第2章 遗传学图谱.ppt

第二章遗传图绘制,2.1遗传学图与物理图2.2遗传学作图的标记2.3遗传学作图的方法2.4人类遗传图,为何要绘制遗传图与物理图？,1)基因组太大,必需分散测序,然后将分散的顺序按原来位置组装,需要图谱进行指导。2)基因组存在大量重复顺序,会干扰排序,因此要高密度基因组图。3)遗传图和物理图各有优缺点,必须相互整合校正。,结构基因组的研究策略,结构基因组的研究策略,基因组测序的策略-由上至下(左)和由下至上的测序(右),克隆重叠群指导的测序,重叠群（contig):指相互间存在重叠顺序的一组克隆。,Clone-by-clone测序,鸟枪法测序,混合法测序(Hybridstrategy),混合法测序(Hybridstrategy),一、遗传图谱与物理图谱,2遗传学图谱2.1遗传图与物理图,2.1.1遗传图遗传图是应用遗传学分析方法将基因或其他DNA顺序标定在染色体上构建的连锁图。这一方法包括杂交实验，家系分析等。遗传图距单位为厘摩(cM),每单位厘摩定义为1%交换率。2.1.2物理图物理图是应用分子生物学技术来直接将DNA分子标记、基因或克隆标定在基因组实际位置。物理图的距离依作图方法而异，如辐射杂种作图的计算单位为厘镭(cR),限制性片段作图与克隆作图的图距为DNA的分子长度，即碱基对(bp,kb)。,2遗传学图谱2.2遗传作图的标记,遗传标记的类型:基因标记DNA标记遗传标记的特征:亲本间存在着多态性（即差异），也就是说具有可识别性。亲本间存在的多态性在后代中可以重演，即具有可遗传性。,2遗传学图谱2.2遗传作图的标记,个体上可以看见的遗传标记基因，如花色（红花、白花）、株高（高秆、矮秆）等。生化性状基因，如血型系列(ABO)分析、血清蛋白、免疫蛋白、同工酶等。,2.2.1基因标记(性状标记):,水稻部分形态学标记性状及其基因性状分类标记性状已鉴定的基因举例色素紫色叶耳Pau紫色叶舌Plg紫色谷壳Pr黑色谷壳Bh紫色柱头Wh紫色叶鞘Psh籽粒有芒An-1,An-2,An-3内颖发育不全dp-1,dp-2大胚ge圆粒rk-1,rk-2多雌蕊mp-1,mp-2资料来源：RiceGenet.News.Vol.6。,同工酶标记是指以同工酶带型为标记，通过电泳使同工酶带型产生多态性。,2遗传学图谱2.2遗传作图的标记,水稻部分同工酶基因同工酶基因座位染色体等位基因酸性磷酸酯酶Acp-1120-3Acp-2120,3Acp-471,2乙醇脱氢酶Adh-1110-3-淀粉酶Amy-170-3过氧化氢酶Cat-160-3酯酶Est-260,1,2Est-391,2Est-510,1,2Est-770,1Est-971,2资料来源：RiceGenet.News.Vol.7。,2遗传学图谱2.2遗传作图的标记,2.2.2DNA标记（DNAmarkers）:是指以DNA片段为标记，通过DNA片段的电泳使DNA产生多态性，如RFLP等。,2遗传学图谱2.2遗传作图的标记,基因标记(性状标记):存在的问题：数量有限。虽然经过近百年的努力，目前这些标记的数量仍然不多，因此限制了这些标记的利用。操作上比较麻烦，难以开展大规模的研究和利用。高等生物基因组存在大量基因间隔区，纯粹的基因标记在遗传图中会留下大片的无标记区段。部分基因无法通过实验区分。,DNA标记具有的优势：在数量上是巨大的；操作相对简单，适合大规模开展工作；标记比较明显，容易识别；受环境影响少，标记本身就是遗传物质。,2遗传学图谱2.2遗传作图的标记,2遗传学图谱2.2遗传作图的标记,同工酶标记和DNA标记都是分子标记。但目前分子标记一般指DNA标记。,2遗传学图谱2.2遗传作图的标记,2.2.3DNA标记1)RFLP(Restrictionfragmentlengthpolymorphism)，最早发现的DNA分子标记，译为限制性片段长度多态性。Botstein等1980年首次发现，以后被大量利用，在微生物、植物、动物和人类上都得到了广泛的利用。RFLP标记是最早利用的DNA标记，在技术上比较复杂，涉及多个环节。人类基因组中大约有105个RFLP。,RFLP是如何发现的?,在犹他州盐湖城滑雪胜地艾尔塔的一场例行的学术讨论中,从事经典人类遗传学研究的专家与从事分子生物学研究的专家进行学术交流。分子生物学家从经典遗传学的研究中获得灵感。,DavidBotstein,DavidBotstein虽然是首先提出RFLP想法的科学家,但他的思想并没有及时跟上历史步伐,他是极力反对人类基因组计划的著名科学家之一.PRINCETON,N.J.-PrincetonUniversityhasnamedDavidBotstein,arenownedgeneticist,educatorandpioneeroftheHumanGenomeProject,asthenewdirectoroftheLewis-SiglerInstituteforIntegrativeGenomics.BotsteinwillsucceedShirleyM.Tilghman,whowasthefoundingdirectoroftheinstituteandbecamepresidentoftheUniversityin2001,andJamesBroach,whoisinterimdirector.BotsteinsappointmentwillbeginJuly1,2003.,第1篇有关人类RFLP实验论文,AHighlyPolymorphicLocusinHumanDNAArleneR.WymanandRayWhite,MITAlocusinthehumangenome,notassociatedwithanyspecificgene,hasbeenfoundtobeasiteofrestrictionfragmentlengthpolymorphism.Thepolymorphismwasfoundbyhybridizinga16-kilobase-pairsegmentofsingle-copyhumanDNA,selectedfromthehumangenomelibraryclonedinphageCH4A,toaSoutherntransferoftotalhumanDNAdigestedwithEcoRI.DNAsfromanumberofindividualsfromwithinMormonpedigreesaswellasrandomindividualshavebeenexamined.Thelocusishighlyvariable,withatleasteightallelespresent,homozygotesaccountingforlessthan25%oftheindividualsexamined.-PNAS|November1,1980|vol.77|no.11|6754-6758,第一篇RFLP论文的诞生,1)DavidBotstein等在Alta的研究生学术讨论上提出RFLP的想法。2)Skolflick将Botstein的想法告诉他父亲的好友-当时洛克菲勒大学校长,诺贝尔奖得主赖得堡,并又告之Botstein的老师Fox(MIT).Fox向Botstein了解,并叫他的学生White寻找人类基因组中的RFLP。3)White安排他的一位女博士后Whyman从事这一研究.Whyman从自己构建的基因文库中分离到一个片段作为探针,在56名摩门教成员中发现8个成员含有该片段多态性结构。从而完成了一项具有里程碑意义的研究。,RFLP多态性的产生与检测,2遗传学图谱2.2遗传作图的标记,RFLP操作流程,DNA提取限制性内切酶处理电泳,探针杂交,放射性自显影,探针制备,转膜,RFLP的特点,1)处于染色体上的位置相对固定;2)同一亲本及其子代相同位点上的多态性片段特征不变;3)同一凝胶电泳可显示不同多态性片段，表现为共显性；4）只有两种等位形式。,如何寻找RFLP标记,1)随机克隆筛选;2)将其它方法获得的DNA标记,如RAPD(randomamplifiedpolymorphismDNA)标记转换为RFLP标记;3)从cDNA中寻找RFLP；4)计算机筛选。,AFLP(amplifiedfragmentlenthpolymorphism,放大的片段长度多态性),1)这是一种筛选RFLP分子标记的方法.先将DNA样品采用选定的限制性内切酶(如EcoRI,Sau3A)消化,然后加上接头PCR引物；2)接头PCR引物设计:根据限制酶接头添加数个向外延伸的碱基,然后向3方向延伸1-3个不同的碱基；3)选择不同的引物对扩放样品DNA,经聚丙烯胺凝胶电泳分离标记的PCR产物。,AFLP的操作程序,2遗传学图谱2.2遗传作图的标记,2.2.2DNA标记2）SSLP(simplesequencelengthpolymorphism)即简单序列长度多态性，是由于简单序列的重复次数不同，导致扩增片段长度不同而产生的多态性。,2遗传学图谱2.2遗传作图的标记,小卫星序列（minisatellite)又称为可变数目的串联重复（variablenumberoftandemrepeat,VNTR)。重复单位长度为几十个核苷酸。微卫星序列（microsatellite）又称简单序列重复（simplesequencerepeat，SSR），或称短串联重复（shorttandemrepeat，STR），是一类由几个（一般2-4个）核苷酸为重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联重复序列。,SSLP的两种类型：,为什么微卫星比小卫星更常用做DNA标记？1）小卫星在基因组中分布不均匀，更常见于染色体末端。微卫星序列在整个基因组中分布均匀，而且密度高；2）小卫星不适用于PCR分型，因为它的重复单位较长，可以形成20kb长的聚集区，而微卫星区较短，通常小于150bp，用PCR扩增时反应快又精确。人类基因组约有6.5105个微卫星标记。,由于重复单位的不同，微卫星存在着多种不同的类型。各类微卫星的频率在不同的生物体之间存在着显著的差异。在人类基因组中，最丰富的微卫星是(A)n、(AC)n、(AAAN)n、(AAN)n和(AG)n。(AT)n是植物基因组中最丰富的微卫星。在水稻基因组中，最丰富的微卫星是(GA)n和(GT)n。不同生物的基因组中，微卫星的丰度也差异较大。哺乳动物基因组中微卫星的丰度约为植物基因组的5倍。在植物中，双子叶植物微卫星的丰度约为单子叶植物的3倍。,SSRmotif,EstimatednumberofSSRinthericegenome,在微卫星DNA中，简单序列的重复次数在同一物种的不同品种或不同个体中存在着较大的差异。也就是说，微卫星座位上存在着非常丰富的等位基因。例如，在水稻中，RFLP座位的等位基因数为2-4个，而微卫星的等位基因数为2-25个。从多态性信息含量（polymorphisminformationcontent，PIC）来衡量，RFLP的PIC值为0.39，而微卫星的PIC大于0.75。由于微卫星座位具有丰富的等位基因，因此微卫星标记是一类比较理想的分子标记。,SSLP多态性信息量,如何检测SSR,SSR在遗传学上的应用,基因组复制产生的“滑移”现象导致微卫星具有很大的变异性，这种变化造成任何两个个体都不会有完全相同的微卫星变异组合。因此根据微卫星序列的差异可以建立每个人的遗传档案（geneticprofile)，应用于法医鉴定。也用于鉴定可以珍稀动植物的亲源关系。,SSR的特点,1)染色体上的位置相对固定;2)操作简单，可以用PCR分型;3)同一凝胶电泳可显示不同多态性片段,表现为共显性；4）有多种等位形式。,遗传作图中使用的SSR分析,人6号染色体SSR的PCR产物电泳图。PCR产物用蓝色和绿色荧光标记。红色是分子量大小标记。,每条泳道显示了每个人的遗传图，没有任何两个人的遗传图相同。,2遗传学图谱2.2遗传作图的标记,3）SNP(SingleNucleotidePolymorphism)，即单核苷酸多态性。优点：数量极大；可实行快速自动化检测。缺点：大多数只有两个等位基因，限制了其在人类基因作图上的应用价值。思考：为什么SNP限制了其在人类基因作图上的应用价值？,SNP(singlenucleotidepolymorphism,单核苷酸多态性),SNP的一些特点,1)理论上同一碱基位置SNP等位型式最多为4，但多数为2；2)直接从STS(sequence-taggedsite)测序中可寻找到SNP；3)数量极大,人类基因组平均每1kb含有一个SNP.估计共有300万个SNP；4)SNP与人类易感性疾病有关,涉及药物基因组学；5)编码区SNP主要分布在密码子的第3个碱基位置。,如何检测SNP,1）DNA芯片技术：将待测的DNA用荧光标记物标记，点到玻璃或硅制的芯片表面（有原位合成的寡核苷酸），然后用荧光显微镜检测，发出荧光信号的位置表明寡核苷酸与待测的DNA杂交。原理：DNA芯片技术以寡核苷酸杂交为基础。寡核苷酸是在试管中合成的通常小于50bp的短的单链DNA分子。在适当的条件下一个寡核苷酸只有在与另一个核酸分子形成完全的碱基配对结构时才能与其杂交。即使一个错配也不能杂交。,2）液相杂交技术,在微量滴定板的孔中进行。每孔含有不同的寡核苷酸探针。这个探针的两个末端可以形成碱基配对，并且两个末端分别用荧光染料和猝灭复合物标记。探针两个末端配对时，荧光信号被猝灭。当探针与靶DNA杂交时，两个末端被分开，从而使荧光染料发出信号。末端的两个标记被称为“分子灯塔”。,几种分子标记特点的比较标记类型带型等位基因数稳定性技术难度费用RFLP共显性中高难高SSLP共显性多高易低SNP共显性中高易高,2遗传学图谱2.3遗传作图的方法,遗传作图(Geneticmapping)即遗传图谱的构建。它是利用遗传学的原理和方法，构建能反映基因组中遗传标记之间遗传关系的图谱。因此，遗传作图中“遗传”二字，既是手段，也是目的。,孟德尔遗传定律,等位基因随机分离如果亲本的等位基因是A和a，那么F1代的成员得到A或a的概率相等。非等位基因自由组合基因A的等位基因遗传与基因B的等位基因遗传相互独立。,2遗传学图谱2.3遗传作图的方法,连锁与部分连锁,20世纪初遗传学家认识到基因位于染色体上，同一染色体上的两个基因理论上应该共同传递给下一代。但事实上同一染色体上的完全连锁的想象只有极少数。大多数的基因是部分连锁的。摩尔根用减数分裂时染色体的行为解释了同一染色体上的基因部分连锁的现象。,2遗传学图谱2.3遗传作图的方法,部分连锁的原因是基因之间发生了交换,从摩尔根时代开始，连锁（linkage）分析便成为遗传分析的重要手段，更是遗传作图的基础。遗传标记之间的遗传关系主要是通过连锁关系来反映。而连锁关系是通过重组率（percentageofrecombinants）来反映的。重组型配子数重组率(%)=x100配子总数,1905年创立了连锁分析，为遗传作图奠定了实验基础。,2遗传学图谱2.3遗传作图的方法,假设交换是随机发生的，一对并列的染色单体上任何两点发生交换的机会是均等的；两个彼此靠近的基因之间因交换而分离的的几率要比互相远离的2个基因之间发生分离的几率要小。因此重组率可以成为测量两个基因之间相对距离的尺度。计算出不同基因间的重组率，就可以构建出显示基因在染色体上相对位置的图。,2遗传学图谱2.3遗传作图的方法,遗传作图的理论基础,传统遗传图,传统遗传图中的遗传标记主要是形态学标记。形态学标记的数量不多，但利用形态学标记作图的时间很长，在二十世的前八十年主要是利用形态学标记作图。,果蝇的突变体:,根据连锁分析的结果，借助重组率可以绘制遗传图谱，确定遗传标记之间的遗传距离和排列顺序，形成比较完整的连锁群，并由各连锁群构成基因组的遗传图谱。连锁分析给出的遗传标记在染色体上的相对位置是相当准确的，也提供了基因间的大致距离，他们为基因组测序提供了工作框架。,图谱构建,2遗传学图谱2.3遗传作图的方法,遗传图的偏离与造成遗传图偏离的原因,重组热点（recombinationhotspot):染色体上某些比其他位点有更高交换频率的位点。近端粒区和远着丝粒区有较高重组率。性别之间也表现重组率的差异。双交换的出现，产生距离减少的假象。,不同模式生物的连锁分析方法,有性杂交实验：可进行遗传学实验的材料，如老鼠、果蝇、水稻等。谱系分析：不能进行遗传实验的材料，如人类、多年生树木。DNA转移：不发生减数分裂的生物，如细菌、酵母。,有性杂交实验,有性杂交实验的标准方法测交分析（testcross)一个亲本为双杂合子，另一个亲本为双纯合子。所以测交便于分析子代个体基因型的分离比。AB/abab/ab,ab,AB,Ab,aB,ab,ab,ab,ab,F1基因型,表型,ABab,AB,Abab,Ab,aBab,aB,abab,ab,两点杂交确定两个位点是否连锁。多点杂交确定多个位点的相对位置与排序。,遗传图绘制-分子标记的等位型式,遗传图绘制-F2基因型分析,作图群体（mappingpopulation）是指用于遗传作图的分离群体，如F2、BC1、DH、RI等。无论是传统的遗传作图，还是现代的分子遗传图谱的构建，都需要有作图群体。,作图群体的基本要求：群体要足够大；群体随机分离；双亲间的多态性高。,2遗传学图谱2.3遗传作图的方法,根据需要与可能，选择合适的分子标记,对亲本和作图群体进行标记基因型的分析,为构建遗传图谱收集必要的数据。,分子标记分析,2遗传学图谱2.3遗传作图的方法,作图群体是通过两个亲本杂交发展而来的，因此在发展和利用作图群体之前，通常首先要了解双亲之间的多态性。亲本间的亲缘距离与多态性程度的关系:亲本间的多态性程度与亲缘关系的距离存在着正相关，因此在发展作图群体时，应尽量扩大亲本的亲缘关系，以便获得较高的多态性程度。,2遗传学图谱2.3遗传作图的方法,亲本分析,限制性内切酶与多态性程度也存在一定的关系。识别位点的碱基数与多态性程度的关系，识别位点的碱基数越多，产生的片段越长，片段长度的多态性就越高。因此，通常6-bp识别位点的限制性内切酶比4-bp识别位点的限制性内切酶产生更高程度的多态性。相同碱基数识别位点的限制性内切酶在多态性上也存在一定程度的差异，因此可以通过试验来选择使用。,限制性内切酶与多态性程度的关系:,亲本分析,为了减少作图群体的分析中分子标记利用的盲目性，在分析作图群体之前，首先需要对亲本的多态性进行分析。其目的包括：筛选出具有多态性的分子标记；在RFLP分析中，还要筛选出产生多态性的酶，找出具有多态性的标记/酶组合；了解具有多态性的标记在图谱中的分布，分子标记在图谱中的分布应合理，适合作连锁分析。如果使用的是新的标记，应考虑在作图群体能用的标记的数量是否足够。,亲本间多态性的分析:,作图群体的确定:作图群体应足够大，以减少试验误差，提高精确度。作图群体在分子标记分析过程中应保持不变。多态标记的筛选:根据亲本分析的结果，选择具有多态性的分子标记。在RFLP组合中，确定标记/酶组合。,作图群体的分子标记分析:以双亲为对照。利用选择的分子标记，逐一对作图群体进行分析。作图群体中，分子标记的带型应出现重组。观察带型重组的情况，并做记录。,数据库的建立:把基因型重组的结果数字化，按作图的要求，整理数据，建立计算机文件。,“作图者”(Mapmaker)是Lander等（1987）设计的,是专门用于遗传作图的软件。,Mapmaker软件的利用,2遗传学图谱2.3遗传图谱的构建,准备资料（preparedata）：如果是F2群体的资料，阅读资料后，屏幕上将出现：datatypef2intercross1463620symbols1=A2=H3=B0=-（个体数座位数QT数）其中：1=A亲本A的纯合基因型（aa）2=H杂合基因型（ab）3=B亲本B的纯合基因型（bb）4=C非亲本A纯合基因型（ab，bb）5=D非亲本B纯合基因型（aa，ab）0=-缺资料,2遗传学图谱2.3遗传图谱的构建,通过两点分析，计算各座位之间的连锁关系，并把基因座位划分为若干个连锁群。屏幕上将出现：group1：141235group2：271842通过设置LOD值，可以改变连锁群的数目。LOD值增大，连锁群的数目也会增大。LOD值3.0时，其分群的可靠性较大。当座位数足够大时，连锁群的数目与单倍体的染色体数目相同。,分群（group）：,排序（sequence）：通过多点分析，可以计算出在同一连锁群内不同排列顺序下，各座位之间的距离和连锁群的总长度。,2遗传学图谱2.3遗传图谱的构建,比较（compare）：通过比较同一连锁群内不同排列顺序的作图结果，找出log-likelihood（对数似然值）为最大的排列方式为最合理的排列方式。,作图（map）：显示最后的作图结果。,2遗传学图谱2.3遗传图谱的构建,图谱分析标记总数：图谱上包含的标记（座位）总数。图谱长度（单位：centi-Morgan，cM）：各连锁群的长度；基因组的总长度。标记密度（座位/cM）：分子标记的平均距离。当分子标记的密度足够大时，通常称为高密度图谱。标记分布的均匀程度：遗传图谱上希望分子标记的分布比较均匀，不要出现距离较大的间隙（gap）。,2遗传学图谱2.3遗传图