免疫组化超详细步骤

免疫组织化实验目的：用KRAS、NRAS、HRAS蛋白抗体分别测定KRAS、NRAS、HRAS蛋白在肺癌组织中的表达情况二实验原理：免疫学基本原理应用抗原和抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来识别组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，并对其进行定位、定性和定量研究三实验试剂和消耗品：病理医生确认的肺癌组织切片、KRAS、NRAS、HRAS蛋白抗体、DAB发色试剂盒、抗原修复液、PBS、苏木素染料、1%盐酸醇溶液、0.05%氨水、二甲苯等四实验设备：切片机、4冰箱、显微镜、烤箱五主要试剂配置：缓冲液在1000溶液中配合了38.4 g的应用液a nah2po 4应用液B Na2HPO412H2O 114.8g配合到1000溶液中要调制1000毫升的PBS，需要加入14毫升的a液、36毫升的b液、8.5g的NaCl。柠檬酸钠抗原修复液在1000溶液中配合了应用液a柠檬酸10.55g在1000溶液中配合了29.01g应用液b柠檬酸钠(三水和柠檬酸三钠)。调制500毫升抗原修复液，需要a液9毫升，b液41毫升。苏木素染液配方：苏木素2g、无水乙醇250毫升、硫酸铝17.6g蒸馏水750毫升、氯酸钠0.2g、冰醋酸20毫升。 将苏木精溶解在无水乙醇中，将硫酸铝溶解在蒸馏水中。 将两种液体溶解混合，加入碘酸钠，最后加入冰醋酸。抗体说明书建议的抗体稀释度N-Ras 1:50-1:500H-Ras 1:50-1:500K-Ras 1:20-1:2006个实验步骤：1组织通常的石蜡切片厚度为3-5um，捞起防脱片后晾干，放入72的烘箱中烤2小时。2片脱蜡水化程序二甲苯I、ii脱蜡各12分钟；无水乙醇I、ii各3分钟； (二甲苯清洗) 95%乙醇3分钟； 85%乙醇3分钟；三自来水冲洗三分钟，洗涤一定要充分。4组织修复采用高温高压法：在压力锅中加入ph6.0、0.01m抗原修复液约1000ml，切片插入塑料架子中，放入压力锅中，盖上盖子(此时不关闭压力阀)，将1600W预热至沸腾，关闭压力阀1300W，关闭压力锅5停止加热，用流水清洗高压釜冷却，在室温下冷却。6将修复抗原的切片放入自来水中，浸泡2分钟。 把样品放在内源性过氧化物酶阻断剂的3%H2O2上，在室温下放置4分钟。 (需要盖子)自来水清洗2分钟，PBS缓冲液清洗2分钟。取出7切片，擦掉组织周围的液体后，滴入10%BSA封闭液，在37下孵育40分钟。 滴加一次抗体(浓度配比，PBS稀释1:20，1:50，1:100，1:200 ) 60ul，保持组织的湿润状态，但要注意表面没有液体，用试管把抗体盖在组织面上，使其不具有气泡。在8滴中加入一次抗体后，放入专用的培养箱中，在4的冰箱里过夜。9片放入PBS缓冲液中3分钟清洗3次，充分清洗，防止清洗不良引起的非特异染色。 (前两次PS倒下了)擦拭10个组织周围的液体后，滴下70毫升辣味酶标记羊的抗小鼠/兔子IgG聚合物(根据情况，复盖样品)，在37的烤箱中孵育40分钟。 PBS缓冲液每三分钟清洗三次。显色11色，向适量的DAB显色剂(1ml试剂2(DAB基质液)中滴加1滴(约50ul )试剂1(DAB浓缩液)、混合液、DAB工作液)，配置了DAB显色剂的容器在冷冻切片器旁边的冰箱中，其他试剂在入口的冰箱中。 室温显色，5-20分钟。 自来水停止发色。 第一次自来水集中处理，自来水清洗三分钟。12复染，苏木素染液中染色40秒，水洗1分钟。13 1%盐酸醇溶液分化为3秒，用水马上。14青化10秒，