海洋大学生物化学实验教案.ppt

生物化学实验,实验Folin-Wu法定量测定血糖的含量,一、目的要求1、掌握FolinWu法测定血糖含量的原理和方法。2、学会制备无蛋白血滤液。,二、实验原理,Cu2+(CuSO4)+葡萄糖Cu+(Cu2O)Cu2O+酸性钼酸试剂蓝色钼化合物OD420比色无蛋白血滤液中的葡萄糖和碱性硫酸铜溶液共热反应，Cu2+即被葡萄糖还原成Cu+（Cu2O）,Cu2O又把酸性钼酸试剂（Mo6+）还原成低价的蓝色钼化合物钼蓝。血滤液中葡萄糖的含量与产生的Cu2O成正比，而Cu2O的量与产生的钼化合物的量成正比。可用比色法定量的测定。,二、实验仪器,1、新鲜兔子血2、滤纸3、血糖管（25ml）4、奥氏吸管（1ml）5、锥形瓶（50ml）6、漏斗7、电炉8、水浴锅9、7200型可见分光光度计,1、标准葡萄糖溶液（0.1mg/ml）(1)1%葡萄糖母液：称取1.000g葡萄糖，溶于蒸馏水，稀释并定容至100ml。(2)葡萄糖标准液：取1.0ml葡萄糖母液于100ml容量瓶中，加蒸馏水定容。2、10%钨酸钠溶液：称取钨酸钠10g，溶于蒸馏水并定容至100毫升。3、0.33mol/LH2SO4溶液：于53ml蒸馏水中加入1ml的浓硫酸。4、碱性硫酸铜溶液A液：无水碳酸钠35g，酒石酸钠13g及碳酸氢钠11g溶于蒸馏水，稀释定容至1000ml.B液：硫酸铜晶体5g，溶于蒸馏水并定容至100ml。临用时，A液：B液=15：1混合（体积比），混合液于冰箱中保存（4）。,四、实验试剂,5、酸性钼酸盐溶液：称取钼酸钠600g,用少量蒸馏水溶解后倾入2000ml的容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀，倾入另一较大的试剂瓶中，加溴水0.5ml，摇匀，静止数小时后取上清夜500ml，于1000ml容量瓶中，徐徐加入225ml85%磷酸，边加边摇匀，再加25%硫酸150ml。置暗处次日，用空气将剩余的溴赶去。然后加99%醋酸75ml，摇匀，用蒸馏水稀释定容至1000ml,贮于棕色瓶中。,1、无蛋白血滤液的制备：用奥氏吸管吸取全血（已加抗凝剂草酸钠）1ml,缓缓放入50ml锥形瓶中，加蒸馏水7ml，摇匀，溶血后（血液变为红色透明）加10%钨酸钠1ml，摇匀。再加0.33mol/LH2SO41ml，边加边摇，加毕充分摇匀，防止515分钟，至沉淀变为暗棕色（如不变色可再加0.33mol/LH2SO412滴）。用干滤纸过滤。先倾入少许，待滤纸湿润后在全部倒入，如滤液不清需重新过滤。每毫升无蛋白血滤液相当于1/10ml全血。,五、实验步骤,1、无蛋白血滤液的制备：,吸取全血1ml(奥氏吸管),50ml锥形瓶,蒸馏水7ml,摇匀,溶血（血液变为红色透明）,10%钨酸钠1ml,摇匀,0.33mol/LH2SO41ml,边加边摇,放置515分钟(沉淀变为暗棕色),干滤纸过滤,无蛋白血滤液(每毫升相当于1/10ml全血),取25ml的血糖管(见图1)3支，编号。第一支血糖管中加入（空白管）；第二支血糖管中加；用奥氏吸管吸取，放入第三支血糖管中。然后向三支血糖管中各加入2ml新配制的碱性硫酸铜溶液，同时置于沸水浴中8分钟，取出，在流水中迅速冷却后各加4ml酸性钼酸盐溶液。一分钟后，用蒸馏水稀释至25ml，混匀，用7220分光光度计在420波长处比色，以空白管调节零点。,2、血糖的定量测定：,2、血糖的定量测定：取25ml的血糖管(见图1)3支，编号。第一支血糖管中加入1ml蒸馏水（空白管）；第二支血糖管中加1ml标准葡萄糖液；用奥氏吸管吸取无蛋白血滤液1ml，放入第三支血糖管中。然后向三支血糖管中各加入2ml新配制的碱性硫酸铜溶液，同时置于沸水浴中8分钟，取出，在流水中迅速冷却后各加4ml酸性钼酸盐溶液。一分钟后，用蒸馏水稀释至25ml，混匀，用7220分光光度计在420波长处比色，以空白管调节零点。,按下式计算100ml全血中所含血糖的含量m=OD1/OD2C10100式中:m=100ml全血中含血糖毫克数C=标准液葡萄糖含量（0.1mg/ml）OD1=样品液光密度值OD2=标准液光密度值,六、结果计算：,实验肝糖元的提取和鉴定,一、实验原理糖原在浓碱中稳定，将肝组织先置于浓碱中加热，使蛋白质及其他成分分解而保留肝糖元。再用浓硫酸使糖原脱水生成糖醛衍生物，衍生物和蒽酮作用形成蓝色化合物，与同法处理的标准葡萄糖一起比色定量。,二、实验仪器1、新鲜肝脏2、100ml容量瓶3、7220分光光度计4、水浴锅5、试管(ml、2ml、5ml),三、实验试剂,1、30%NaOH溶液：30gNaOH溶于100ml蒸馏水中2、标准葡萄糖溶液（0.1mg/ml）：准确称取10mg分析纯葡萄糖（预先在110干燥至恒重），用少量蒸馏水溶解后，定容至100ml.3、显色剂：称取0.2g蒽酮加入100ml浓硫酸中。此试剂不稳定，以临用时配用为宜，冰箱保存可用45天,四、实验步骤1、准确称取肝组织0.5g，放入盛有1.5ml30%NaOH的试管中，置于沸水浴中加热20分钟，取出后冷却，将管中内溶物全部转移到100ml容量瓶中（用蒸馏水多次洗涤试管，一并收入容量瓶）加蒸馏水定容。2、取干燥试管三支，注明空白管、标准管、测定管，按下表进行操作。加毕，摇匀，置沸水浴中10分钟，冷却，以空白管调节零点，在620nm波长下比色测定。,五、结果计算100g肝组织中所含糖原的克数=（OD测/OD标）C标2100（1/1000）（100/111）（100/0.5）注：100/111是此法测的葡萄糖含量换算为糖原含量的常数，即100g糖原用蒽酮试剂显色相当于111g葡萄糖用蒽酮试剂所显得色,实验二蛋白质的部分性质,一、试验原理蛋白质分子中某种或某些基团可与显色剂作用，产生颜色。不同的蛋白质由于所含的氨基酸不完全相同，颜色反应亦不完全相同。颜色反应不是蛋白质的专一反应，一些非蛋白物质也可产生同样的颜色反应，因此不能根据颜色反应的结果来决定被测物是否为蛋白质。另外，颜色反应也可作为一些常用蛋白质定量测定的依据。,第一部分、蛋白质的颜色反应,二、实验仪器1、吸管2、滴管3、试管4、电炉5、pH试纸6、水浴锅三、实验试剂1、卵清蛋白液：鸡蛋清用蒸馏水稀释10-20倍，3-4层纱布过滤，滤液放在冰箱里冷藏备用。2、0.5%苯酚：1g苯酚加蒸馏水稀释至200ml。3、Millons试剂：40g汞溶于60ml浓硝酸（水浴加温助溶）溶解后，冷却，加二倍体积的蒸馏水，混匀，取上清夜备用。此试剂可长期保存。4、尿素晶体5、1%CuSO4：1gCuSO4晶体溶于蒸馏水，稀释至100ml6、10%NaOH：10gNaOH溶于蒸馏水，稀释至100ml7、浓硝酸8、0.1%茚三酮溶液：0.1g茚三酮溶于95%的乙醇并稀释至100ml.9、冰醋酸10、浓硫酸,四、实验步骤（一）米伦（Millons）反应原理：米伦试剂是硝酸、亚硝酸、硝酸汞、亚硝酸汞的混合物，能与单酚及双酚和吲哚衍生物起颜色反应。单酚（Tyr）与Millon试剂呈粉红色至暗红色；双酚和吲哚衍生物（Trp）与Millon试剂呈黄色至红色。组成蛋白质的氨基酸中含有Tyr和(或)Trp，与Millon试剂反应呈颜色反应，定性鉴定蛋白的存在。注意：由于尿液中含有的无机盐、尿等能造成汞离子的沉淀，因此不能检测尿蛋白；同时也不能检测碱性溶液（先酸化）。,操作1、苯酚实验取0.5%苯酚溶液1ml于试管中，加Millons试剂0.5ml，于电炉上小心加热，溶液即出现玫瑰红色。2、蛋白质实验取2ml蛋白液，加Millons试剂0.5ml，出现白色的蛋白质沉淀，小心加热，凝固的蛋白质出现红色。,原理：尿素被加热，则两分子的尿素放出一分子氨而形成双缩脲。双缩脲在碱性环境中，能与硫酸铜结合成紫色的化合物，此反应称为双缩脲反应。,（二）双缩脲反应,蛋白质分子中含有肽键与缩脲结构相似，故也能进行此反应。双缩脲反应可作为蛋白质定量测定的依据。,注意：但CS-NH2；CH2-NH2；CRH-NH2；CH2-NH；-CHNH2；CH2OH；CHOH；-CH2NH2等基团的存在，甚至过量铵盐也干扰本实验。,操作：1、双缩脲的反应：取少量尿素晶体放在干燥的试管中，微火加热使其熔化成液体，此时有氨气放出，可用湿润的试纸检验，至液体重新结晶出现白色固体时，停止加热，冷却。然后加10%NaOH溶液1ml，摇匀，再加2-4滴1%CuSO4溶液，混匀，观察有无紫色出现。2、蛋白反应：取蛋白液1ml，加10%NaOH溶液1ml，摇匀，再加2-4滴1%CuSO4溶液，混匀，观察有无紫色出现。,原理：蛋白质分子中芳香族氨基酸，特别是Tyr、Trp侧链基团与浓硝酸反应生成黄色物质，此物质在碱性环境下变为桔黄色的邻硝醌酸衍生物。Phe在少量浓硫酸和浓硝酸条件下反应亦生成黄色物质。操作：取一支试管，加入1ml蛋白液及浓硝酸5滴。加热，冷却后注意颜色变化。然后再加入10%NaOH溶液1ml，颜色有什么变化？,（三）黄色反应,原理：蛋白质与茚三酮共热，产生兰紫色的还原茚三酮、茚三酮和氨的缩合物。此反应为一切蛋白质及a-氨基酸所共有。亚氨基酸（脯氨酸和羟脯氨酸）与茚三酮反应呈黄色，含有氨基的其他物质（氨、-Ala和许多一级胺）亦呈此反应。反应灵敏度达1:1500000(pH5-7)，广泛用于氨基酸定量测定。,（四）茚三酮反应,操作：取蛋白液1ml于试管中，加4-8滴茚三酮溶液，加热至沸，即有蓝紫色出现。反应溶液的pH，直接影响实验成败,第二部分、蛋白质的沉淀反应,一、试验原理在水溶液中蛋白质分子的表面由于形成水化层和双电层而成为稳定的胶体颗粒。在一定的物理或化学因素的影响下，破坏其表面的水层、电层，甚至变性，将以固态形式从溶液析出，该过程为蛋白质的沉淀反应。可逆的沉淀反应：分子结构未发生变化，去除沉淀因素后可溶解。低温下乙醇、丙酮、中性盐硫酸胺等。不可逆的沉淀反应：内部结构、空间构象遭到破坏，失去天然特性，不能恢复溶解状态。重金属、生物碱试剂、过酸碱、加热、超声波、有机溶剂等。,二、实验仪器1、移液管2、吸管3、试管4、电炉三、实验试剂1、卵清蛋白液：鸡蛋清用蒸馏水稀释10-20倍，3-4层纱布过滤，滤液放在冰箱里冷藏备用。2、饱和硫酸铵溶液：100ml蒸馏水中加硫酸铵至饱和。3、硫酸铵晶体：用研钵研成碎末。4、95%乙醇。5、醋酸铅溶液：1g醋酸铅溶于蒸馏水并稀释至100ml。6、硫酸铜溶液：1gCuSO4晶体溶于蒸馏水，稀释至100ml。7、氯化钠晶体。8、10%三氯乙酸溶液：10g三氯乙酸溶于蒸馏水中并稀释至100ml。9、饱和苦味酸溶液：100ml蒸馏水中加苦味酸至饱和。10、1%醋酸溶液。,四、实验步骤（一）蛋白质的盐析作用原理：向蛋白质中加入大量的中性盐（硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等），使蛋白质胶体颗粒脱水，破坏其水化层，同时它所带有的电荷亦被中性盐上所带的相反电荷的离子所中和。于是稳定因素被破坏，蛋白质聚集沉淀。盐析作用一般不使蛋白质变性。操作1、取试管1支，加蛋白液2ml，在加入饱和硫酸铵溶液2-4ml，摇匀静置数分钟，则有球蛋白析出。2、将上述混合液过滤。向滤液中逐渐加入少量固体硫酸铵（每次加入量约为米粒大小），边加边摇，直至饱和为止，此时析出为清蛋白。再加入少量蒸馏水，观察沉淀是否溶解。,（二）有机溶剂沉淀蛋白质原理：某些有机溶剂（如乙醇、甲醇、丙醇等），因引起蛋白质脱去水化层以及降低介电常数而增加带电质点间的相互作用，致使蛋白质颗粒容易凝聚而沉淀。操作：取一试管加蛋白液1ml，加入晶体氯化钠少许，待溶解后再加95%乙醇3ml,摇匀，观察现象。,（三）重金属盐与某些有机酸沉淀蛋白质原理：重金属离子（如Pb2+、Cu2+等）与蛋白质的羧基等结合生成不溶性的金属盐类而沉淀，同时蛋白质发生变性。某些有机酸的酸根则与蛋白质的自由氨基结合而沉淀。操作：取试管2支，各加蛋白液2ml，一支管中滴加1%醋酸铅溶液，另一支管中滴加1%硫酸铜溶液，至有沉淀产生。,（四）生物碱试剂沉淀蛋白质原理：植物体内具有显著生理作用的含氮碱性化合物成为生物碱。能沉淀生物碱或与其产生颜色反应的物质称为生物碱试剂。当溶液PH小于等电点时，蛋白质颗粒带正电荷，容易与生物碱试剂的负离子发生反应而沉淀。操作：1、取一支试管，加入蛋白液2ml及醋酸4-5滴，再加5%鞣酸数滴，观察现象。2、取一支试管，加入蛋白液2ml及醋酸4-5滴，再加饱和苦味酸数滴，观察现象。,实验五双缩脲法测定蛋白质的浓度,一、实验原理蛋白质在碱性溶液中可与CU2+形成紫色化合物，在一定浓度的范围内，蛋白质浓度与生成的紫色化合物颜色的深浅成正比，可用比色法测定。,二、实验仪器1、试管2、吸管3、容量瓶4、7220分光光度计,三、实验试剂1、1mg/ml卵清蛋白液：将1g卵清蛋白溶于0.9%NaCl溶液并稀释至1000ml.2、双缩脲试剂：将1.75gCuSO4.5H2O溶于约150ml蒸馏水，然后置于1000ml容量瓶中，加入300ml浓氨水、300ml冰冷的蒸馏水和200ml饱和氢氧化钠溶液，摇匀，室温放置2小时，再加蒸馏水至刻度，摇匀备用。,四、实验步骤1、标准曲线的绘制：取7支干燥的试管，按下表加入试剂：将上述溶液混合后，试管中即有紫红色出现，在540nm下测的各管的吸光度，以蛋白质浓度为横坐标，OD值为纵坐标作出标准曲线。2、样液的测定取未知浓度的蛋白质溶液3.0ml置试管中，加入双缩脲试剂2.0ml，混匀，测其540nm的吸光度，对照标准曲线求得未知液蛋白质浓度。,实验六氨基酸得纸层析法,一、原理以滤纸为支持物的层析法，称为纸层析法。纸层析所用展层剂大多由水和有机溶剂组成。展层时，水为静止相，他与滤纸纤维亲和力强；有机溶剂为流动相，它与滤纸纤维亲和力弱。有机溶剂在滤纸上又下向上移动的，称为上行法；有上向下移动的，称为下行法。将样品在滤纸上确定的原点处展层，由于样品中各种氨基酸在两相中不断进行分配，且他们的分离系数各不相同，所以不同的氨基酸随流动相移动的速率也不相同，于是各种氨基酸在滤纸上就相互分离出来，形成距原点不等的层析点。在一定条件下（室温、展层剂的组成、滤纸的质量、PH值等不变），不同的氨基酸有固定的移动速率（Rf值）Rf=原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离用混合氨基酸做样品时，如果只用一种溶剂展层，由于某些氨基酸的移动速率相同或相近，就不能将它们分开，为此，当用一种溶剂展层后，可将滤纸旋转90度，以第一次所的层析点为原点，在用另一溶剂展层，从而达到分离的目的。这种方法称为双向层析法。本试验主要介绍的是单向层析法。其中混合氨基酸有谷氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸组成。,二、实验仪器1、新华滤纸2、层析缸3、细线4、点样管5、橡皮筋6、电吹风7、喷雾器,三、实验试剂1、混合氨基酸2、展层剂：正丁醇：12%氨水：95%乙醇：蒸馏水=13：3：3：1（v:v）3、0.5%茚三酮无水丙酮溶液：0.5g茚三酮溶于100ml无水丙酮，贮于棕色瓶中,四、试验步骤1、取滤纸条一张，在一端打孔，系一根细线，在另一端3cm处用铅笔画一横线，中间画一圆点（原点）。2、取毛细管一支，吸取氨基酸混合液，在原点处点样，样点直径不宜超过5mm,每点一次用吹风机吹干，点23次为佳。3、点样后将滤纸放入层析缸中展层，注意点样线要高于层析液面，滤纸不要贴在层析缸璧上，展层23小时。4、取出滤纸，用铅笔记下溶剂前沿，然后用热风吹干（或烘箱60）烘干。5、均匀喷上0.5茚三酮无水丙酮液，注意使溶液不到流，不间断。6、用吹风机烘干，观察层析点，确定其几何中心。7、量取数值，计算各自的Rf值，与表中标准氨基酸Rf值比较，确定样品氨基酸种类。,实验七醋酸纤维薄膜电泳法分离牛血清蛋白,一、原理蛋白质是两性电解质。当PHPI时，蛋白质为负离子，在电场中向阳极移动；当PHPI时，蛋白质为正离子，在电场中向阴极移动。血清中含有数种蛋白质，在同一PH值时，因所带电荷不同，而在电场中的移动速度也不相同，故可用电泳法将其分离。本试验以牛血清为材料，醋酸纤维薄膜为支持物，通过点样、电泳、染色、脱色从而得到血清中蛋白质的分离图谱，再进行观察和定量分析。,二、实验仪器1、牛血清2、醋酸纤维薄膜3、镊子4、电泳仪5、电泳槽6、载玻片,三、实验试剂1、巴比妥巴比妥钠缓冲液（离子强度，PH8.6）：称取巴比妥1.66g和巴比妥钠12.76g，溶于蒸馏水并稀释至1000ml。用pH计较正后使用。2、染色液：氨基黑10B0.5g,甲醇50ml，冰乙酸10ml，蒸馏水40ml混匀即可。3、漂洗液：95%乙醇45ml，冰乙酸5ml和蒸馏水50ml混匀即可。,四、试验步骤1、准备：用镊子取薄膜一条，浸入缓冲液中，完全浸透后（大约3-5分钟），用镊子取出，将无光泽的一面向上，平放在干净滤纸上，将滤纸对折，吸取多余的缓冲液。2、点样：取载玻片一块，用点样管将血清均匀的涂在载玻片的一端面上，在薄膜一端1/3处点样。3、电泳：将薄膜平贴于放在电泳槽上并已浸透缓冲液的滤纸上，无光泽面要向下放置，点样端放在阴极，进行电泳。电泳条件：电压90-110V，电流0.4-0.6A,通电60分钟。4、染色：电泳完毕，将薄膜浸入染色液中5-10分钟，进行染色。5、漂洗：染色完毕，将薄膜取出，放入漂洗液中漂洗至背景无色，在浸入蒸馏水中。6、图谱观察：观察图谱，将各种血清蛋白质按实际比例大小绘于实验报告纸上。,一、原理聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳是根据被分离物质所带的电荷多少及其分子的大小，形状的不同，在电场的作用下，产生不同的速度而分离的方法。它具有分子筛效应、电荷效应、浓缩效应三重作用。在这三重效应的共同作用下使血清蛋白中不同的蛋白质分离开来。,实验八聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳法分离牛血清蛋白,二、实验仪器电泳仪电泳槽注射器长针头吸管培养皿,三、实验试剂,三羟甲基氨基甲烷（简称Tris）贮备液的配制：按下表配制A、B、C、D、E、F各贮备液，然后冷藏于4条件下，以防变质。染色液：0.05%氨基黑10B溶于7%醋酸溶液，或者用灵敏度高5倍考马斯亮蓝R250溶液染色。脱色液：7%醋酸溶液。电极缓冲液（pH8.3甘氨酸-Tris缓冲液）：甘氨酸28.8g，Tris0.6g加水定容至1000ml.示踪剂：0.01%溴酚蓝溶液。,四、实验步骤,1.制胶：取一支长10cm左右的玻璃管，在一端套上乳胶管和短玻棒。1）7%聚丙烯酰胺凝胶（PH8.9，分离胶）：将试剂按A:C:H2O:E=1：2：1：4比例混合于一烧杯中，用滴管将分离胶加入玻璃管至8cm高度，表面再加少量水覆盖，在日光灯下聚合20分钟左右，当有界面出现时，表明已经聚合，吸取分离胶表面的水分。,2）2.5%聚丙烯酰胺凝胶（pH6.7，分离胶）：将试剂按B:D:F:E=1：2：1：4比例混合于烧杯中，迅速将其用滴管加到分离胶上面。至玻璃管9厘米处（即加入1厘米高），在小心地加入一层薄水。然后胶管移至日光灯下放置20分钟左右，待第二次出现界面，表示聚合完成，除去表面水分。,2.安装胶管把玻璃管下端得橡皮冒除去（拔时用力不要过猛，以防使胶条受损），将胶管安装在电泳仪上。注意垂直，并要紧密，防止缓冲液从上槽漏下。先向各胶管中加满电极缓冲液，不要有气泡留存，在向下槽注入缓冲液，然后将胶管下降至下槽缓冲液内。3.加样1ml新鲜血清。用40%蔗糖溶液稀释10倍，加1ml0.1%溴酚蓝示踪剂混匀。用微量注射器或移液枪向胶管内加5-10ul样品液，注意微量注射器或移液枪头要插入胶管内加液。,4.电泳上槽连接负极，下槽连接正极，然后通电，先每管电流3mA电泳，当示踪剂进入分离胶时，电流增至每管5mA。当示踪剂移至胶管下端1cm处时，关闭电源，取出胶管。电泳大约2-3小时。5.剥胶取一只带长针头的注射器，灌满水，将针头从浓缩胶的一端小心的管壁与凝胶之间，转动胶管，并同时推动注射器，在针头向前推动时，注入蒸馏水，使胶条随水的压力及润滑作用从玻璃管中脱离。,6.染色将剥出的胶条于氨基黑10染色液或染色灵敏度高倍的考马斯亮蓝溶液中染色10分钟7.脱色将胶条自染色液中取出后，用水冲去表面的染料，置于7%醋酸溶液中浸洗脱色，经常换新溶液，直至背景几乎无色为止，约需2-3天的时间8.观察绘图将脱色胶条取出放于滤纸上，观察分离色带，将结果绘于实验报告纸上。,实验九胰蛋白酶活力测定,一、原理福林酚试剂中的磷钨酸和磷钼酸，在碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原为蓝色化合物（钨蓝和钼蓝）。蛋白质中含具酚基的氨基酸（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸），用胰蛋白酶水解蛋白底物，生成含酚基的氨基酸与福林酚试剂反应，生成蓝色化合物，在一定的范围内，蓝色化合物颜色的深浅与酶活力的大小成正比。,二、实验仪器试管7220分光光度计恒温水浴锅,三、实验试剂福林试剂B：见福林(Folin)-酚试剂法测定蛋白质的浓度部分0.55mol/L碳酸钠溶液：58.3g无水碳酸钠溶于蒸馏水，稀释并定容至1000ml010%三氯乙酸溶液0.2mol/L磷酸缓冲液：0.5%酪素溶液：称取0.5g酪素，以0.5mol/L氢氧化钠1ml湿润，再加少量0.2mol/L磷酸缓冲液稀释。在水浴中煮沸溶解，冷却，稀释并容至100ml，冷藏在冰箱里。,四、实验步骤,标准曲线的制作：精确称取烘干的酪氨酸50mg，加少量0.2mol/L盐酸溶解，定容至100ml，分别配成0-100ug/ml不同浓度溶液，不同浓度各取酪氨酸液1ml，加0.5%酪素2ml，于37水浴中反应15分钟，然后加入10%三氯乙酸3ml，离心或过滤除去沉淀，取清液1ml，加入0.55mol/L碳酸钠5ml，再加入福林试剂1ml，于37水浴中显色15分钟，测OD680。以光密度为纵坐标，酪氨酸的微克数为横坐标绘制标准曲线。,样品测定：取干燥的试管2支，按下表加入试剂,五、结果计算,酶活力：在37下每分钟水解酪素产生lug酪氨酸为一个活力单位。样品中含酶活力单位=A/15FA样品测定光密度查曲线得相当酪氨酸ug数F酶液稀释倍数,实验十、酵母RNA的提取及鉴定,一、原理酵母核酸中RNA含量较多，DNA含量则少于2%。RNA可溶于碱性溶液，当碱被中和后，可加乙醇使其沉淀，有此可得粗RNA制品。,二、实验仪器离心机水浴锅电炉烧杯量筒,三、实验试剂,干酵母粉0.2%氢氧化钠溶液：2g氢氧化钠溶于蒸馏水并稀释至1000ml。乙酸95%乙醇无水乙醚10%硫酸氨水5%硝酸银溶液：5g硝酸银溶于蒸馏水并稀释至100ml，贮于棕色瓶中。苔黑酚-三氯化铁溶液：将100mg苔黑酚溶于100ml浓盐酸中，再加入100mgFeCl3.6H2O。临用时配制。,四、实验步骤,1.RNA的提取：称取4g干酵母粉于100ml烧杯中，加入0.2%氢氧化钠溶液40ml，沸水浴加热30分钟，经常搅拌。然后加入乙酸数滴，使提取液呈酸性（石蕊试纸），离心10-15分钟（4000r.p.m）。取上清液，加入95%乙醇30ml，边加边搅，加毕，静止，待完全沉淀，过滤。滤渣先用95%乙醇洗2次，每次约10毫升，再用无水乙醚西2次，每次也约10ml。洗涤时可小心地用玻璃棒搅动沉淀。乙醚滤干后，滤渣即为粗RNA，可鉴定。,2.鉴定：取上述RNA约0.5g，加10%硫酸5ml,加热至沸12分钟，将RNA水解。取水解液0.5ml，加入苔黑酚-三氯化铁溶液1ml，加热至沸1分钟，观察颜色变化。水解液2ml，加入氨水2ml和5%硝酸银溶液1ml，观察是否产生絮状嘌呤银化合物。,实验十一DNA的定量测定-二苯胺法,一、原理DNA分子中的脱氧核糖基，在酸性溶液中变成-羟基-a-酮基戊糖，与二苯胺试剂作用生成蓝色化合物，在一定波长范围内，化合物蓝色的深浅与DNA的含量成比例关系，可用比色法测定。,二、实验仪器试管移液管7220分光光度计,三、实验试剂,1、DNA标准液（100ug/ml）：称取10mgDNA钠盐溶于5mol/l氢氧化钠溶液并稀释至100ml。2、二苯胺试剂：A液：称取纯二苯胺1.50g，溶于100ml冰乙酸，再加浓硫酸1.5ml。贮于棕色瓶中。B液：称取1.6ml乙醛溶于100ml蒸馏水中，临用时配制临用时，将20mlA液和0.1mlB液混合即可,四、试验步骤1.标准曲线的绘制取干燥的试管6支，编号，按下表加入试剂：,加毕，混匀，在60度水浴中保温45分钟，冷却后，在595nm波长下测吸光度，以吸光度对DNA浓度作标准曲线。,2.样品测定吸取DNA样液1ml，加入二苯胺溶液2.0ml,加毕，混匀，在60度水浴中保温45分钟，冷却后，在595nm波长下测吸光度，根据所测得的吸光度对照标准曲线求得DNA的质量。五、结果计算按下式计算样品中DNA百分含量：DNA%=样液中测的DNA量/样液中所含样品量*100%,实验十二维生素C的定量测定（2，6-二氯靛酚滴定法）,一、原理维生素c又称为抗坏血酸，其还原型能还原染料2，6-二氯靛酚钠盐，本身则氧化成脱氢抗坏血酸。在酸性溶液中，2，6-二氯靛酚成红色，被还原后变为无色。因此可用2，6-二氯靛酚滴定样品中含有的维生素C，当样品中的维生素C被完全还原后，在滴加过量的2，6-二氯靛酚，溶液变为淡红色，即为终点。如无其他杂质干扰，则样品液所还原的2，6-二氯靛酚的量与样品中所含有维生素C的量成正比。,二、实验仪器新鲜水果吸管容量瓶滴定装置锥形瓶研钵漏斗,三、实验试剂1、2%草酸溶液：草酸2g，溶于100ml蒸馏水。2、1%草酸溶液：草酸1g，溶于100ml蒸馏水。3、标准维生素C液：准确称取10.0mg维生素C，溶于1%草酸溶液，并稀释至100ml，贮于棕色瓶中，冷藏，最好临用时配制。此溶液浓度0.1mg/ml.4、0.1%2，6-二氯靛酚溶液：称取500mg2，6-二氯靛酚溶于300ml含有104mg碳酸氢钠的热水中，冷却，加蒸馏水并稀释至500ml，滤去不溶物，贮于棕色瓶中，冷藏。,四、实验步骤,1.样品中抗坏血酸的提取：将水果用水洗干净，用滤纸吸取表面水分。称取2.0g，加2%草酸试剂100ml置组织捣碎机中打成浆状。称取浆状物5.0g，倒入50ml容量瓶中，用2%草酸溶液稀释并定容，混匀，静止10分钟，过滤（最初数毫升滤液弃去），滤液备用。,2.滴定1)标准液的滴定：准确吸取标准抗坏血酸溶液1.0ml于100ml锥形瓶中，加9ml1%草酸溶液，用2，6-二氯靛酚滴定至淡红色。滴定终点要保持15秒钟。有所用2，6-二氯靛酚的体积算出1ml染料相当于多少毫克抗坏血酸。2)样品液的滴定：准确吸取滤液两份，每份10ml，分别放入两个100ml锥形瓶中，滴定方法同上。,五、结果计算按下式计算100mg样品中含抗坏血酸的毫克数：m=V*T/W*100V=滴定时所用染料ml数T=每毫升染料氧化抗坏血酸质量W=10ml样液相当于含样品的质量数,综合实验一葡糖1磷酸的制备及其纯度测定,在酸性条件下用2倍体积乙醇沉淀无机磷酸盐等杂质，然后在碱性条件下(pH8.4)，得G-1-P钾盐沉淀。精制后通过测定有机磷含量来计算纯度。,淀粉在磷酸盐存在下经过磷酸化酶的作用，分解生成磷酸己糖，其第一个产物为葡糖-1-磷酸（glucose-1-phosphate,简称G-1-P）。,保温后，将混合物加热煮沸，使蛋白质变性，破坏磷酸化酶以终止酶促反应。,实验原理,1、磷酸化酶的制备,滤液,马铃薯,组织匀浆器,纱布过滤,2、淀粉磷酸盐溶液的制备,1）称取6g磷酸二氢钾、7.78g磷酸氢二钾，加70ml蒸馏水，煮沸。,2）称取4g可溶性淀粉，加10ml蒸馏水，搅拌。,3）剧烈搅拌下，将淀粉呈细流状加到上述磷酸盐溶液中。,4）继续加热5min。此时溶液为米黄色透明，冰浴中冷却。,6g磷酸二氢钾、7.78g磷酸氢二钾,70ml蒸馏水,4g可溶性淀粉,10ml蒸馏水,3、保温,酶液,淀粉磷酸盐溶液,1）酶液将与淀粉磷酸盐溶液混合，弃去泡沫，,2）加少量甲苯，在溶液表面成一薄层。,甲苯,3）于33保温24h,4）将保温液表层泡沫污物弃去，用碘碘化钾试剂进行碘反应检验，不显蓝色则进行以下操作。,33保温24h,4、处理保温液,1）采用分批煮沸的方法，使每次煮沸厚度为1cm左右将保温液煮沸。要在1min内完全沸腾，继续加热3min,2）冰浴中快速冷却，1min内冷却至室温。,3）将上清液用布氏漏斗抽滤，沉淀3000r/min离心5min后，再将上清过滤,3000r/min离心5min,冰浴,4）滤液加2倍体积95乙醇，迅速搅拌，磷酸调pH至4.2（在冰浴中操作）。此时有白色磷酸盐沉淀。,5）半小时后，在布氏漏斗上通过两层滤纸抽滤。,6）将滤液在低温下用饱和KOH溶液调pH至8.4，可得葡糖1磷酸二钾盐沉淀。静置24个小时,滤液,2倍体积95乙醇,磷酸调pH至4.2,饱和KOH溶液调pH至8.4,静置24个小时,7)过滤，即为粗产品,饱和KOH溶液调pH至8.4,静置,5、产品的精制,1）将抽干的粗产品用少量蒸馏水溶解，再加镁铵溶液10ml左右，至沉淀不再溶解。抽滤去除沉淀（主要为磷酸铵镁）。,粗产品,蒸馏水溶解,镁铵溶液10ml,2）向清液中加入2倍体积95乙醇，用10mol/L盐酸调pH至4，滤去沉淀（无机磷酸盐）。,滤液,2倍体积95乙醇,10mol/L盐酸调pH至4.2,3）清液用饱和氢氧化钾溶液调至pH值8.4，静置,4）抽滤即得精产品，纯度不低于70。干燥,6、定磷曲线的制定,准确吸取磷标准使用液0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL(相当于含磷量0、5、10、20、30、40、50g),分别置于20mL具塞试管中。各管用蒸馏水补足到5ml，分别加3ml定磷试剂，45恒温水浴保温25min。在分光光度计660nm波长处测定吸光度。以测出的吸光度对磷含量绘制标准曲线。,7、葡糖1磷酸纯度检测,1)称取7.44mg1G1P产品，溶于水，定容至10ml。,2)取2只试管，各加0.2ml（有待实验进一步确定）产品溶液。,3)管1加1ml2mol/L盐酸，100加热水解10min（有机磷全部溶解）。取出冷却，加12滴酚酞试剂，KOH调pH至红色,4)管2以水代替盐酸，不加热。,5)另取一空白管3，不加样品,管1,管2,管3,盐酸,水,不加样品,样品,样品,样品,水,100加热水解10min,三管中溶液体积用水补足到5ml。加3ml定磷试剂，45恒温水浴保温25min。660nm波长测光吸收。从定磷标准上查出样品管及对照管的磷量，然后计算产品的含量百分数。产品含量（样品管磷量对照管磷量）稀释倍数/0.06607100,综合实验二动物肝脏中DNA的提取与含量测定,在制备核酸时应防止过酸、过碱及其它能引起核酸降解的因素的作用。全部操作过程应在低温下（4）进行，必要时还要加入酶抑制剂。如柠檬酸、氰化物、砷酸盐、乙二胺四乙酸（EDTA）等可以抑制DNA酶活性，SDS或苯酚等蛋白变性剂也可使核酸降解酶破坏。,一、目的学习和掌握用浓盐法从动物组织中提取DNA的原理和技术,二、原理核酸和蛋白质在生物体中以核蛋白的形式存在，其中DNA主要存在于细胞核中，RNA主要存在于核仁及胞质中,DNA核蛋白能溶于水及高浓度的盐溶液（如1mol/LNaCl）,在0.14mol/L的盐溶液中溶解度降低,而RNA核蛋白则溶于0.14mol/L盐溶液，,可利用不同浓度的氯化钠溶液，将脱氧核糖蛋白和核糖蛋白从样品中分别抽提出来,脱氧核糖蛋白用SDS（十二烷基硫酸钠）处理，DNA即与蛋白质分开,可用氯仿异戊醇将蛋白质沉淀除去，而DNA则溶解于溶液中。,向含有DNA的水相中加入冷乙醇，DNA即呈纤维状沉淀出来。,1、称取肝脏8g，在冰浴中用研钵磨碎。,2、加约20ml0.1mol/LNaCl-0.05mol/L柠檬酸钠缓冲液，,3、4000r/min离心10min。,4、沉淀再研磨一下，加25ml缓冲液，4000r/min离心20min。,5、取沉淀，加入40ml0.1mol/LNaCl-0.05mol/L柠檬酸钠缓冲液、20mlCHCl3-异戊醇混合液、4ml5SDS使其终浓度为0.41，冰浴中，在摇床上振摇30min。,40ml0.1mol/LNaCl-0.05mol/L柠檬酸钠缓冲液,20mlCHCl3-异戊醇混合液,4ml5SDS,摇床上振摇30min,6、向溶液中缓慢加固体NaCl，使其终浓度为1mol/L（约3.6g）。将混合液在3500r/min离心20min。7、取上清，加入等体积冷95乙醇，边加边用玻璃棒慢慢搅动，将缠绕在玻璃棒上的凝胶状物用滤纸吸取多余乙醇，即得DNA粗品。,NaCl（约3.6g）,3500r/min离心20min。,取上清，加入等体积冷95乙醇,8、提纯将上述所得的DNA粗品置于20ml0.015mol/LNaCl0.0015mol/L柠檬酸三钠溶液中,9、加入1倍体积的氯仿异戊醇混合液，振摇10min，离心（4000r/min，10min）。,.,0.015mol/LNaCl0.0015mol/L柠檬酸三钠溶液,氯仿异戊醇混合液,4000r/min，10min,DNA粗品,10、倾出上层液（沉淀弃去），加入1.5倍体积95乙醇，DNA即沉淀析出。,11、离心，弃去上清液，沉淀（粗DNA）按本操作步骤重复一次。最后所得沉淀用无水乙醇洗涤2次，真空干燥。,95乙醇,4000r/min，10min,弃上清,倾出上层液（沉淀弃去）,粗DNA,1、标准曲线的绘制按下表加入各种试剂，混匀，于60恒温水浴保温45min,2、冷却后，在595nm波长下，于722型分光光度计上比色测定，以吸广度对DNA浓度作图，制定标准曲线。,DNA含量的测定,3、计算100g猪肝中DNA含量：m1/m2100式中：DNA的质量分数（）；m1：样液中测得的DNA的质量（g）；m2：样液中所含样品的质量（g）。,实验十酶的专一性研究,一、原理用不同的醇作底物，观察醇脱氢酶的专一性。根据NADH对340nm波长紫外线有最大吸收的特性，可用OD340nm表示酶活力。每毫克酶蛋白有多少酶活力单位成为酶的比活力。,二、实验仪器,吸管试管7220分光光度计TU-1800紫外分光光度计,1、3mol/L甲醇溶液：120ml无水甲醇加蒸馏水稀释至1000ml.2、3mol/L乙醇溶液：174.6ml无水乙醇加蒸馏水稀释至1000ml。3、3mol/L正丙醇溶液：225ml正丙醇加蒸馏水稀释至1000ml。4、0.01mol/L磷酸氢二钾溶液：称取1.74gK2HPO4溶于蒸馏水中，稀释并定容至1000ml。5、0.06mol/L焦磷酸钠溶液：称取22.56g焦磷酸钠溶于蒸馏水中，稀释并定容至1000ml。6、0.0015mol/LNAD溶液：称取NAD0.0995g溶于蒸馏水并稀释至1000ml。7、醇脱氢酶溶液：用0.01mol/L磷酸氢二钾溶液溶解至每毫升含200-1000活力单位。,三、实验试剂,8、Folin-酚试剂B：将100g钨酸钠、25g钼酸钠、700ml蒸馏水、50ml85%磷酸继100ml浓盐酸置于1500ml的磨口圆底烧瓶中，充分混匀后，接上磨口冷凝管，回馏10小时，再加入硫酸锂150g，蒸馏水50ml及液溴数滴，开口煮沸15分钟，在通风橱内驱除过量的溴。冷却，稀释至1000ml，过滤，滤液成微绿色，贮于棕色瓶中。临用时，用1mol/l的氢氧化钠