第七章-微生物药物的分离、精制和鉴别PPT课件

第七章微生物药物的分离、纯化和鉴定，7.1提取工艺，原则和方法7.2微生物药物的鉴定，7.1提取工艺，原则和方法，微生物药物分离和纯化的重要原则，考虑高选择性分离和纯化方法以保证产品纯度；考虑到产品的生物活性不会受到影响；最终产品必须达到或超过国家药典(或出口国)质量标准。由于培养液和菌体中所需产物的浓度较低，并且含有许多杂质，发酵液或生物溶液也是非牛顿流体，因此必须进行预处理。为什么发酵液需要预处理？目的：为实现固液分离，根据活性物质的允许范围，可采用酸化、加热、过滤、絮凝、离心等方法。细胞、菌体和其他悬浮颗粒(细胞碎片、核酸和蛋白质沉淀)的分离，一些可溶性杂质的去除和滤液性质的改变，以利于后续操作。杂质蛋白的存在会降低离子交换树脂的吸附能力，大格栅树脂会发生萃取、乳化，影响常规过滤和膜过滤中的两相分离，还会降低过滤速率，使膜受到污染。(1)从发酵液中除去蛋白质，(1)沉淀法：大多数蛋白质的等电点在酸性范围内(pH4.0-5.5)，因为羧基的电离度大于氨基。然而，大多数蛋白质的等电点不能单独调节以使蛋白质沉淀为两性物质。在酸性溶液中，它们可以与一些阴离子物质如三氯乙酸盐、水杨酸盐、钨酸盐等形成沉淀。在碱性溶液中，可与银、铜、锌、铁等阳离子形成沉淀。2)变性法，最常用的加热方法，变性蛋白溶解度小，不仅能使蛋白变性，还能降低液体粘度，提高过滤速度。其他方法：大幅度调节酸碱度，加入乙醇、丙酮等有机溶剂或表面活性剂进行变性，都有一定的局限性。例如，加热方法仅适用于对加热相对稳定的目标产品。极端的酸碱度也会导致一些目标产物失活，并消耗大量的酸和碱。(3)吸附法，即加入一些吸附剂或沉淀剂来吸附和去除外源蛋白，如四环素的生产，通过黄血盐和硫酸锌的协同作用产生亚铁氰化钾胶体沉淀来吸附蛋白；枯草芽孢杆菌发酵时，加入氯化钙和磷酸氢二钠形成巨大的凝胶，蛋白质、菌体和其他不溶性颗粒被吸附包裹在凝胶中，去除镁离子。镁离子的去除：草酸和钙离子通常用于生成草酸钙沉淀，这是一种弱酸，对发酵产物的损害较小。草酸钙沉淀也能促进蛋白质凝结，有利于提高滤液的过滤速度。草酸溶解度小，需要大剂量时可以用草酸钠代替。草酸价格昂贵，通常需要在生产中回收；钙离子被去除；铁离子被去除；三聚磷酸钠和镁离子通常用于形成可溶性络合物Na5P 3O 10 Mg2=MgNa3P 3O 10 2Na；黄色血液盐和铁离子通常用于形成普鲁士蓝沉淀3K4Fe(CN)64Fe3=Fe4Fe(CN)6312K；2；去除发酵液中的高价离子；3；发酵液的过滤；影响过滤速率的因素，如菌株、发酵培养基的组成、发酵周期的长短等。提高过滤性能常用的助滤剂硅藻土；过滤设备鼓式真空过滤机、板框压滤机、1、普通过滤设备、1)板框压滤机、板框过滤机结构图(曹，第320页)1-尾板2-滤框3-滤板4-主梁5-顶板6-压榨装置、2)带式压滤机、3、发酵液过滤、减少消泡剂和发酵后期补料，防止消泡剂和未使用的培养基增加过滤难度；在菌体自溶前放置罐可以防止2)培养基成分、豆饼粉、花生饼粉等。将增加过滤难度，3)放置罐的时间，当发酵液中有不溶性多糖时，发酵液的粘度将增加，过滤速度将受到影响；它可以通过酶转化为可溶性单糖，提高过滤速度。3.提高过滤性能的方法：1)添加助滤剂，助滤剂是一种不可压缩的多孔颗粒，可以疏松滤饼，从而提高过滤速度；常用硅藻土、珍珠岩等。有两种添加方法：a)预先在滤布上铺一层1-2mm厚的助滤剂；b)直接向发酵液中加入助滤剂。2)加入填充混凝剂，如硫酸钙、磷酸铝等。是助滤剂本身，可以凝结凝胶状物质和悬浮物质，3)酶水解，目标代谢物不全是分泌性的，其中许多存在于细胞中，特别是细胞中由基因工程细菌形成的包涵体不分泌，因此需要细胞破碎。4、细胞破碎，大规模细胞破碎常用的方法；用高压使细胞悬液通过针阀，细胞由于突然减压和冲击环的高速冲击而破碎。影响破碎的主要因素有压力、温度和循环次数、细胞破碎方法、1)高压均质方法、高压均质器排出阀、2)高速球磨方法、高速球磨机1-物料入口2-物料出口3、4-冷却水入口、出口5、6-水套冷却水入口和出口。由于圆盘的高速旋转，细胞悬浮液与极细的玻璃珠、石英砂或氧化铝一起被快速搅拌或研磨，从而细胞被压碎。3)超声波法，常用的超声波频率为15-25 khz；细胞破裂是由于超声波的空化效应，这种空化泡被超声波的快速冲击所封闭，从而产生极强的冲击波压力。由此引起的粘性涡流在培养基中的细胞上产生剪切应力，促使细胞内流体流动并导致细胞破裂。超声波振荡很容易导致温度急剧上升。操作需要冷却。通常杆菌比球菌更容易破碎，而阴性菌比阳性菌更容易破碎。4)酶解，特异性强，条件温和；然而，另一种成本较高的酶水解方法是利用微生物的自溶，即裂解酶是由微生物自身产生的；大多数微生物能产生一种酶，这种酶能水解它们细胞壁上的聚合结构。当某些环境条件改变时，这种酶的过量产生或其他自溶酶的产生会被诱导，导致自溶。5)渗透压休克法，将细胞放入高渗透压培养基中，如高浓度的甘油或蔗糖溶液，达到平衡后，培养基突然被稀释，或细胞进入水或缓冲液中，水会迅速进入细胞，造成细胞膨胀，造成细胞壁破裂；这种方法适用于细胞壁脆弱的微生物，或那些细胞壁以前用酶处理过的微生物，或其细胞壁合成受到抑制的微生物。(6)反复冻融法，即在低温下反复突然冷冻后，细胞在室温下融化，导致细胞破裂；一方面，低温冷冻可以破坏细胞膜的疏水键结构，从而增加细胞的亲水性；另一方面，细胞内的水结晶改变了细胞内外溶液的浓度，导致细胞突然膨胀和破裂。该方法适用于细胞壁脆弱的细胞，主要用于离子交换法提取抗生素如链霉素。一般采用反向吸附，稀释后的低粘度发酵液自下而上流经树脂床。树脂“沸腾”，被吸附的废液(包括发酵液中的悬浮颗粒)一起流出离子交换池。不要过滤提取，活性物质浓缩方法：化学提取，树脂吸附，沉淀，溶剂萃取法(溶剂萃取)，手动清洗，例如，肥皂，搓后，如何去除肥皂泡沫？用清水冲洗多次。经验表明，每盆水揉捏的时间越长(即萃取越接近平衡)，水就越干燥分配定律内斯特，1891)溶质在一定温度和压力下分布在两种不互溶的溶剂中。当达到平衡时，两相中溶质浓度的比率是一个常数。K=CL/CR=萃取物浓度/萃余液浓度K是分配常数(分配系数，分配比)。它的大小反映了溶质在不同溶剂中溶解度的差异以及在该体系中的选择性。在溶剂萃取中，含有溶质的未萃取溶液称为进料液。用于萃取的溶剂称为萃取剂。萃取后含有溶质的萃取剂称为萃取液。被提取并失去溶质的物质液体称为萃余液。分离因子(Separation Factor)如果同一体系中有两种溶质A和B，在相同的条件下，它们的分配常数分别为KA和KB，则分离因子定义为：=Ka/Kb=(CLA/CLB)/(CRA/CRB)，K=C1/Cr，有机溶剂的选择，1)萃取溶剂的选择应考虑更大的溶解度和对产物更好的选择性。分离因子可以表征溶剂的选择性，溶解度由相似相的分子极性决定。介电常数是化合物摩尔极化程度的量度。根据这个值，可以预测一种化合物是极性化合物还是非极性化合物。4)价格低廉，安全，常用：乙酸乙酯、乙酸丁酯、正丁醇；2)溶剂和萃取液互溶性小，粘度低，界面张力适中，有利于相分散和相分离；(3)溶剂化学稳定性高，易于回收和再生；一、萃取方法1、单级萃取、多级逆流萃取包括几个萃取阶段，料液在第一阶段加入并逐渐移动到下一阶段，萃取剂在最后阶段加入并逐渐移动到前一阶段。进料液体移动的方向与萃取剂移动的方向相反，因此得名。(2)多级错流萃取，由几个串联的萃取器组成，在第一级萃取后将进料液体分成两相；萃余相流入下一个萃取器，加入新鲜萃取剂继续萃取；萃取相分别从各级排出，混合在一起，然后进入回收器回收溶剂，回收的溶剂仍作为萃取剂循环使用。3、多级逆流萃取(多级逆流萃取)，单级萃取过程，多级错流萃取过程，离子交换(离子交换)，一级离子交换树脂，活性基团通常是磺酸基(-SO3H)；因为它是一个强酸性基团，电离度不受外界酸碱度的影响，它可以在pH1-14范围内交换。一般来说，对酸碱度的使用没有限制。以氯化钠的交换为例：用氢氧化钠处理三氯化硫的再生，并洗涤至pH8-9。然后用盐酸处理，水洗至pH5，1，强酸性阳离子交换树脂，2，弱酸性阳离子交换树脂，以羧基(-COOH)，酚羟基(-OH)等为活性基团；这种树脂的交换性能与溶液的酸碱度密切相关，因为这种树脂的电离度很小。例如，羧基树脂交换ph 7，酚羟基树脂交换ph 9。在酸性溶液中，这种树脂几乎不发生交换反应，其交换容量随溶液酸碱度的增加而增加。典型的交换反应：R-COOH氢氧化钠H2O反应生成的盐RCOONa易水解，使溶液呈碱性，因此钠树脂不能洗涤至中性，一般只能洗涤至pH8-9。3、强碱性阴离子交换树脂有两种：强碱性型含三甲胺基强碱性型含二甲基-羟乙基胺强碱性阴离子交换树脂和强酸性阳离子交换树脂，对使用的酸碱度没有限制；典型的交换反应：RN (CH3) 3Cl氢氧化钠RN (CH3) 3OH氯化钠，4，弱碱性阴离子交换树脂，活性基团包括伯胺基-NH2，仲胺基=NH，叔胺基NH和吡啶基等。与弱酸性阳离子交换树脂相似，交换容量随酸碱度的变化而变化，酸碱度越低，交换容量越大。典型的交换反应：由RNH3OH HClRNH3Cl H2O生成的盐RNH3Cl容易水解；这种树脂与羟基有很强的结合能力，以及一些特殊树脂，如螯合树脂、两性树脂、氧化还原树脂；大孔树脂，ii)离子交换树脂的命名，大孔树脂前面加“d”，例如：0017:强酸性苯乙烯阳离子交换树脂，交联度7D301:弱碱性苯乙烯大孔阴离子交换树脂，iii)离子交换树脂的理化指标，树脂合成过程中交联剂(如二乙烯基苯)在单体中的百分比称为交联度。通常为8%-12%；通常，交联度越强，树脂越强，机械强度越好，并且在水中不容易膨胀。交联度越低，树脂越软，膨胀越容易，吸收更大离子越好，达到交换平衡越快。然而，机械强度差且吸附选择性小。1、交联度，2、溶胀度，树脂不溶于水，但亲水性强，具有亲水胶体性质，一般遇水膨胀，脱水收缩；测定方法：将10-15毫升风干树脂放入量筒中，加入待测溶剂(主要是水)，然后不时摇动，24小时后测量树脂体积。前后容积之比称为膨胀系数。膨胀系数与交联度有一定的关系，高交联度树脂的膨胀系数较小。交换容量是指一定量树脂中可交换基团的毫当量数，是树脂性能的重要指标。如果将树脂装入塔中进行操作，当流出物中的产物离子达到一定浓度时，应停止操作，树脂应在再生后重新使用。这种浓度称为泄漏点。在泄漏点吸附的树脂量称为工作交换容量。(4)离子交换的工作原理。根据物质的不同酸度和极性，水溶液中携带的阴离子和阳离子不同，不同电荷的物质对色谱柱上的离子交换剂有不同的亲和力。通过改变洗脱液的离子强度或酸碱度，不同的物质可以依次从色谱柱中分离出来。在离子交换过程中，离子首先扩散到树脂表面，通过树脂扩散到交换位置，在交换位置进行离子交换。交换的分子携带的电荷越多，它与树脂结合得越紧密，就越不可能被其他离子取代。交换的离子扩散到树脂表面，洗脱液通过，交换的离子扩散到外部溶液。对于大分子物质，应选择交联度较低的树脂，而对于小分子物质，应选择交联度较高的树脂。由于低交联度的树脂强度差，容易断裂，选择交联度的原则是尽可能提高交联度，而不影响交换容量。(5)离子交换树脂的选择。1.首先应该考虑产品的酸碱性。例如，对于强酸性物质，应选择弱碱性阴离子交换树脂，这主要是从易于解吸的角度考虑的。因为强碱性阴离子交换树脂能吸附强酸性物质，但洗脱困难。如果产品为弱酸性，应选用强碱性阴离子交换树脂，而弱碱性阴离子交换树脂不易吸附。同样，弱酸性阳离子交换树脂应该用于强碱性产品。弱碱性产品是强酸性阳离子交换树脂。其次，应该考虑交联的程度，例如，当产物分子是低价离子时，增加浓度有利于在柱上交换；高价离子在较低浓度下容易被吸附。(6)操作条件的控制，(1)交换条件的控制，(1)最重要的是在交换过程中控制酸碱度。合适的酸碱度应考虑三个方面：应在被吸附物质的稳定酸碱度范围内；能电离被吸附的物质；同时，它可以电离树脂。2)使用前，必须将树脂加工成某种类型。对于弱酸性和弱碱性树脂，应采用钠型或氯型，以电离它们。然而，可以使用任何类型的强酸性或碱性树脂，但是如果产品在酸性或碱性条件下容易损坏，