再用CTAB溴化十六烷基三甲铵络合法进一步精制得银耳多糖纯品并.ppt

,黑龙江生物科技职业学院,生物制药技术,生物分离技术,主讲人：张爱华,实训七、银耳多糖的制备及鉴定,实验原理,2,材料用具,3,操作方法,4,目的要求,2,1,5,5,注意事项,目的要求,了解银耳多糖制备的基本原理,掌握糖类物质提取纯化的基本操作技术,原理,银耳多糖主要成分为酸性杂多糖、中性杂多糖、胞壁多糖、胞外多糖及酸性低聚糖五类，不含核酸、蛋白质类物质。,可利用银耳子实体经水浸泡捣碎，酶浸提，乙醇沉析分离可制得银耳多糖粗品，再用CTAB(溴化十六烷基三甲铵)络合法进一步精制得银耳多糖纯品并进行多糖的鉴定。,材料用具,银耳子实体干品（50g左右）,烧杯、布氏漏斗、抽滤瓶、分液漏斗、量筒、离心机、恒温水浴锅、透析袋、滤纸、组织捣碎机、不锈钢锅。,试剂,（1）1复合酶制剂(含果胶酶、纤维素酶和中性蛋白酶食品级复合酶)；（2）2溴化十六烷基三甲铵（CTAB）配制：取2gCTAB溶于100mL蒸馏水中，摇匀备用；（3）-萘酚配制：-萘酚5g溶于95乙（4）5%三氯乙酸-正丁醇溶液；（5）2molL的氢氧化钠溶液；（6）0.5甲苯胺乙醇溶液；（7）2molL氯化钠溶液；（8）2molL盐酸溶液；（9）活性炭；硅藻土。（10）1融菌酶制剂；（11）无水乙醇；（12）浓硫酸；（13）乙醚。,操作方法,1.银耳预处理,20g锈钢锅中,加水1600mL,2025浸泡30min,捣碎机中捣碎,银耳浆液,操作方法,2molL盐酸溶液调pH至6.3,加入1复合酶制剂,50下酶促反应40min,银耳浆液,2.酶浸提,80灭酶，保温浸提约1.5h,80水浴浓缩,操作方法,等体积5三氯乙酸-正丁醇溶液,摇匀,离心（3000r/min）15min,浓缩液,3.多糖的沉淀（有机酸除杂）,下层清液备用,吸去上层正丁醇中层变性蛋白,操作方法,2molL的氢氧化钠溶液调pH至7,摇匀,抽滤,3.多糖的沉淀（脱色、透析）,下层清液备用,加1活性炭80加热15min脱色,滤液扎袋流水透析12h,80水浴浓缩抽滤,操作方法,加3倍量95乙醇,摇匀,3.多糖的沉淀（乙醇沉析）,抽滤液,离心（3000r/min）15min,沉淀用无水乙醇洗2次,乙醚洗涤1次,50以下真空干燥,操作方法,4.精制（一）,取粗品1g,溶于100mL水中,搅拌静置2h,2CTAB,滤液,离心除不溶物,60解离4h,离心3000r/min15min,80热水洗,氯化钠2molL溶液100mL,操作方法,4.精制（二）,解离液,加三倍量95乙醇,透析液80浓缩,离心3000r/min15min,精品银耳多糖,离心3000r/min15min,沉淀用无水乙醇、乙醚洗涤,上清液流水透析10h,50真空干燥,操作方法,5.多糖的鉴定（一）,观察硫酸层与糖溶液界面处颜色变化,透析液1mL,-萘酚溶液2滴,颜色变化,摇匀,沿管壁缓加入浓硫酸1.5mL(勿振动),操作方法,5.多糖的鉴定（二）,透析浓缩,透析浓缩2mL,点于滤纸,0.5甲苯胺乙醇溶液染色,加入2CTAB溶液24滴,观察现象,注意事项,1.酶促反应的时间、温度应控制好。,2.在制备全流程中应时刻注意温度，不能超过80,