脑神经系统-神经解剖学研究方法.ppt

神经解剖学的研究方法,一、传统的研究方法,（一）大体研究方法：显示脑血管、主要核团和纤维束、脑室等。塑化标本用于断面解剖学。（二）组织学研究方法：固定、切片、染色1.H.E染色2.硝酸盐镀染：机制不清(显示神经元轮廓和突起的行向)。3.Nissl法：碱性染料-核酸结合(焦油紫、甲苯胺蓝、培花青等)。,二、近代的研究方法,（一）组织化学的研究方法：生化学+组织学：固定良好，称量准确，器皿洁净，严格操作。1.酶组化：底物(有色)原位沉淀四氮唑盐或金属(铅、钴、铜)(1)胆碱能神经元的检测：乙酰硫胆碱硫胆碱铁氰化物亚铁氰化物(2)NO能神经元的检测：还原辅酶A蓝色沉淀硝基四氮唑蓝,酶,AchE,Cu棕色沉淀,+,(黄递酶),NOS,（二）荧光组化(FluorescenceHistochemistry)自发荧光和诱发荧光：紫外光标本激发滤片物镜吸收滤片目镜1.单胺荧光组化：(1)甲醛诱发荧光：(2)乙醛酸诱发荧光：CA四氢异喹啉双氢异喹啉5HT四氢-咔啉二氢-咔啉,FAorGA,蛋白,催化,H+,(绿色荧光),FAorGA,蛋白,催化,H+,(黄色荧光),(三)免疫组化(Immunohistochemistry)1.原理：抗原抗体反应。重链N端可变区抗体活性部分Fab段轻链C端稳定区抗原决定簇Fc段,C端,Fc,Fab,N端,重链,轻链,C区,V区,C区,抗原,第一抗体,F,标记物,直接法,抗原,第一抗体,间接法,第二抗体,F,标记物,2.PAP法的原理,注意事项：1)一抗的特异性要强，效价要高。2)二抗的量要足(双桥PAP法)。3)PAP复合体与一抗来自同一动物种属。4)要设对照试验(吸收试验、置换试验、交叉试验)。5)提高染色质量的措施：H2O2甲醇液去内源性HRP；TritonX-100增加通透性；酶消化，微波重新释放抗原。,(四)免疫荧光组化基本原理：显示标记物改酶标为荧光素(异硫氰酸荧光素FITC、四甲基异硫氰酸罗达明TRITC)，在荧光显微镜下观察。,A,B,直接(A)和间接(B)免疫荧光法原理示意图,(五)亲合免疫组织化学1.原理：是利用两种物质之间的高度亲和力与免疫反应结合起来的技术。这些物质包括：植物凝集素与糖类，生物素与亲合素，葡萄球菌A蛋白与IgG，阳离子与阴离子，激素与受体。2.ABC法的原理(AvidinBiotin-peroeidaseComplex)亲合素生物素过氧化物酶复合体3.ABC法的优点：(1)灵敏度高；(2)非特异性着色较少；(3)使用和操作较简便。,4.SABC法的原理(StreptAvidinBiotin-enzymeComplex):链酶亲合素生物素酶复合物,(六)原位杂交组化技术(in-Situhybridizationhistochemistry,ISHH)1.原理：是用碱基序列已明了的，并被同位素标记的核酸探针与组织或细胞中待测的核酸杂交，对待测核酸进行定性、定位和相对定量的技术。多用于蛋白质合成的动态变化、递质共存、亚核和追踪定性等方面的研究。,cDNA,mRNA(转录),多肽链蛋白质,RNA聚合酶,反转录酶,tRNA,核糖体,GCTA,(DNA),CGAT,GCUA,(RNA),CGAU,2.注意事项：戴手套；器械高压消毒；固定的要求更严格；标本制备过程中尽量避免RNA酶的污染。,三、束路追踪技术(一)HRP(HorseradishPeroxidase)辣根过氧化物酶1.原理：神经元轴浆运输：顺行、逆行。2.种类：(1)游离HRP：(2)结合HRP：麦芽凝集素HRP(WheatGermagglutininHRP)霍乱毒素HRP(CholeratoxinHRP)为酶标配体。优点：灵敏度高，用量小，显示充分，降解时程长。,(3)主要步骤：HRP的引入存活。最佳存活期(日)(束路长度毫米/350毫米)+1日固定取材。切片。组织化学反应：DAB法成色剂+H2O2(二氨基联苯胺)TMB法(四甲基联苯胺)HRP+H2O2HRPH2O2络合物HRPH2O2+(CHR)H2CHR+2H2O2吲哚胺聚合体吩嗪多聚体,压力注射法,电泳法(HRP溶液接正电极，实验动物接负电极),(二)荧光素逆行标记(Fluorescentretrogradelabellingmethod)1.原理：2.特点：(1)种类多，荧光颜色各异。(2)标记神经细胞的部位各异。(3)可单、双、多标记，用以研究轴突分支投射。(4)切片易褪色，荧光显微镜的滤片要齐全。,(三)放射自显影神经追踪(AutoradiographicNerveTracingmethod)1.原理：将3H、14C标记的氨基酸注入神经组织，被神经元胞体吸收后参与神经细胞的蛋白质合成，然后合成的物质随轴浆运输至末梢，借助放射性同位素发出的射线使胶片或乳胶感光，经显影、定影后就能产生黑色的银粒，从而可确定神经元的纤维投射区。2.特点：(1)顺行追踪。(2)不存在过路纤维摄取干扰的问题。3.基本步骤：,(四)化学损毁1.原理：利用某些化学性神经毒物质选择性地损毁特定性质的神经元胞体或末梢，引起神经的顺行溃变或逆行溃变(变性)。,2.单胺能毒剂：NACA5-HT5,6-或5,7-DHT(5,6-或5,7-双羟色胺，为5-HT的同系物)对神经元细胞膜上胺摄取机制中的载体有高的亲和力，进入胞体后自行氧化，形成对细胞毒性很强的苯醌类化合物而导致细胞溃变，染色质溶解、核偏心，胞体膨胀死亡。电镜下线粒体膨胀、溶解、基质电子密度增高，突触囊泡分解、消失。对其敏感性：末梢轴突胞体,6-OH-DA(6羟多巴胺，为去甲肾上腺素的同系物),四、电子显微镜术(一)电镜的基本结构：1.用电子束代替光源。2.成像部分：用电磁透镜代替光镜中的聚光器、物镜和目镜。(电子射线发生曲折)(可见光发生曲折)3.观察部分：电子流荧光屏可见荧光(二)透射电镜标本的制作：1.固定、取材、修块(1mm3)、后固定(1%饿酸2h)。2.脱水。3.包埋：树脂类，不同温度聚合，保证硬度适宜。4.切片：超薄切片(玻璃刀、钻石刀，铜网)。5.电子染色：增加对比度(铅、铀)。吸附重金属强部位透过的电子荧光屏弱光暗区吸附重金属弱部位透过的电子荧光屏强光亮区,(三)扫描电镜标本的制作：一部分电子穿透电子束标本另一部分电子将样品表面原子的外层电子打落“二次电子”收集、成像主要方法步骤：(1)灌注、取材。(2)再固定及脱水。(3)置换：用醋酸异戊酯置换酒精，用液态的CO2置换无水液体。(4)临界点干燥。(5)喷金：真空喷镀仪(防止放电，防止电子束损伤，增强反差，限定于样品表面)。,(醋酸异戊酯),(四)免疫电镜术(Immunoelectronmicroscopictechnique)：是一种使抗原或抗体在超微结构水平上定位的方法，是免疫细胞化学与电镜技术的有机结合。1.主要步骤：包埋前染色(振动切片、平板包埋、解剖显微镜下精确取材后，用502胶水粘贴在环氧树酯柱上作超薄切片。包埋后染色(镍网或金网上作免疫细胞化学染色，抗体显示系统多用胶体金技术，双重染色的结果可以用两种不同直径的胶体金颗粒显示)。2.用途与评价：可用于超微结构水平上神经元和神经纤维的定性，研究神经元之间联系的性质，以及递质共存等，包埋前染色对组织的抗原性保存较好，但不适于可溶性物质的细胞内定位，包埋后染色，则与此相反。,五、激光扫描共聚焦显微镜术(LaserScanningConfocalMicroseope,LSCM)(一)基本原理：激光束做光源，为高能量、密度的相干光，光敏度高。共聚焦：光源针孔检测针孔(二)主要优点：(1)提高分辨率和敏感性。(2)实现三维重建。微动步进马达控制载物台升降“细胞CT”。(3)扩大信息范围。(4)客观准确地记录荧光强度，以数据代替+、+。(5)荧光摄影方便，如是紫外光下照射30秒，荧光亮度降低50%。(6)可同时显示多种标记物。三色同显，双标、三标(三个独立的PMT)(三)应用：定量荧光测定，细胞内离子测定，细胞间通讯的研究，神经细胞和细胞器的三维图像重组等等。,样品(对样本内焦平面上的第一点进行扫描),焦平面上的光,六、结