核酸提取原理及常见问题PPT课件

.,1,核酸提取原理及常见问题,.,2,第一部分：DNA提取方法简介,第二部分：DNA提取常见问题、原因分析及其对策,内容,第三部分：RNA提取方法简介,第四部分：RNA提取常见问题、原因分析及其对策,.,3,基因组DNA的提取,CTAB法SDS法酚氯仿法试剂盒法,DNA提取的几种方法,.,4,CTAB法原理,CTAB，是一种阳离子去污剂，可破碎细胞壁和细胞膜，并与核酸形成复合物。在高盐溶液中(1.4mol/LNaCl)是可溶的,当降低溶液盐浓度到一定程度(0.7mol/LNaCl)时,从溶液中沉淀。通过离心,可将CTAB核酸复合物同蛋白质、中性多糖类物质分开。溶解于高盐溶液中的CTAB核酸复合物,加入乙醇可使核酸沉淀,而CTAB则溶于乙醇.,注：CTAB溶液在低于15时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15。,CTAB法（植物DNA提取经典方法）,.,5,CTAB提取缓冲液的经典配方,Tris-HCl（pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；NaCl提供一个高盐环境，使DNP（脱氧核糖核蛋白）易于溶解。CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除,.,6,细胞裂解后释放的植物次生代谢产物和多酚类化合物易于氧化,氧化的多酚结合到DNA分子上而致DNA降解；多糖的性质与核酸类似，会与核酸一同沉淀下来，影响植物核酸纯度。,.,7,CTAB提取缓冲液的改进配方,PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。同时向抽提液中加入还原剂-巯基乙醇，后者能打断多酚氧化酶中的二硫键，使多酚不易被氧化，随后经抽提而去除。,改良方法1,.,8,改良方法2,加入核酸分离缓冲液，利用高温加热裂解细胞，去除部分杂质，离心得到细胞核；针对多糖组织，得到细胞核之后可加入1XPBS清洗2-3次，去除多糖；后续使用CTAB裂解液裂解细胞核。核酸分离缓冲液：200mMTris-HCl50mMEDTA250mMNaCl2%PVP,.,9,CTAB法流程图,植物材料,裂解液,上层溶液,液氮研磨,抽提,细胞裂解,干燥溶解,离心洗涤,酒精沉淀,DNA溶液,.,10,SDS法原理,SDS法,SDS是一种阴离子去垢剂，在高温（5565）条件下能裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；提高盐(KAc或NH4Ac)浓度并降低温度（冰浴），使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀；上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。,SDS法DNA提取缓冲液,.,11,SDS法操作简单,温和,也可提取到较高分子量DNA,但所得产物含糖类杂质较多CTAB法的最大优点是能较好地去除糖类杂质,.,12,SDS法流程图,.,13,酚氯仿裂解法,苯酚抽提原理：,使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与DNA联结键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。酚的优点：1.有效变性蛋白质；2.抑制了DNase的降解作用酚的缺点：能溶解10-15%的水。最后用氯仿抽提：克服酚的缺点；加速有机相与液相分层；去除核酸溶液中的迹量酚。（酚易溶于氯仿中）用酚氯仿抽提细胞基因组DNA时，通常要在酚-氯仿中加少许异戊醇，减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。,.,14,用乙醇沉淀DNA时，通常要在溶液中加入单价的阳离子，如NaCl或NaAc，Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，而易于聚集沉淀。,.,15,DNA提取常见问题,DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应DNA中残留有金属离子,重新纯化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质重新沉淀DNA，让酒精充分挥发增加70乙醇洗涤的次数（2-3次）,问题一：DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应。,原因,对策,.,16,材料不新鲜或反复冻融未很好抑制内源核酸酶的活性提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断外源核酸酶污染反复冻融,尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时，可增加裂解液中螯合剂的含量细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌将DNA分装保存于缓冲液中，避免反复冻融,问题二：DNA降解。,对策,原因,.,17,实验材料不佳或量少破壁或裂解不充分沉淀不完全洗涤时DNA丢失,尽量选用新鲜（幼嫩）的材料动植物要匀浆研磨充分；G菌、酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁高温裂解时，时间适当延长（对于动物细胞、细菌可增加PK的用量）低温沉淀，延长沉淀时间加辅助物，促进沉淀洗涤时，最好用枪头将洗涤液吸出，勿倾倒,问题三：DNA提取量少。,对策,原因,.,18,RNA的提取,异硫氰酸胍/苯酚法（如Trizol法）CTAB法试剂盒法,RNA提取,.,19,异硫氰酸胍/苯酚法,原理：细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，同时核蛋白体上的蛋白变性，核酸释放；释放出来的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而分别位于整个体系中的中间相和水相，从而得以分离；有机溶剂抽提，沉淀，得到纯净RNA。,.,20,Trizol法适用于普通的植物组织、动物组织以及真菌和细菌等。,.,21,酚类化合物被氧化后会与RNA不可逆地结合，导致RNA活性丧失及在用苯酚、氯仿抽提时RNA的丢失，或形成不溶性复合物；而多糖会形成难溶的胶状物，与RNA共沉淀下来；萜类化合物和RNase会分别造成RNA的化学降解和酶解。,.,22,针对多糖多酚植物，可以采用CTAB法和Trizol法结合的方法，针对性的去除多糖多酚。对于富含色素、蛋白和多糖的藻类，可采取试剂盒方法。组织量较少的样品，在沉淀时刻加入糖原，增加终浓度等。,.,23,影响RNA提取的因素,材料：新鲜，切忌使用反复冻融的材料如若材料来源困难，且实验需要一定的时间间隔。可以先将材料贮存在TRIzol或样品贮存液中，于80保存液氮长期保存，80短期保存,.,24,样品破碎及裂解：根据不同材料选择不同的处理方法：培养细胞：通常可直接加裂解液裂解酵母和细菌：直接液氮研磨，之后用Trizol裂解动植物组织：先液氮研磨和匀浆，后加裂解液裂解。有些样品如肌肉或者动物脏器需要加入裂解液后进行湿磨，以充分研磨。为减少DNA污染，可适当加大裂解液的用量,.,25,纯化：在使用氯仿抽提纯化时，一定要充分混匀，且动作快速；经典的沉淀方法，如LiCl沉淀等，虽然经济，但操作时间长，易造成RNA降解；异丙醇沉淀，用时短，但所获得的RNA杂质较多；柱离心式纯化方法：抽提速度快，能有效去除影响RNA后续酶反应的杂质，是目前较为理想的选择。,.,26,RNA提取常见问题,RNA的降解OD260/OD280比值偏低总量偏低,.,27,RNA降解,样品取样以及保存是否得当裂解液的质量外源RNase的污染裂解液的用量不足组织裂解不充分另外某些富含内源酶的样品(如脾脏，胸腺等)，很难避免RNA的降解。,.,28,OD260/OD280比值偏低,蛋白质污染：不要吸入中间层及有机相，加入氯仿后首先混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。减少起始样品量，确保裂解完全、彻底苯酚残留：不要吸入中间层及有机相，加入氯仿后首先混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。,.,29,抽提试剂残留：确保洗涤时要彻底悬浮RNA，并且彻底去掉75%乙醇。设备限制：测定OD260及OD280数值时，要使OD260读数在0.10-0.50之间。此范围线性最好。用水稀释样品：测