★细胞生物学论文摘要范文细胞生物学论文摘要写

细胞生物学论文摘要范文细胞生物学论文摘要写 细胞生物学是当代生命科学的基础学科,也是发展迅猛的前沿学科之一.为了促进学生的实践动手能力和实践创新能力,配合细胞生物学理论课教学改革的不断深化,细胞生物学实验教学改革已是大势所趋.该教研组经过多年的探索,从教学体系、教学内容和教学手段等方面对细胞生物学实验教学进行了改革,旨在充分调动学生学习的主动性和积极性,培养学生的独立思考、综合运用知识和科研创新的能力. 以问题为基础的学习(problem-based learning,PBL)的教学方法是一种国际上广泛认同和有效的医学课程模式,它将问题作为教学的基本因素,使学生在不断的提出问题和解决问题中完成教学内容的学习,这种方法在培养学生分析问题和解决问题的能力、养成终生学习习惯方面具有极大的促进作用.该文介绍了一种新的基于医学细胞生物学课程特点的PBL教学模式,它是包括病例模式、微型病例模式、核心问题模式的多元化教学模式.文章从教学框架构建、教材及病例编写、课堂教学组织、教学效果评价等多个环节进行了全方位介绍和探讨,为细胞生物学教学水平的整体提升提供了新的思路. 目的 肺癌是全球范围内发病率和死亡率高居第一位的恶性肿瘤.细胞生物学行为的改变是肺癌发生和发展的重要原因.TC-1蛋白在多种肿瘤组织中异常高表达,并且与肿瘤的细胞生物学行为密切相关,但是,其在肺癌中的作用尚不明确.本课题旨在研究TC-1在非小细胞肺癌中的表达及其与非小细胞肺癌细胞生物学行为的相关性,并探寻其作用机制,为肺癌的研究提供新靶点,开辟新途径. 方法 （1）收集122例临床非小细胞肺癌病人的癌组织标本及相应的正常肺组织,以及临床病理信息.应用免疫组化技术检测TC-1及Ki-67在肺癌组织及相应正常肺组织中的表达.分析肺癌组织与正常肺组织间TC-1表达的差异；按年龄、性别、病理类型、TNM分期、区域淋巴结转移及细胞增殖状态进行分组,分析TC-1表达与上述临床病理特征的关系. （2）体外构建人TC-1过度表达慢病毒及人TC-1干扰表达慢病毒,并分别转染NCI-H520细胞及A549细胞,通过筛选建立稳定的TC-1过度表达细胞及TC-1干扰表达细胞.为进一步研究TC-1对非小细胞肺癌细胞生物学行为的影响：采用MTT、平板克隆形成实验检测TC-1对非小细胞肺癌细胞增殖能力的影响；采用流式细胞技术检测TC-1对非小细胞肺癌细胞周期的影响；采用流式细胞技术检测TC-1对非小细胞肺癌细胞凋亡能力的影响；采用transwell小室迁移实验检测TC-1对非小细胞肺癌细胞迁移能力的影响；采用transwell小室侵袭实验检测TC-1对非小细胞肺癌细胞侵袭能力的影响；采用体内成瘤实验以及免疫组化技术检测TC-1对非小细胞肺癌细胞体内增殖能力的影响. （3）采用FGFR2信号通路抑制剂PD173074阻断A549细胞及NCI-H520-pLenti-TC-1细胞的FGFR2信号通路,采用荧光定量PCR及WesternBlotting技术检测TC-1的表达.为进一步研究阻断FGFR2信号通路对非小细胞肺癌细胞生物学行为的影响：采用MTT、平板克隆形成实验检测阻断FGFR2信号通路对非小细胞肺癌细胞增殖能力的影响；采用流式细胞技术检测阻断FGFR2信号通路对非小细胞肺癌细胞周期的影响；采用流式细胞技术检测阻断FGFR2信号通路对非小细胞肺癌细胞凋亡能力的影响；采用transwell小室迁移实验检测阻断FGFR2信号通路对非小细胞肺癌细胞迁移能力的影响；采用transwell小室侵袭实验检测阻断FGFR2信号通路对非小细胞肺癌细胞侵袭能力的影响；采用体内FGFR2信号通路分析实验检测阻断FGFR2信号通路对非小细胞肺癌细胞体内增殖能力及化疗敏感性的影响. （4）采用Western Blotting技术检测A549,A549-pLenti-shRNA1及NCI-H520,NCI-H520-pLenti-TC-1细胞中Wnt/-catenin信号通路下游分子（CD1、c-Myc、c-Met）及Caspase-3的表达. 结果 （1）免疫组化分析结果显示：TC-1在肺癌组织中的表达主要定位于阳性细胞细胞质内,呈局灶性或弥漫性表达,其表达率为73.77%（90/122）；在支气管肺泡上皮细胞中呈低表达或阴性表达；TC-1表达在不同性别、年龄以及病理类型之间无明显统计差异（P,0.05）,但与TNM分期以及区域淋巴结转移密切相关（P,0.05）.在TNM分期中,I期患者TC-1的阳性表达率为47.62%（10/21）,II其患者TC-1表达阳性率为72.34%（34/47）,III期患者阳性表达率为85.19%（46/54）.TC-1在N0患者中的阳性表达率为46.15%（12/26）,在N1患者中的阳性表达率为73.47%（36/49）,在N2患者中的阳性表达率为89.36%（42/47）.以Ki阳性指数将患者分为高增殖组（Ki-67labelling index10%）和低增殖组（Ki-67labelling inde10%）,在高增殖组中,TC-1阳性表达率为95.29%（81/85）,在低增殖组中,TC-1阳性表达率为24.32%（9/37）,两组之间统计学差异明显（P,15%elongation)则促进平滑肌细胞的增殖、迁移、凋亡等功能,诱导正常的血管结构改变和功能失调.近年来国内外学者对机械牵张力调控平滑肌细胞生物学功能的分子机制做了深入研究,认为细胞表面具有力学信号感受作用的各种分子可以将胞外的机械信号转化为胞内的化学信号,通过激活一系列的信号通路和转录因子,调节各种基因的表达,从而诱导细胞生物学功能改变.但是目前对这一机械信号转导过程中的诸多机制尚不清楚,比如细胞表面是否存在特异性的力学信号感受分子,细胞内各信号分子之间的相互作用模式,以及在转录水平之外的基因表达调节机制等.进一步深入了解牵张力调节细胞功能的分子机制,对于寻找新的高血压、冠心病等心血管疾病干预靶点具有重要的意义. microRNAs(miRNAs)是一类内源性的非编码小RNA分子,通过抑制靶基因的翻译或促进nRNA的降解在转录后水平负调控基因表达.研究证实,miRNAs在心血管系统的正常发育以及多种病理过程中发挥重要的调节作用.最近的研究发现,miRNAs也参与机械生物力调节血管细胞的生物学效应,与静止培养相比,剪切力诱导多个内皮细胞niRNAs表达改变,其中miR-19a与niR-23b在剪切力调控细胞周期中发挥关键作用,miR-92a介导剪切力对内皮细胞NO的水平的调控.但是关于牵张力对血管细胞miRNAs表达的影响,以及后者在牵张力介导的细胞生物学功能中的作用目前还不清楚.miR-21是近年广泛研究的一种miRNA,其在多种实体肿瘤细胞中表达升高,具有显著的促进细胞增殖、抑制细胞凋亡作用.此外,miR-21在血管细胞中也有丰富表达,并且在损伤血管中表达上调,促进新生内膜的形成.新近的研究发现,miR-21在内皮细胞中的表达受到剪切力的调节,并且不同形式的剪切力对miR-21表达的影响是不同的,miR-21分别在剪切力介导的内皮炎症、NO生成中发挥重要调控作用.miR-21在血管平滑肌细胞中的表达丰度明显高于内皮细胞中,鉴于miR-21在细胞增殖、凋亡调节中的作用以及机械牵张力对平滑肌细胞生物学功能的影响,我们推测牵张力可能通过调节miR-21在血管平滑肌细胞中的水平影响细胞功能.目前对miRNAs的研究多集中在其生物学效应方面,而对miRNAs本身的表达调控机制知之甚少,miR-21基因位于蛋白编码基因之间,具有独立的启动子区域,研究发现AP-1,NF-B等转录因子可能参与miR-21表达调控,但是在牵张力的作用下,参与调节miR-21表达的转录因子尚不明确.深入了解miRNAs的表达调控机制有利于系统的认识牵张力调节血管平滑肌细胞功能的分子机制,因此,在本研究中我们也初步探讨牵张力调节miR-21表达的上游分子机制. 研究目的 1.在体外细胞水平,明确牵张力对血管平滑肌细胞miR-21表达的影响. 2.明确miR-21在牵张力介导的血管平滑肌细胞增殖与凋亡中的作用. 3.明确牵张力调节血管平滑肌细胞miR-21表达的分子机制. 研究方法1.入主动脉平滑肌细胞(HA*Cs)培养 HA*Cs细胞株购自美国ScienCell公司,细胞生长至完全融合后,吸去培养基,用PBS冲洗细胞一遍以去除残留的血清,然后加入适量预热的0.25%胰蛋白酶,在显微镜下观察到细胞细胞变圆后,吸去胰酶,加入新的平滑肌细胞完全培养基吹打均匀,转入新的细胞培养瓶放入含5%CO2的37细胞培养箱中继续培养. 2.机械牵张力干预体外培养的HA*Cs 接种HA*Cs至铺有型鼠尾胶原的Flexcell6孔板中(105细胞/孔),待细胞生长至80%90%融合时,利用无血清培养基诱导培养24小时后,更换新的完全培养基或无血清培养基,使用Flexcell-5000细胞牵张力仪给予HA*Cs不同强度的牵张力刺激,分组如下： (1)10%牵张力组：分别给予最大牵拉强度为10%,频率为1Hz的周期性牵张力分别刺激细胞0、3、6、12、24小时. (2)16%牵张力组：分别给予最大牵拉强度为16%,频率为1Hz的周期性牵张力分别刺激细胞0、3、6、12、24小时. 3.实时荧光定量PCR检测miR-21表达水平 使用Invitrogen公司的Trizol提取包含miRNAs的HA*Cs总RNA,利用丹麦Exiqon公司的miRNAs cDNA合成试剂盒和miRNAs SYRB Green Master Mix试剂盒分别进行逆转录和实时荧光定量PCR反应,小RNA U6作为各样本miR-21表达水平的内参照,每组样本重复检测4次.U6及miR-21PCR引物均购自Exiqon公司. 4.细胞转染 利用Invitrogen公司的Lipofectamine2000分别转染不同浓度的miR-21inhibitor和mimics,调节HA*Cs miR-21的表达水平,化学修饰的miR-21inhibitor和mimics均由上海吉玛公司合成,转染PDCD4表达质粒上调HA*Cs PDCD4蛋白水平.转染细胞48小时后,给予细胞牵张力刺激,观察相应的细胞功能或目的蛋白水平变化. 5.HA*Cs增殖检测 牵张力干预体外培养的HA*Cs12小时,利用美国罗氏公司的BrdU细胞增殖检测试剂盒或细胞计数仪检测牵张力对HA*Cs增殖的影响；转染miR-21inhibitor或nimics48小时后,再给予牵张力干预12小时后,BrdU掺入法和细胞计数法检测HA*Cs增殖水平,明确miR-21在牵张力介导的HA*Cs增殖中的作用. 6. Western blot 牵张力刺激HA*Cs结束后,提取胞浆蛋白,测定蛋白浓度后加蛋白上样缓冲液煮沸5分钟.取1520ug蛋白进行SDS-PAGE电泳,利用Western blot分别检测p27,p-Rb,以及PDCD4蛋白表达.每个样本重复检测4次,(3-actin作为内参. 7.细胞凋亡检测 8.实时荧光定量PCR测定pri-miR-21、pre-miR-21、PDCD4mRNA水平牵张力刺激HA*Cs结束后,利用Trizol提取细胞总RNA.使用日本TaKaRa公司的cDNA合成试剂盒将样本总RNA逆转录为cDNA,然后利用TaKaRa公司的SYBR Green实时定量PCR试剂盒进行PCR反应.PCR引物由上海吉玛公司合成.PCR反应结束后得到Ct值,并计算2-Ct,-actin作为pri-miR-21、pre-miR-21、 PDCD4mRNA表达水平的内参. 9.细胞免疫荧光 16%牵张力刺激体外培养的HA*Cs3小时后,利用免疫荧光方法观察c-fos、 c-jun的表达变化.牵张力刺激细胞结束后,免疫染色固定液固定30分钟,PBS冲洗后力()0.1%TritonX-100室温下孵育8分钟,继之用5%BSA封闭30分钟,经PBS冲洗后4条件下分别孵育c-fos, c-jun抗体(Cell Signaling Technology,1:200)过夜,次日,经过荧光二抗孵育1小时,DAPI染核后,在激光共聚焦显微镜下,观察目的蛋白的表达水平. 10.凝胶迁移实验(EMSA) 利用EMSA方法检测16%牵张力对转录因子AP-1与NF-B活性的影响.牵张力干预平滑肌细胞结束后,利用Pierce细胞核蛋白提取试剂盒收集细胞核蛋白,并利用BCA方法检测核蛋白的浓度.使用T4连接酶在AP-1与NF-B双链核苷酸探针末端标记-32PATP,取8ug核蛋白与标记的转录因子探针及试剂盒其它成分共计20ul预混后,冰上孵育30分钟,然后用4%非变性胶进行电泳,根据Pierce EMSA试剂盒说明书操作具体步骤. 11.统计学分析 所有数据以均数,标准误表示,使用SPSS13.0统计学软件进行数据分析,两组之间的比较采用非配对t检验,多组之间的比较采单因素方差分析,p0.05认为有统计学意义. 结果 1.机械牵张力对体外培养的人主动脉平滑肌细胞(HA*Cs) miR-21表达水平的影响 研究结果显示,在无血清条件下,与静止培养的细胞相比,16%牵张力自6小时开始显著上调体外培养的HA*Cs miR-21的表达水平,上调趋势保持到24小时,表达高峰在12小时(p0.01)；而10%牵张力对HA*Cs miR-21的表达水平没有显著影响(p0.05).在有血清刺激的条件下,16%牵张力仍然持续上调miR-21的表达(p0.01),但上调幅度没有无血清条件下明显；而10%牵张力明显抑制miR-21的表达,与静止对照相比,miR-21的表达6小时开始显著下调(p0.05),12小时下调最明显. 2.miR-21在机械牵张力调控人主动脉平滑肌细胞增殖中的作用 利用BrdU掺入法与细胞计数的方法检测miR-21在牵张力调节的HA*Cs增殖中的作用.实验结果显示,与静止培养的细胞相比16%牵张力显著增强HA*Cs的增殖水平；转染miR-21抑制物(inhibitor)抑制miR-21的水平,结果与miRNA阴性对照inhibitor相比,miR-21的表达水平下调42倍(p0.01),而转染miR-21inhibitor的HA*Cs增殖水平显著下降(p0.01).同样的实验条件下,利用胰酶消化的方法收集细胞后进行细胞计数,结果显示与BrdU掺入法一致(p0.05).由于在含血清条件下,10%牵张力抑制miR-21的表达,转染化学修饰的miR-21类似物(mimics)上调miR-21的表达水平,结果显示miR-21mimics升高miR-21的表达70倍(p0.01)；而BrdU掺入法结果显示,与静止培养的HA*Cs相比,10%牵张力显著抑制细胞的增殖水平(p0.01),而转染miR-21mimics显著降低10%牵张力对HA*Cs增殖的抑制作用(p0.05). Western blot结果显示16%牵张力抑制细胞周期抑制因子p27的表达,促进p-Rb的表达(p0.01)；而与转染miRNA阴性对照inhibitor相比,miR-21inhibitor部分逆转16%牵张力对p27,p-Rb表达的影响(p,0.01). 3.miR-21在机械牵张力介导的人主动脉平滑肌细胞凋亡中的作用 利用Annexin-FITC与PI双染细胞凋亡试剂盒检测牵张力对细胞凋亡的影响,结果显示：与静止对照组比较,16%牵张力增加体外培养的HA*Cs凋亡水平(9.19,0.66vs1.30,0.12,p0.01)；转染miR-21inhibitor抑制miR-21的水平,结果显示与阴性对照miRNA inhibitor相比较,miR-21inhibitor显著增强了16%牵张力对HA*Cs的促凋亡作用(25.5,1.61vs9.38,1.57,p0.01)；在静止培养的HA*Cs中,转染miR-21inhibitor对细胞凋亡没有显著的影响.在有血清条件下,对静止对照组相比较,10%牵张力对HA*Cs的凋亡没有显著影响(p0.05). 4.PDCD4在16%牵张力介导的人主动脉平滑肌细胞凋亡中的作用 利用T*ARA cDNA合成与SYBR Green PCR定量试剂盒检测16%牵张力对HA*Cs PDCD mRNA水平的影响,结果显示：与静止对照组相比,16%牵张力增加PDCD的mRNA水平1.98倍(p05),而Western blot结果显示,16%牵张力显著抑制PDCD的蛋白水平0.55倍(p0.05).转染miR-21inhibitor后,16%牵张力对HA*Cs PDCD4蛋白水平的抑制作用明显减轻(p0.05).为明确PDCD4在牵张力诱导的HA*Cs凋亡中的作用,转染PDCD4表达质粒上调其蛋白表达水平,再给予16%牵张力刺激,细胞流式结果显示,转染PDCD4表达质粒明显促进16%牵张力的诱导细胞凋亡作用(p0.01). 5.16%牵张力对人主动脉平滑肌细胞AP-1、NF-B活性的影响 利用实时荧光定量PCR的方法检测16%牵张力对HA*Cs miR-21转录初级产物pri-miR-21,前体pre-miR-21水平的影响,结果显示对静止对照相比,16%牵张力分别增加pri-miR-21水平1.73倍(p0.05),pre-miR-21水平2.85倍(p0.01).AP-1、NF-B是介导机械牵张力调控平滑肌细胞生物学功能的重要转录因子,在特定条件下也参与miR-21的表达调控. Western blot结果显示,16%牵张力明显增加NF-B p65的磷酸化水平,高峰在牵张力干预后1、3小时,至6小时恢复至静止对照水平,而16%牵张力对NF-Bp65的蛋白水平没有显著影响；16%牵张力持续引起c-jun勺表达水平和磷酸化水平显著增高,但对c-fos蛋白的表达水平及磷酸化水平没有明显影响.细胞免疫荧光结果显示,16%牵张力增加c-jun在细胞核中的表达,而增加c-fos在胞浆中的表达,c-fos在胞核中的表达没有显著变化.EMSA结果显示,16%牵张力显著增加HA*Cs AP-1与NF-B的活性(p0.05). 6.AP-1、NF-B在16%牵张力诱导HA*Cs miR-21表达中的作用 利用Lipo2000转染c-jun siRNA下调HA*Cs c-jun的表达,16%牵张力干预HA*Cs前1小时,加入NF-B抑制剂SN50抑制其活性(p0.01).结果显示,c-jun siRNA明显抑制HA*Cs中c-jun的表达,16%牵张力诱导的AP-1活性显著下降(p0.01).实时荧光定量PCR结果显示,c-jun siRNA抑制16%牵张力诱导的miR-21表达(p0.01),而SN50对16%牵张力诱导的miR-21表达没有明显作用(p0.05). 结论 1.16%机械牵张力上调人主动脉平滑肌细胞miR-21的表达,而在有血清条件下,10%牵张力抑制miR-21的表达水平. 2.miR-21参与介导机械牵张力调节人主动脉平滑肌细胞增殖与凋亡的作用. 3.机械牵张力通过增强转录因子AP-1(c-jun)的活性上调人主动脉平滑肌细胞miR-21表达. 研究背景 血管平滑肌细胞(V*Cs)具有较强的可塑性,具有收缩和分泌功能.在正常生理状态下,V*Cs处于静息状态,表达一系列分化成熟的血管平滑肌细胞特有的收缩蛋白分子,呈收缩表型,而当血管受到病理 _时,分化成熟的V*Cs增殖、迁移能力增强,并分泌多种细胞因子与细胞外基质,不表达或低表达收缩表型V*Cs所特有的蛋白分子,由收缩表型变为分泌表型,这一过程称为V*Cs表型转换.V*Cs表型转换在高血压、冠心病等增殖性血管疾病病理机制中发挥重要作用,然而目前对V*Cs表型转换的分子机制还不十分清楚. microRNAs (miRNAs)是一类内源性非编码小RNA分子,通过与其靶基因mRNAs3,非编码端结合,抑制翻译或促进靶基因mRNA降解,在转录后水平调节基因表达.新近的多项研究证实,血管平滑肌细胞中含有丰富的niRNAs表达,在平滑肌细胞生物学功能调节中发挥重要作用,其中miR-145/143、miR-21、 miR-26a等miRNAs分子被证实与血管平滑肌细胞表型转换密切相关.由于上述结果主要动物实验,并且miRNAs分子的表达及生物学作用具有一定的组织特异性,miRNAs在人大动脉血管平滑肌细胞表型转换中的作用还不十分清楚. 血管一直暴露于搏动性血流的冲击下,由血流产生的机械生物力学在维持血管的正常形态与功能,以及病理性血管重构中发挥重要调节作用.位于血管中层的平滑肌细胞主要受牵张力的影响,后者通过作用于V*Cs表面的力学信号感受分子,引起细胞骨架蛋白的重构,引起细胞形态以及增殖、凋亡、迁移、表型转换等生物学功能的改变.最近的研究发现,miRNAs也参与调节机械生物力学介导的细胞生物学作用.在剪切力的作用下,体外培养的血管内皮细胞miRNA表达谱发生显著变化,表达差异的多个niRNAs分子在内皮细胞周期、凋亡以及炎症反应中发挥重要调节作用；机械牵张力通过上调miR-26a表达,诱导人气道平滑肌细胞肥大.基于机械牵张力以及niRNAs在调节血管平滑肌细胞生物学功能中的作用研究,我们推测牵张力可能通过调节miRNAs的表达影响V*Cs表型转换.在本研究中,我们首先利用miRNA芯片对比分析了牵张力干预的人主动脉平滑肌细胞(HA*Cs)与静止培养的HA*Cs miRNA表达谱,发现miR-21、miR-145、miR-221等几个与V*Cs表型转换密切相关的miRNA分子表达发生改变,高度提示miRNAs可能是牵张力介导的平滑肌细胞表型转换中的重要调节因子,因此我们进一步分析了上述miRNA分子在牵张力介导的细胞表型转换中的作用. 随着对miRNAs生物学功能的研究深入,目前认识到miRNAs作为复杂的基因表达调控网络中的一个环节,其本身的表达调控亦受到各种刺激因素精细的调节.机械牵张力能够激活平滑肌细胞中的多条信号转导通路和转录因子,影响细胞增殖、分化等密切相关的一系列基因的表达.在人类基因组中,有约一半的miRNA基因具有独立的启动子区域,受到各种转录因子及信号通路的影响,那么参与介导牵张力调控平滑肌细胞表型转换的miRNA分子的表达是如何调节的这一问题也将是本研究的重点. 研究目的 (1)明确机械牵张力对人主动脉平滑肌细胞miRNAs表达谱的影响. (2)明确miR-145在牵张力诱导的平滑肌细胞表型转化中的作用. (3)探讨牵张力调节人主动脉平滑肌细胞miR-145表达的分子机制. 研究方法 1.血管平滑肌细胞培养及牵张力干预 人主动脉平滑肌细胞(HA*Cs)及平滑肌细胞培养基均购自美国ScienCell公司,4-7代平滑肌细胞用于实验.按105细胞孔密度接种平滑肌细胞至铺有型鼠尾胶原的Flexcell6孔板中,细胞生长融合至80%-90%时,更换无血清培养基诱导培养24小时,然后重新更换新的无血清培养基,利用电脑控制的Flexcell-5000Tension装置给予体外培养平滑肌细胞牵张力刺激(16%elongation,1Hz).药理学信号通路抑制剂在牵张力刺激细胞1小时前,加入细胞培养基中. 2.miRNA芯片检测 体外培养的HA*Cs经16%牵张力刺激12小时后,与静止对照组一起,收集细胞TRIzol法抽提含miRNAs的总RNA,利用芯片技术筛查表达差异的miRNAs分子.总RNA的质检、荧光探针的标记、芯片杂交以及数据分析,由上海康成生物公司完成,使用的芯片为Exiqon公司miRNA表达谱芯片,牵张力组与对照组各送检3个样本. 3.实时荧光定量PCR验证miRNA芯片筛查的miRNAs分子 干预细胞结束后TRIzol法提取总RNA,检测RNA浓度及A260/280比值后,利用Exiqon公司的通用型miRNA cDNA合成试剂盒进行逆转录反应,然后利用Exiqon公司的niRNA引物及SYBR Green PCR定量试剂盒进行PCR反应,反应结束后得到Ct值,计算2-Ct,U6作为引物,具体步骤及反应条件根据试剂盒说明书操作. 4.Western blot测*C收缩表型分子的蛋白表达水平 细胞干预结束后,裂解细胞分别抽提胞浆、胞核蛋白,BCA法检测蛋白浓度.蛋白样品加入适量loading buffer,煮沸冷却后进行SDS-PAGE电泳,依次转膜、5%奶粉封闭,一抗过夜孵育、1,TBST洗膜、二抗孵育1小时、1,TBST洗膜后,利用Millpore增强型ECL化学发光液显影,拍照后利用Photoshop CS3软件分析目的蛋白的表达水平,-actin作为蛋白上样内参照.5.实时荧光定量PCR检测平滑肌细胞收缩表型蛋白Marker的mRNA水平 HA*Cs经牵张力刺激后,提取细胞总RNA,使用T*ARA逆转录试剂盒将RNA样本逆转录为cDNA,然后使用T*ARA SYBR Green PCR试剂盒进行实时荧光定量PCR反应,所用的目的基因引物由上海吉玛生物公司合成.反应体系与反应条件根据试剂盒说明操作,反应结束后得到Ct值,计算2-ct,GAPDH作为内参. 6.细胞转染 细胞生长密度至70%-80%时,利用Lipo2000分别转染miRNA inhibitor或mimics,调节miRNAs分子的表达水平,细胞转染后48小时,然后给予牵张力刺激,明确参与介导牵张力调节平滑肌细胞表型转化中的niRNAs.实验所用的miRNA inhibitor或mimics由上海吉玛公司合成. 7.统计学分析 所用数据以均数,标准误(mean,SEM)表示,使用SPSS13.0统计学软件进行数据分析,多组之间的比较采用单因素方差分析,两组之间的比较采用t检验,p0.05被认为有统计学意义. 结果 1miRNA芯片结果显示,与静止对照组相比,16%牵张力显著改变体外培养的HA*Cs中多个miRNA分子的表达(p0.05),包括let-7c、miR-200c、 miR-21、miR-221、miR-145等,其中miR-21、miR-221、miR-145等几个miRNA分子被证实与平滑肌细胞的表型转化有关. 2.实时荧光定量PCR结果显示,与静止对照相比,16%牵张力上调miR-21的表达,抑制miR-145、miR-221的表达,与芯片结果一致(p0.05),而对另外一与平滑肌细胞表型调节密切相关的miR-143的表达没有显著影响(p0.05). 3Western blot结果显示,与静止对照组相比较,16%牵张力明显下调HA*Cs *-actin、*22以及Calponin的蛋白水平,其中对*-actin与Calponin蛋白水平的抑制最显著(p0.05).调节平滑肌细胞表型转化的关键转录因子SRF与Myocardin的蛋白水平也显著下降(p0.05). 4.转染miR-21inhibitor的HA*Cs,经过12小时的16%牵张力刺激后,与转染阴性对照miRNA inhibitor相比较,*-actin、*22以及Calponin的蛋白水平没有显著变化(p0.05), 转染miR-221mimics,对16%牵张力诱导的上述平滑肌细胞收缩表型蛋白分子亦没有显著影响(p0.05),在静止条件下,分别转染miR-221inhibitor和mimics, *-actin、*22a以及Calponin的蛋白水平也没有显著变化(p0.05)；转染miR-145mimics,WB结果显示部分逆转16%牵张力对*-actin、*22、Calponin蛋白水平的抑制(p0.05). 5.实时定量PCR结果显示,与静止对照相比,16%牵张力明显下调*-actin、*22以及Calponin的mRNA水平(p0.01),miR-145mimics明显抑制16%牵张力对上述分子mRNA表达的下调效应(p0.05). 6.16%牵张力对KLF4mRNA的表达水平没有显著影响,但上调KLF4的蛋白表达水平(p0.05).转染miR-145mimics,显著抑制16%牵张力诱导的KLF4蛋白表达上调(p0.05),几乎完全逆转16%牵张力对Myocardin蛋白水平的抑制(p0.01),但对SRF的蛋白水平没有明显影响(p0.05). 7.PCR结果证 骨肉瘤(Osteosara)是起源于间胚叶组织的最常见的原发性恶性骨肿瘤,其生物学性状极为复杂,有关其发病机理仍未完全清楚,诊断和治疗的方法依然有限.现代医学认为,肿瘤的发生是一个多阶段、多因素和多基因综合作用的过程,其生物学本质是细胞内遗传调控和表观遗传调控的紊乱与失调.近年来以不基于基因序列改变为特征的表观遗传调控在肿瘤发生中的作用备受关注,其主要表现形式是DNA*化,它可以直接导致相关基因的表观遗传转录沉默.基因DNA*化有助于肿瘤发生的早期预测及预后评估.癌基因的低*化、抑癌基因的高*化和整体基因组的低*化是DNA*化失衡状态的三种经典现象,其中尤以抑癌基因的高*化与肿瘤的关系最为密切,它是抑癌基因转录失活的主要途径,甚至可能成为调控基因转录的唯一的机制. PTEN是迄今为止发现的第一个具有双特异性磷酸酶活性的抑癌基因,是抑癌基因家族中继P53发现后在人类肿瘤中突变及缺失率最高的又一明星分子.PTEN具有抑制肿瘤生长、促进细胞凋亡及抑制血管生成等作用,能负性调控PI3K/*t及抑制MAPK的信号转导通路对肿瘤产生影响.已有研究表明在很多人类恶性肿瘤中都存在PTEN的异常*化,但关于其与骨肉瘤的关系却鲜见报道.了解骨肉瘤中PTEN的*化状态,对寻找骨肉瘤早期诊断可能的分子标志物具有重要的临床意义. 由于DNA*化不涉及DNA序列改变,因此,它是一个可逆的表观遗传学修饰过程.任何一个基因的*化状态是一个*化和去*化的动态平衡过程,处于*化异常的抑癌基因对阻断其DNA*化的药物非常敏感,临床上可利用这种敏感性进行基因治疗.5-Aza-CdR是已被美国FDA批准应用于骨髓增殖异常综合征及急性粒细胞白血病临床治疗的去*化药物,它能在体内外激发DNA的去*化过程,导致被*化沉默的抑癌基因持续激活.目前已有5-Aza-CdR作用于乳腺癌、非小细胞肺癌及前列腺癌等肿瘤的相关研究,但其与骨肉瘤的关系的研究却还是空白.因此,探讨5-Aza-CdR对肿瘤的去*化作用机制对防治骨肉瘤亦具有重要的临床意义. 本研究分成三个部分.第一部分,通过MSP技术检测骨肉瘤标本中PTEN的*化状态并将其与患者的临床病理参数结合进行分析,以期探讨PTEN*化在骨肉瘤发生中的作用及其相关预后影响因素,为探寻骨肉瘤早期诊断可能的分子靶标提供依据；第二部分,通过MSP技术对三株人骨肉瘤细胞MG-63、SAOS-2和U2-OS进行筛选,选取其中PTEN完全*化的一株细胞进行后续细胞学功能实验,以5-Aza-CdR对其进行去*化干预,探讨5-Aza-CdR作用的最佳浓度与时间、细胞的生物学行为及*化状态,为阐明5-Aza-CdR的体外去*化作用机制提供实验依据；第三部分,建立人骨肉瘤MG-63细胞荷瘤裸鼠模型,以5-Aza-CdR经尾静脉注射去*化干预4周,观测移植瘤体积生长的动态变化及检测移植瘤的病理形态学、PTEN蛋白表达及其*化情况,明确5-Aza-CdR的体内去*化作用机制. 第一部分骨肉瘤中PTEN的*化情况及其与相关临床病理参数的关系 目的明确骨肉瘤中抑癌基因PTEN的*化情况,寻找早期诊断可能的分子标志物.分析PTEN*化和骨肉瘤临床病理参数的关系,探讨PTEN*化对其相关预后影响因素的影响. 方法采集于xx年4月xx年4月间在湖南省肿瘤医院、中南大学湘雅二医院及湘雅医院进行治疗并确诊的46例骨肉瘤患者的病理标本,其中新鲜组织21例(同时采集癌旁组织21例)、石蜡标本25例,采用HE染色、免疫组化(S-P)法检测肿瘤组织的病理形态学及PTEN表达水平,然后采用*化特异性PCR (MSP)技术检测骨肉瘤组织中PTEN启动子区*化的状态；整合所纳入骨肉瘤患者的临床资料,采用x2检验或Fisher,s确切概率法分析PTEN启动子区*化与临床病理参数之间的关系. 结果HE染色及免疫组化结果显示,骨肉瘤组织中病理形态学呈明显肉瘤特征,而PTEN表达较癌旁组织明显减少,两组比较有统计学差异(P,0.05). MSP结果显示,骨肉瘤组织中存在PTEN高*化状态,癌旁组织中呈低*化或未*化状态,两组比较差异有统计学意义(P,0.05). PTEN高*化与骨肉瘤的Enneking肿瘤外科分期(P等于0.023). Price组织学分级(P等于0.001)及肿瘤发生的部位(P等于0.030)表现出显著的正相关(P,0.05).PTEN高*化患者术后5年生存率明显低于PTEN低*化患者,两组比较差异有统计学意义(P,0.05). 结论1、PTEN在骨肉瘤中表达下调,其DNA启动子区存在高*化状态,PTEN高*化是骨肉瘤早期发生的分子特征之一.2、PTEN高*化状态与骨肉瘤的病理分期及分级呈显著正相关,是其独立的预后影响因素之一. 第二部分5-Aza-CdR去*化对人骨肉瘤MG-63细胞生物学行为及PTEN*化的影响 目的筛选PTEN完全*化的骨肉瘤细胞株,明确5-Aza-CdR对骨肉瘤细胞的体外去*化作用及对PTEN*化的影响,证实PTEN负性调控骨肉瘤中PI3K/*t信号转导通路的作用机制. 方法选取三株经典的人成骨肉瘤细胞株MG-63、SAOS-2和U2-OS,用MSP法检测其中PTEN*化的情况,筛选出PTEN完全*化的一株细胞进行后续实验,以5-Aza-CdR对其进行去*化干预,同时筛选出PTEN*化状态被完全去除时5-Aza-CdR作用的最佳浓度及时间点,并检测该细胞的生物学行为及其PTEN*化的情况,采用Western-Blotting法检测经去*化干预后该细胞株中PI3K和*t信号分子的蛋白表达水平. 结果在三株人骨肉瘤MG-63、SAOS-2和U2-OS中,MG-63细胞中PTEN完全*化,其被5-Aza-CdR完全去*化的最佳浓度和时间点分别为10mol/L和24h.PTEN被完全去*化后的MG-63细胞在细胞凋亡、细胞周期、细胞侵袭迁移能力等细胞生物学行为方面与处理前比较差异有统计学意义(P,0.05). Western-Blotting结果显示,经5-Aza-CdR干预的MG-63细胞中PI3K和*t分子蛋白的表达水