RNA extraction.ppt

分子生物学实验技术,1.定义2.课程安排：2+4,总RNA提取实验操作步骤、注意事项及问题指南,于杨动脉粥样硬化研究所副教授thereismywill,RNA研究的重要性,DNA，RNA和蛋白质是三种重要的生物大分子，是生命现象的分子基础。DNA的遗传信息决定生命的主要性状，而mRNA在信息传递中起很重要的作用。其它两大类RNA，rRNA和tRNA，同样在蛋白质的生物合成中发挥不可替代的重要功能。因此mRNA、rRNA、tRNA在遗传信息由DNA传递到表现生命性状的蛋白质的过程中举足轻重。,RNA分布,在大肠杆菌中，rRNA量占细胞总RNA量的75%-85%，而tRNA占15%，mRNA仅占3-5%。,RNA提取流程样品前处理注意点,RNA提取流程样品前处理中如何保存样本,RNA提取流程细胞裂解，以释放RNA,异硫氰酸胍/酚TRizol总RNA提取试剂,胍盐/-巯基乙醇RNAprep系列RNA提取试剂盒,原理及要点,RNA提取原理：通过变性剂破碎细胞或者组织，然后经过氯仿等有机溶剂抽提RNA，再经过沉淀，洗涤，晾干，最后溶解。但是由于RNA酶无处不在，随时可能将RNA降解，所以实验中有很多地方需要注意，稍有疏忽就会前功尽弃。RNA提取的一般步骤所有RNA的提取过程中都有五个关键点，即：样品细胞或组织的有效破碎；有效地使核蛋白复合体变性；对内源RNA酶的有效抑制；有效地将RNA从DNA和蛋白混合物中分离；对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。,最关键的是抑制酶活性。,RNA提取的注意事项杜绝外源酶的污染一：严格戴好口罩，手套。二：实验所涉及的离心管，Tip头，移液器杆，电泳槽，实验台面等要彻底处理。三：实验所涉及的试剂/溶液，尤其是水，必须确保RNase-Free。,阻止内源酶的活性,一：选择合适的匀浆方法。二：选择合适的裂解液。三：控制好样品的起始量。,明确自己的抽提目的,一：任何裂解液系统在接近样品最大起始量时，抽提成功率急剧下降。二：RNA抽提成功的唯一经济的标准是后续实验的一次成功，而不是得率。,Rnase污染的10大来源,1：操作者来源：手指头2：枪头3：水/缓冲液4：实验台面5：内源RNase6：RNA样品7：质粒抽提8：RNA保存9：阳离子(Ca2+,Mg2+)10：后续实验所用的酶,几种RNA提取方法,TRIzol法TRIzol试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂。它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性。加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。收集上面的的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。在除去水样层后，样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。共纯化DNA对于样品间标准化RNA的产量十分有用。,TRIzol的主要成分是苯酚。苯酚的主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。苯酚虽可有效地变性蛋白质，但不能完全抑制RNA酶活性，因此TRIzol中还加入了8羟基喹啉、异硫氰酸胍、-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase（RNA酶）。0.1%的8羟基喹啉可以抑制RNase，与氯仿联合使用可增强抑制作用。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质并使蛋白质二级结构消失，导致细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。-巯基乙醇的主要作用是破坏RNase蛋白质中的二硫键。,TRIzol法提取流程,1样品处理：（）培养细胞：收获细胞1-5107，移入1.5ml离心管中，加入1mlTrizol，混匀，室温静置5min。（）组织：取50-100mg组织（新鲜或-70及液氮中保存的组织均可）置1.5ml离心管中，加入1mlTrizol充分匀浆，室温静置min。2加入0.2ml氯仿，振荡15s，静置2min。34离心，12000g15min，取上清。4加入0.5ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min。54离心，12000g10min，弃上清。6加入1ml75%乙醇，轻轻洗涤沉淀。4，7500g5min，弃上清。7.晾干，加入适量的DEPCH2O溶解（65促溶10-15min）。,在抽提RNA前，先把研钵预冷，往研钵内反复加入液氮，至少4-5次，使研钵充分预冷。从液氮罐中取出样本后，把组织块放入已预冷的研钵中进行研磨，边研磨边加液氮（图1），整个过程都不要使液氮挥干。一次研磨的组织块重量不要超过300mg。研磨到组织样品成粉末状后（一般需要8-10min的研磨过程），在液氮基本挥发完时，在每个研钵中加2-3mlTrizol试剂。由于此时研钵很冷，Trizol加入后会冻结成固体状（图2）。可以继续研磨此固体成粉末（图3），随着研钵温度回升到室温，固体状的Trizol逐步回复到液体状态（图4），此时，若发现液体很粘，研杵能牵起丝状物，说明Trizol的量太少，需在此步继续补加Trizol。若Trizol的量过少，会导致抽提的RNA中有较多的基因组DNA污染。由于Trizol试剂中含有强烈的RNA酶抑制剂，因此组织样品和Trizol充分研磨混匀后就不用担心RNA的降解了。,1,3,2,4,细胞,实验流程图,细胞选择,贴壁细胞悬浮细胞,苯酚法细胞内大部分RNA均与蛋白质结合在一起，以核蛋白的形式存在。因此，提取RNA时要把RNA与蛋白质分离并除去。将细胞置于含有十二烷基磺酸钠（Sodiumdodecylsulfate,SDS）的缓冲液中，加等体积水饱和酚，通过剧裂振荡，然后离心形成上层水相和下层酚相。核酸溶于水相，被苯酚变性的蛋白质或者溶于酚相，或者在两相界面处形成凝胶层。,异硫氰酸胍酚法异硫氰酸胍酚法提取RNA的原理如下：GIT与巯基乙醇共同作用抑制RNase的活性；GIT与十二烷基肌氨酸钠（Sarcosyl）作用使蛋白质变性，从而释放RNA；酸性条件下DNA极少发生解离，同蛋白质一起变性被离心下来，RNA则溶于上清中。该