微生物基本试验原理及操作ppt课件

微生物基本试验的原理和操作、微生物基本试验、碳源和氮源利用试验、碳水化合物的代谢试验、各种酶类试验、氨基酸和蛋白质代谢试验、碳源和氮源利用试验、柠檬酸盐试验、柠檬酸盐试验、原理：把柠檬酸盐作为唯一的碳源，分解柠檬酸钠可以把柠檬酸盐作为唯一的碳源的细菌，也可以把铵盐作为唯一的氮源利用，铵盐分解成氨产生碱性。 西蒙氏柠檬酸盐培养基成分，mgso4- 7h2o 0.2 gn H4 H2 po 41gk2hpo 41 g柠檬酸钠5g氯化钠5g琼脂20g0.2%溴麝香草酚蓝溶液40ml蒸馏水1000ml，结果：阳性者表面出现菌落葡萄糖酸盐试验、原理：检查细菌是否具有唯一氧化葡萄糖的碳源，将2-酮葡萄糖酸盐和班尼试剂混合加热，具有生成黄酮类的能力。 在培养基中接种大量的被检菌，加热煮沸35、24-48小时、0.5ml的培养基加班试剂3滴左右，观察结果。 葡萄糖酸盐胨肉汤成分，胨0.15g酵母提取物0.1g磷酸二氢钾0.1g葡萄糖酸钾(或钠) 4g蒸馏水100ml，结果：黄色沉淀为阳性，无色变化为阴性。 碳水化合物代谢试验、氧化发酵试验(OF试验)糖醇发酵试验b-半乳糖苷酶试验(ONPG试验)甲基红试验VP试验胆汁七叶糖苷试验、氧化发酵试验(OF试验)原理：细菌分解葡萄糖的过程中，分子氧必须参加的是氧化型可以利用这个实验区分细菌的代谢类型。Hugh-leiffson二氏培养基(O-F培养基)成分，胨2g磷酸氢2钾0.3氯化钠5g葡萄糖10g0.2%溴麝香蓝溶液12ml琼脂2.5g蒸馏水1000ml，方法：将被检菌用2根Hugh-leifff 培养35、48小时的观察结果。 培养基的颜色变黄就会发酸。 结果表明，代谢型加蜡封口管的发酵型酸产不变色酸产不变色的糖醇发酵试验，原理：各种细菌含有发酵不同的糖、醇类酶，分解糖、醇类的能力各不相同。 分解糖、醇类的代谢产物根据菌种的不同而不同，有时仅产生酸、产气、酸，用于细菌的鉴别。糖、醇类的试验培养基成分、胨水或肉汤100ml所需的糖、酒精或糖苷0.5或1g1.6%溴甲酚紫乙醇溶液0.1ml，结果，所接种的细菌有分解培养基中的糖类生成酸的能力时产气剂在半固体培养基内或液体培养基中的逆管内产生气泡。 不分解就没有变化。B-半乳糖苷酶试验(ONPG试验)、原理：某些细菌产生B-半乳糖苷酶，该酶分解邻硝基酚-B-D-半乳糖苷酶(ONPG )。 ONPG为无色，水解b半乳糖苷酶后，产生黄色的邻硝基酚，即使浓度低也能检测出。 其结果，黄色显示阳性反应。 快速慢分解乳糖的细菌ONPG试验阳性，本试验可作为慢发酵乳糖菌株的快速鉴定方法。甲红试验、原理：有的细菌在糖代谢过程中分解葡萄糖生成丙酮酸，丙酮酸进一步分解为甲酸、醋酸、乳酸等，培养基的pH降低到4.5以下，加入甲红指示剂后变成红色(阳性)。 甲基红试验、原理：一种细菌分解葡萄糖的酸量少，或产生的酸进一步转化成另一种物质(如醇、酮、醛、气和水)，培养基的酸碱度还在6.2以上，因此加入甲基红指示剂、葡萄糖胨水培养基成分、多价胨7g葡萄糖5g磷酸氢二钾5g蒸馏水1000ml，方法：将被检菌接种于上述培养基中，在35下培养48小时，在2ml培养液中加入2滴甲基红指示剂，立即观察结果。结果：红色阳性橙色弱阳性，黄色阴性。 VP试验、原理：有在葡萄糖代谢过程中产生丙酮酸，丙酮酸进一步脱羧后会产生乙酰甲基甲醇的细菌。 乙酰甲基甲醇在碱性溶液中被空气的氧氧化为二乙酰(丁二烯酮)，进而与培养基内的胨中的精氨酸中含有的胍基反应，生成红色化合物，即VP反应阳性。 培养基中的胍基过少时，如果加入少量肌酸酐、肌酸酐等含有胍基的化合物，就能促进反应。 试剂： a液：6%a-萘酚乙醇溶液b液： 40%氢氧化钾溶液，方法：在被检菌中接种葡聚糖水培养基后，在35培养48小时，2ml培养基中加入a液1ml和b液0.4ml，振荡观察结果。结果：若数分钟内没有出现红色阳性的红色，则在35下4小时后也像原来一样为阴性。 本考试很敏感。胆汁七叶苷试验，原理：在10-14%胆汁存在下，细菌测定葡萄糖苷七叶苷水解为七叶亭和葡萄糖的能力。胆汁七叶苷培养基成分，胨5g牛肉提取物3g牛胆汁(胆汁) 40g七叶苷1g柠檬酸铁0.5g琼脂15g蒸馏水1000ml，结果：培养基呈黑色或深褐色。 有生长物时，并不是七叶糖苷开裂，显示仅靠胆汁浓度，不能抑制d群链球菌外的细菌的生长。 各种酶类试验、过氧化氢酶(过氧化氢酶)试验、血浆凝固酶试验、硝酸盐还原试验、胆汁溶解试验、过氧化氢酶(过氧化氢酶)试验、原理：部分细菌具有过氧化氢酶，能把过氧化氢酶分解为水。 试剂：3%过氧化氢溶液。 方法用牙龈采集培养了1824小时的苔藓，放在清洁的玻璃板上，滴下12滴3%过氧化氢溶液。 试管法：在试管中接种不含血液的1824小时的培养物，加入1 ml3%过氧化氢溶液。 3%过氧化氢溶液必须放入棕色瓶子冷藏。结果：大量气泡产生为阳性，不产生气泡为阴性。 血浆凝固酶试验、原理：凝固酶能凝固血浆纤维蛋白是鉴定金黄色葡萄球菌的主要试验。 本试验分为玻璃板法和试管法，玻璃板法主要检测结合凝固酶，试管法肯定玻璃板法的试验结果，对玻璃板法的试验阴性者进行复查，是为了检测游离凝固酶。 血浆凝固酶试验、原理：凝血酶包含于金黄色葡萄球菌细胞表面，游离凝固酶是金黄色葡萄球菌产生的胞外酶，两酶均被用于血浆中的纤维蛋白原，转换成纤维蛋白，形成凝固块。方法：玻璃板法：向玻璃板滴下灭菌生理盐水，取葡萄球菌18-24小时的肉汁培养物的环，或选择平板上的各个菌落制成浓菌悬浊液，再将新鲜人和兔子的血浆和菌悬浊液混合。 同时进行阳性菌和阴性菌对照试验，立即观察凝固块的形成。 本试验首先要乳化在生理盐水中，检查有无自我凝固现象。 防止假阳性结果的发生。 阳性结果一般在5-20秒以内出现，34分钟后也不凝固的情况下，可以认为是玻璃板法试验阴性。试管法：在清洁的试管中加入未经稀释的人和兔子血浆0.5ml，再加入18-24小时的葡萄球菌肉汁培养物0.5ml，装满，或选择平板上的纯菌落，轻轻转动试管混合。 放入35水浴中4小时，每30分钟检查有无凝固。 检查时不要使试管振动或摇动，轻轻倾斜试管，观察有无凝固。 大多数黄色葡萄球株在354小时内能凝固血浆，阴性则作对照。 枸楠酸盐抗凝固的血浆会产生假阳性结果。、氧化酶试验、原理：某些细菌具有氧化酶，在氧和细胞色素c时，使还原型细胞色素c氧化，氧化型细胞色素c使二甲基对苯二胺氧化，从玫瑰色变成暗紫色。 蚁群本身带有红色，有时很难观察。 加入a-萘酚乙醇溶液，可以生成深蓝色的靛酚蓝。 试剂： 1.1%盐酸二甲基对苯二胺(或四甲基对苯二胺)水溶液2.1%a-萘酚95%乙醇溶液，方法：取18-28小时的新鲜培养物，在无菌滤纸条上沾一点菌落，1%盐酸二甲基对.结果： 1分钟内紫红色呈阳性。 菌落本身有色素时，加入1-2滴a-苯酚，变成蓝色时呈阳性。硝酸盐还原试验、原理：硝酸盐还原反应有两个过程，一个是将硝酸盐还原成亚硝酸盐，二个是继续将亚硝酸盐进一步分解成氨、氮、氧化氮等气体终端物。 硝酸盐还原试验培养基成分，胨1g硝酸钾0.1g蒸馏水100ml，方法：将检查对象菌接种在硝酸盐培养基中，在35下培养14天，将甲、乙试剂分别放入试管中，混合观察结果，结果：红为阳性。 如果没有出现红色，就应该添加少量的锌粉，如果没有红色，亚硝酸盐就会进一步分解成氮、氨等气体，如果应该判定为阳性的锌粉变红时，还原剂锌粉会将硝酸盐还原成亚硝酸盐，被检测菌显示出不还原硝酸盐的能力，为阴性。 胆汁溶解试验，原理：在特定的时间和温度条件下测定胆盐溶解细菌的能力。 溶菌酶的机制尚未定论，认为胆盐和胆汁能激活肺炎链球菌的溶菌酶，溶解菌体。 试剂： 10%脱氧胆酸钠溶液或牛胆汁.平板法： 10%脱氧胆酸钠溶液接种后，加入血液琼脂平板的试验菌落，35培育30分钟，肺炎链球菌菌落阳性消失。 阴性者的菌落还存在。环腺苷酸(cAMP )试验、原理： b组链球菌(无链球菌)在羊血或牛血培养基上与金黄色葡萄球菌溶血素协同作用，可产生促进溶血素活性的因子(cAMP因子)。 因此，在两种细菌的边界上溶血力增加，出现了箭头状溶血区。方法：先在羊血平板上接种金黄色葡萄球菌(药敏菌)，然后垂直接种被检菌和金黄色葡萄球菌接种线，两者不能交叉，相隔3mm左右。 同时，在被检菌接种线的另一侧，用同样的方法接种阴性和对照菌，在35下培养夜晚，放入CO2蜡烛筒中为好(最好是金黄色葡萄球菌用ATCC25923 )。结果：被检菌接种线和黄色葡萄球菌接种线上出现矢状溶血区，CAMP阳性。 阴性没有强化溶血区。 氨基酸和蛋白质代谢试验，吲哚试验硫化氢试验苯丙氨酸脱氨酶试验氨基酸脱碳酸酶试验(赖氨酸，鸟氨酸，精氨酸)尿素酶试验明胶液化试验，吲哚试验，原理：细菌分解胨中的色氨酸，吲哚、胨水培养基成分、胨(或胨) 10-20g氯化钠5g蒸馏水1000ml、kovac试剂首先将试剂溶解于10g二甲基氨基苯甲醛150ml纯浓盐酸50ml中，慢慢加入盐酸选择纯培养物接种胨水培养基，在35下培养12天，沿管壁慢慢加入kovac氏试剂0.5ml，制成2层，观察结果。 结果：两者液面边界红色阳性，无色阴性。 硫化氢试验、原理：细菌分解培养基中的含硫氨基酸(胱氨酸、半胱氨酸等)和硫化物生成硫化氢，硫化氢遇到铅和铁离子生成黑色硫化物。 间接地检测细菌是否会产生硫化氢。 培养基：三糖铁培养基或克二糖铁培养基，结果：培养基黑阳性，变化阴性。、苯丙氨酸脱氨酶试验，原理：细菌产生苯丙氨酸脱氨酶，以苯丙氨酸为脱氨基产生苯丙氨酸，在苯丙氨酸和铁离子的作用下产生绿色络合物。 苯丙氨酸培养基成分、DL苯丙氨酸0.2g(L苯丙氨酸0.1g )酵母提取物0.3g氯化钠0.5g磷酸氢二钠0.1g琼脂1.2g蒸馏水100ml、试剂： 10%氯化铁溶液：蒸馏水100 g 、方法：将被检菌接种到培养基斜面，35培养24小时，滴加氯化铁试剂，观察结果。结果：培养基斜面绿色阳性，不变色为阴性。 氨基酸脱羧酶试验(赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸)原理：细菌使氨基酸从羧基中脱离，生成胺化合物，检测培养基变成碱的能力。 将氨基酸脱羧酶的基础培养基成分、胨5g酵母提取物1g6%溴甲酚紫苏液1ml蒸馏水1000ml溶解于蒸馏水中，然后加入所需氨基酸(赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸)，使其达到0.5%。 对照管不加氨基酸。 将检查对象菌接种到氨基酸脱碳酸培养基和对照管中，封入灭菌流动石蜡，培养35种，得到24小时以上的观察结果。 注意事项，培养基的pH值是偏酸，有利于酶的形成。 封入流动石蜡会引起厌氧环境，在厌氧环境下氨基酸脱碳生成的胺稳定，还能避免假阳性。 对照管不变色就不能判断结果。 接种检查对象菌测定的培养基为紫色，对照管为黄色阳性，两管均为黄色阴性。 脲酶试验，原理：部分细菌可产生脲酶。 脲酶分解尿素，尿素分解后产生大量的氨，培养基变成碱。 尿素培养基成分、胨1g氯化钠5g葡萄糖1gKH2PO42g20%尿素水溶液100ml琼脂15g0.1%酚红水溶液12ml蒸馏水900ml，方法：在尿素培养基上接种被检菌后，在35下培养18-24小时，观察结果。 阴性必须观察四天。 细菌分解尿素后，培养基变红，不呈阳性，不呈阴性。 明胶液化试验、原理：明胶酶是细菌产生的细胞外酶，把明胶分解成氨基酸，失去凝固力，使半固体的明胶培养基成为液体。 明胶培养基的制法一般在琼脂中加入1%明胶就完成了。方法：将被检菌穿刺接种到明胶培养基上，培养