀的堵塞和磨损，同时也会增加泵头内的蓝宝石活塞杆和活塞的磨损。,12,色谱柱柱内体积和平衡时间,单次样品运行时间=分析时间+色谱柱平衡时间色谱柱平衡时间=10倍柱内体积流速平衡时间：大于30min，且基线平稳。,4.6x500.5mL5min4.6x300.3mL3min4.6x150.15mL1.5min4.6x1501.54mL15min,色谱柱柱内平衡时间尺寸体积流速(mm)(Vm)1.0mL/min,色谱柱平衡,13,Agilent1100手动进样器（G1328A,G1328B),进样,14,Agilent1100手动进样器工作原理,六通阀进样器是高效液相色谱系统中最理想的进样器，它是由圆形密封垫(转子)和固定底座(定子)组成。美国Rheodyne公司的六通阀进样器最为通用，各大HPLC仪器制造商均以此产品作为仪器的进样器。,15,工作原理,手柄位进样(Load)位置时，样品经微量进样针从进样孔注射进定量环，定量环充满后，多余样品从放空孔排出；将手柄转动至进样(Inject)位置时，阀与液相流路接通，由泵输送的流动相冲洗定量环，推动样品进入液相分析柱进行分析。,16,1）进样应使用液相色谱专用平头进样针2）进样时，进样针应插到底3）转动手柄时应尽快，不要停留在中途4）不使用时将针头留在进样器内5）样品溶液pH小于10,常用密封垫的材质适用pH10,否则换特氟隆材质的密封垫pH10-136）分析结束后冲洗进样口，清洗应使用专用针口清洗器,定子,转子,塑料箍,弹簧,不锈钢套,手动进样器操作注意点：,17,7）手柄处于Load和Inject之间时，由于暂时堵住了流路，流路中压力骤增，再转到进样位，过高的压力在柱头上引起损坏，所以应尽快转动阀，不能停留在中途。8）在HPLC系统中使用的注射器针头有别于气相色谱，是平头注射器。一方面，针头外侧紧贴进样器密封管内侧，密封性能好，不漏液，不引入空气；另一方面，也防止了针头刺坏密封组件及定子。手动进样时应注意，针中不能有气泡，在Load状态进样时推针要慢，由Load切换到inject时动作要迅速，停留半分钟后取针，进样后应洗针。,18,9）六通阀进样器的进样方式有部分装液法和完全装液法两种。使用部分装液法进样时，进样量最多为定量环体积的75，如20l的定量环最多进样15l的样品，并且要求每次进样体积准确、相同；使用完全装液法进样时，进样量最少为定量环体积的3至5倍，即20l的定量环最少进样60至100l的样品，这样才能完全置换样品定量环内残留的溶液，达到所要求的精密度及重现性。推荐采用100ul的平头进样针配合20ul满环进样。,19,10）进完样后一定要及时冲洗进样器，特别是用盐或缓冲液作流动相，由于这些溶液会形成结晶从而磨损垫圈。冲洗方法：A.将进样器转至Inject位置，利用液相泵输送高纯水冲洗(这时是冲洗样品环及沟槽）.B.用阀清洗接头和注射器冲洗。,20,实验结束后对于反相柱，如果流动相含缓冲液，请按如下程序冲洗色谱柱：10甲醇水冲60分钟，再换100甲醇冲40分钟；如果流动相不含缓冲液，则用纯甲醇冲60分钟。自动液相色谱仪，缓冲盐通路上的泵要换上水并清洗通路。手动进样阀清洗：冲洗色谱柱时，在Load状态，使用注射器用溶解样品的溶剂冲洗两到三遍，然后到Inject状态，让定量环随柱一起冲洗，冲完柱后，插入堵头，防止灰尘进入定量环。手动进样针必须用溶解样品的溶剂冲洗干净，最后用甲醇冲洗两到三遍。,21,泵的保养：,使用流动相尽量要清洁；进液处的砂芯过滤头要经常清洗；流动相交换时要防止沉淀；避免泵内堵塞或有气泡；每次分析结束后，要反复冲洗进样口，防止样品的交叉污染；,22,柱子在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动；当柱子和色谱仪联结时，阀件或管路一定要清洗干净；要注意流动相的脱气；避免使用高粘度的溶剂作为流动相；进样样品要提纯；严格控制进样量；每天分析工作结束后，要清洗进样阀中残留的样品；每天分析测定结束后，都要用适当的溶剂来清洗柱；若分析柱长期不使用，应用适当有机溶剂保存并封闭；,色谱柱的保养,23,紫外灯的保养,在分析前、柱平衡得差不多时，打开检测器；在分析完成后，马上关闭检测器。样品池要保养,二、常见问题分析,25,色谱图常见问题,保留时间变化保留时间缩短可能的原因解决方法1.流速增加检查泵,重新设定流速2.样品超载降低样品量3.流动相组成变化防止流动相蒸发或沉淀4.温度增加柱恒温,26,保留时间延长可能的原因解决方法1.流速下降，管路泄漏更换泵密封圈,排除泵内气泡2.硅胶柱上活性点变化用流动相改性剂,如加三乙胺3.流动相组成变化防止流动相蒸发或沉淀4.温度降低采用柱温箱或控制室温；,27,出现肩峰或分叉可能的原因解决方法,1.样品体积过大2.柱塌陷或形成短路通道更换色谱柱3.柱内烧结不锈钢失效更换烧结不锈钢,过滤样品4.进样器损坏更换进样器转子,28,基线噪声可能的原因解决方法1.气泡(尖锐峰)流动相脱气；2.污染(随机噪声)清洗柱,净化样品,用HPLC级试剂；3.检测器灯连续噪声更换氘灯；4.电干扰(偶然噪声)采用稳压电源检查干扰的来源5.检测器中有气泡流动相脱气,29,峰拖尾可能的原因解决方法1.柱超载降低样品量,增加柱直径采用较高容量的固定相；2.峰干扰清洁样品,调整流动相；3.硅羟基作用加三乙胺,用碱致钝化柱，增加缓冲液或盐的浓度，降低流动相PH值,钝化样品,30,5.柱塌陷或形成短路通道更换色谱柱6.死体积或柱外体积过大连接点降至最低,对所有连接点作合适调整,尽可能采用细内径的连接管7.柱效下降更换柱,采用保护柱8.采用流动相溶解样品避免溶剂效应,31,样品溶剂效应,32,峰展宽可能的原因:解决方法1.进样体积过大；2.在进样阀中造成峰扩展，进样前后排出气泡，以降低扩散；3.数据系统采样速率太慢，设定速率应是每峰大于10点；4.检测器时间常数过大，设定时间常数为感兴趣第一峰半宽的10%；5.流动相粘度过高，采用低粘度流动相；6.保留时间过长，等度洗脱时增加溶剂含量，也可用梯度洗脱；7.样品过载进小浓度小体积样品；,33,鬼峰1.进样阀残余峰:每次用后用强溶剂清洗阀,改进阀和样品的清洗2.样品中未知物:处理样品3.柱未平衡:重新平衡柱,用流动相作样品溶剂(尤其是离子对色谱)4.水污染(反相):通过变化平衡时间检查水质量，用HPLC级的水,34,色谱柱,构造色谱柱是色谱仪的最重要部件，它由柱管和固定相组成。柱管多用不锈钢制成，压力不高时，也可采用厚壁玻璃和石英管，管内壁要求有很高的光洁度。高效液相色谱柱几乎都是直形，按主要用途分为分析型和制备型，它们的尺寸规格也不同。色谱柱两端的柱接头内装有烧结不锈钢滤片，其孔隙小于填料粒度，以防止填料漏出。,35,柱性能评价柱性能指标包括在一定实验条件(试验样品、流动相、流速、温度)下的：柱压理论塔板高度和理论塔板数对称因子、容量因子分离度等,36,色谱柱的使用及操作流动相的转换流速(压力)的变化幅度温度的变化幅度专用色谱柱样品及溶剂的要求,37,柱子的保养1)柱子在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动2)一般说来色谱柱不能反冲，只有生产者指明该柱可以反冲时，才可以反冲除去留在柱头的杂质。否则反冲会迅速降低柱效。3)选择使用适宜的流动相(尤其是pH2-8)，避免使用高粘度的溶剂作为流动相；有时可以在进样器前连接一预柱，分析柱是键合硅胶时，预柱为硅胶，流动相在进入分析柱之前被硅胶“饱和”，避免分析柱中的硅胶基质被溶解。4)要注意流动相的脱气；5)进样样品要提纯；避免将基质复杂的样品尤其是生物样品直接注入柱内，需要对样品进行预处理或者在进样器和色谱柱之间连接一保护柱。保护柱一般是填有相似固定相的短柱，保护柱可以而且应该经常更换;严格控制进样量；,38,7)每天分析工作结束后，要清洗进样阀中残留的样品；用适当的溶剂来清洗柱；8)保存色谱柱时应将柱内充满乙睛或甲醇，柱接头要拧紧，防止溶剂挥发干燥。绝对禁止将缓冲溶液留在柱内静置过夜或更长时间。9)色谱柱使用过程中，如果压力升高，一种可能是烧结滤片被堵塞，这时应更换滤片或将其取出进行清洗；另一种可能是大分子进入柱内，使柱头被污染；如果校效降低或色谱峰变形，则可能柱头出现窝陷，死体积增大。在后两种情况发生时，小心拧开柱接头，用洁净小钢铲将柱头填料取出1-2mm高度(注意把被污染填料取净)，再把柱内填料整平。然后用适当溶剂湿润的固定相(与柱内相同)填满色谱柱，压平，并拧紧柱接头。这样处理后柱效能得到改善，但是很难恢复到新柱的水平。,39,色谱柱的故障,滤片或填料堵塞样品或流动相中杂质吸附机械振动产生空隙填料变性,40,滤片或填料堵塞,使用预柱缓冲液和溶剂使用0.45um滤膜过滤样品溶液使用0.45um滤膜过滤反向连接色谱柱，使用清洗溶剂以小流量送液打开柱头，清洗或更换滤片,41,样品或流动相中杂质吸附,杂质会产生拖尾峰,仅1cm深度会被污染,色谱柱,取出污染填料，装填新的填料,42,现象：无压力，流动相不流动可能原因1、保险丝断或电源问题2、柱塞杆折断3、泵头内有空气或流动相不足4、单向阀损坏5、漏液6、压力传感器损坏(流动相流动正常，但无压力),压力异常,43,现象：压力持续偏高或不断上升1、流速设定过高2、保护柱或柱子筛板堵塞3、流动相使用不当或有缓冲盐析出4、色谱柱选择不当5、进样阀损坏6、线路过滤器堵塞,压力异常,44,现象：压力持续偏低1、流速设定过低2、色谱柱选择不当3、柱温过高4、系统漏液,压力异常,45,压力异常,现象：压力波动可能原因1、泵头中有气泡2、单向阀损坏3、柱塞密封圈损坏4、脱气不充分5、系统