外源基因的表达.ppt

第六章外源基因的表达,基因工程技术的核心是基因表达技术。基因表达是指结构基因在调控序列的作用下转录成mRNA，经加工后在核糖体的协助下又转译出相应的基因产物蛋白质，再在受体细胞环境中经修饰而显示出相应的功能。从基因到有功能的产物这整个转录、转译及所有的加工过程就是基因表达的过程，它是在一系列酶和调控序列的共同作用下完成的。,基因重组的主要目的是要使目的基因在某一细胞中能得到高效表达，即产生人们所需要的高产目的的基因产物，如蛋白质、多肽类生物药物。,目前已构建出了多种基因表达系统，包括原核生物表达系统和真核生物表达系统，不同的表达系统具有各自的特点。在原核生物中，基因表达是以操纵子的形式进行的。当操纵子的调节基因与RNA聚合酶作用时，结构基因则开始转录成相应的mRNA，与此同时，mRNA立即与核糖体结合转译出相应的多肽或蛋白质，转录完毕时转译也完成，随之mRNA也被水解掉。在真核生物基因表达系统中，转录是在核内进行的，先生成hnRNA，再加工去掉内含子，外显子相连接，并修饰5和3末端后才形成mRNA。而mRNA只能在细胞浆中的核糖体上转译成多肽或蛋白质，再经过加工、糖化、形成高级结构。,基因表达在原核生物与真核生物中的差别？,6.1基因表达的机制,6.1.1外源基因的起始转录,外源基因的起始转录是基因表达的关键步骤。转录起始的速率是基因表达的限速步骤。选择可调控的启动子和相关的调控序列，是构建一个表达系统首先要考虑的问题。,原核生物启动子,诱导型启动子：,组成型启动子：,如lac、trp、PR、PL、tac等的启动子,如T7噬菌体的启动子,真核生物启动子也可分为诱导型和组成型等类型。,6.1.2mRNA的延伸与稳定,外源基因起始转录后，保持mRNA的有效延伸、终止及稳定存在是外源基因有效表达的关键。,一方面，要防止因转录物内的衰减和非特异性终止而诱发的mRNA转录提前终止的现象；另一方面，又要存在正常的转录终止序列以防止产生不必要的转录产物，使mRNA的长度限制在一定的范围内，从而增加外源基因表达的稳定性。,6.1.3外源基因mRNA的有效翻译,外源基因mRNA有效翻译必须考虑的基本原则：,AUG(ATG)是首选的起始密码子。SD序列为与核糖体16SrRNA互补结合的位点，该序列至少含有AGGAGG序列中的4个碱基。SD序列与翻译起始密码子之间的距离为39个碱基。在翻译起始区周围序列不易形成明显的二级结构。,不同基因组使用密码子具有选择性。,主密码子（majorcodon）,罕用密码子（rarecodon）,如果外源基因mRNA的主密码子与受体细胞基因组的主密码子相同或接近，则该基因表达的效率就高；反之，若外源基因含有较多的罕用密码子，其表达效率就低。,6.1.4表达蛋白在细胞中的稳定性,避免外源基因表达蛋白降解的对策：,构建融合蛋白表达系统,构建分泌蛋白表达系统,构建包涵体表达系统,选择蛋白水解酶基因缺陷型的受体系统,6.1.5目的基因沉默,基因沉默的作用机制,位置效应的基因沉默：,转录水平的基因沉默：,转录后水平的基因沉默：,是指基因在基因组中的位置对其表达的影响,是在DNA水平上的基因调控,是在RNA水平上的基因调控,6.2基因表达的调控元件,6.2.1启动子,启动子（promoter）：是一段提供RNA聚合酶识别和结合的DNA序列，它位于基因的上游。RNA聚合酶正是通过与它的结合而启动基因的转录。原核基因启动子具有10和35序列等结构元件，而真核基因启动子则具有TATA盒及上游元件等特征结构。,*启动子的特征,序列特异性方向性位置特性种属特异性,6.2.1.1原核生物的启动子,转录起始位点：大多数细菌启动子转录起始区的序列为CAT，转录从第二个碱基开始，该碱基为嘌呤碱基（A/G）。,Pribnow框：10bp处的TATA区，又称10序列区。,Sextama框：35bp处的TTGACA区，又称35区。,间隔区：内部无明显的保守性，其序列的碱基组成对启动子的功能不十分重要，但其长度却是影响启动子功能的重要因素。,Theprokaryoticpromoter,ThesequenceofDNAneededforRNApolymerasetobindtothetemplateandaccomplishtheinitiationreaction.,6.2.1.1真核生物的启动子,型：rRNA基因启动子,型：mRNA基因启动子,型：tRNA基因启动子,型启动子,所属基因编码的产物为rRNA前体，经剪切加工后成为各种成熟的rRNA分子。,人体细胞型启动子,核心启动子：,上游控制元件（UCE）：,紧邻转录起始位点，可以启动基因的转录。,位于起始位点上游180190bp处，它可以大幅度增强转录效率。,型启动子,型启动子所属基因绝大多数编码蛋白质。,TATA框（Hogness框）：富含AT的保守序列区，它与DNA双链的解链有关，并决定转录起始点的选择。其中心点位于转录起始点上游2030bp的位置。,CAAT框：位于转录起始位点上游75bp处，与RNA聚合酶的结合有关。,GC框：位于转录起始位点上游100300bp处，与转录因子的结合有关。,启动子基本区,转录起始位点,辅助区,型启动子,内启动子：,外启动子：,位于转录起始位点的下游，如tRNA和5SRNA的启动子。,位于转录起始位点的上游，缺乏相应的内部序列，如脊椎动物U6核小RNA和7SKRNA启动子，结构类似于真核生物型启动子。,6.2.1.3启动子与转录启动,大肠杆菌RNA聚合酶的亚基成分,RNA聚合酶：,核心酶(2)亚基全酶(2),sfactor:,6.2.1.4启动子的分离,随机克隆法,聚合酶保护法,过滤膜结合法,PCR扩增法,6.2.2增强子,增强子（enhancer）：是能够增强启动子转录活性的DNA顺式作用序列，又称强化子。,增强子的特性：,双向性。重复序列。增强子行使功能与所处的位置无关。特异性。增强子不仅与同源基因相连时有调控功能，与异源基因相连时也有功能。,6.2.3终止子,本征终止子：不需要其他蛋白辅助因子便可在特殊的RNA结构区内实现终止作用。,依赖终止信号的终止子：要依赖专一的蛋白质辅助因子。,本征终止子,两大特征,发夹结构(茎环结构)：延缓RNA聚合酶的运动，不终止RNA的合成，但为转录终止创造条件。,寡聚U组成的尾部：转录的终止信号。,依赖型终止子,终止位点上游5090bp区域，是因子的识别位点。因子依赖型终止子也能形成茎环结构，但茎环的GC含量较低，因此RNA聚合酶在此移动的速度减慢，但停留时间较短，并且茎环结构的下游没有寡聚U结构，RNA聚合酶只能在因子的协助下才能有效终止转录。,因子是一个相对分子量为2.0105的六聚体蛋白质分子，它能水解各种核苷三磷酸，实际上是一种NTP酶。由于它催化NTP的水解，因子能促使新生的RNA链从三元转录复合物中解离出来，从而终止转录。,在RNA合成起始以后，因子即附着在新生的RNA链上，靠ATP水解产生的能量，沿着53方向朝RNA聚合酶移动，到达RNA的3OH端后取代了暂停在终止位点上的RNA聚合酶，并从模板和酶上释放RNA，完成转录过程。终止过程需要消耗能量，所以，因子有终止转录和核苷三磷酸酶两种功能。,6.2.4衰减子,衰减子（attenuator）：是位于mRNA分子前导序列中的一段控制蛋白质合成起始速率的调节区，亦即发生弱化作用的转录终止信号序列，又称弱化子。,衰减子最先发现于大肠杆菌色氨酸（trp）操纵子中。,trp前导区的4个片段（1、2、3、4）能以两种不同的方式进行碱基配对，有时以1-2和3-4配对，有时只以2-3配对。在前导肽基因中有两个相邻的色氨酸密码子，所以前导肽的翻译对tRNATrp的浓度很敏感。当培养基中trp浓度很低时，负载有trp的tRNATrp也就少，这样翻译通过两个相邻trp密码子的速度就很慢，当4区被转录完成时，核糖体才进行到1区（或停留在两个相邻的trp密码子处），这时前导区结构是2-3配对，不形成3-4配对的终止结构，所以转录可继续进行，直到trp操纵子中的结构基因全部转录。而当trp浓度高时，核糖体可顺利通过两个相邻的trp密码子，在4区被转录之前，核糖体就到达2区，这样使2-3不能配对，3-4区可自由配对形成茎环状终止子结构，终止转录。所以，弱化子对RNA聚合酶的影响依赖于前导肽翻译中核糖体所处的位置。,LowTrp,HighTrp,6.2.5绝缘子,绝缘子（insulator）：既是基因表达的调控元件，也是一种边界元件；它能阻止邻近的调控元件对其所界定基因的启动子起增强或抑制作用；绝缘子抑制增强子的功能是有极性的。它只能抑制处于绝缘子所在边界另一侧的增强子的作用，而对处于同一结构域的增强子没有抑制作用；绝缘子对基因表达的调控是一个非常复杂的过程，它是通过细胞内特定的蛋白质因子相互作用而产生调控效应的。,6.2.6反义子,反义RNA（antisenceRNA）：同某种天然mRNA反向互补的RNA分子称为反义RNA，它是由双链DNA中的无意义链转录产生的，可以用来阻止被其转化的细胞中存在的与之互补mRNA的转译活性。现在编码反义RNA的基因已在基因工程中得到应用，此项技术特称为反义技术学（antisencetechology）。,反义子：编码反义RNA的DNA称为反义子。,反义子在DNA的复制、转录和翻译三个水平对基因的表达起调节作用，其中以对蛋白质合成的抑制最为普遍。,复制水平的调节,直接抑制反义RNA与引物RNA前体互补，使得引物RNA无法与DNA模板结合，进而抑制DNA复制的频率。间接抑制反义RNA通过阻断复制激活蛋白因子的合成而间接抑制DNA的复制。,转录水平的调节,反义RNA通过与mRNA的5端互补结合而阻止转录的延伸；作用于mRNA的poly(A)区域，抑制mRNA的成熟及其运输；与真核生物mRNA结合而影响其剪切加工。,翻译水平的调节,通过与mRNA的5端SD序列结合，改变其空间构象，从而影响核糖体在mRNA上的定位；通过与mRNA的5端编码区（如起始密码）结合，直接抑制翻译的起始。,SD序列（SDsequence）：系Shine-Dalgarno序列的简称，此为纪念最早发现该序列的研究者而命名的。它是原核生物中核糖体的结合位点，亦即存在于mRNA分子AUG起始密码子之前的多聚嘌呤序列AGGAGGG的部分或全部，可与16SrRNA的3-末端序列互补。SD序列在核糖体同mRNA的结合过程中起重要作用。,6.3外源基因表达系统,外源基因表达系统：泛指目的基因与表达载体重组后，导入合适的受体细胞，并能在其中有效表达，产生目的基因产物（目的蛋白）。,外源基因表达系统,基因表达载体,受体细胞,基因表达系统,原核生物基因表达系统：如大肠杆菌表达系统、芽孢杆菌表达系统、链霉菌表达系统、蓝藻表达系统等。,真核生物基因表达系统：如酵母表达系统、植物细胞表达系统、昆虫细胞表达系统、哺乳动物细胞表达系统等。,原核生物作为基因表达系统的受体细胞所具有的特点：,原核生物大多数为单细胞异养，生长快，代谢易于控制，可通过发酵迅速获得大量基因表达产物。基因组结构简单，便于基因操作和分析。多数原核生物细胞内含有质粒或噬菌体，便于构建相应的表达载体。生理代谢途径及基因表达调控机制比较清楚。不具备真核生物的蛋白质加工系统，表达产物无特定的空间构相。内源蛋白酶会降解表达的外源蛋白，造成表达产物的不稳定。,6.3.1大肠杆菌基因表达系统,大肠杆菌是一种革兰氏阴性细菌，其遗传背景清楚，目标基因表达的水平高，培养周期短。目前大多数外源基因都是以大肠杆菌为受体系统进行表达的，是目前应用最广泛的基因表达系统。,与其它表达系统相比，大肠杆菌表达系统所具有的优越性：,经过长期研究，人们已经掌握了十分丰富的有关大肠杆菌基础生物学、遗传学以及分子生物学等方面的背景知识，特别是对其基因表达调控的分子机理有了深刻的了解；大肠杆菌已被发展成为一种安全的基因工程实验体系，拥有各类适用的寄主菌株和不同类型的载体系列；实验已经证明，许多克隆的真核基因，例如抑制生长素基因和胰岛素基因等，都可以在大肠杆菌细胞中实现有效的、高水平的表达；大肠杆菌培养方便、操作简单、成本低廉，易于进行工业化批量生产。,6.3.1.1大肠杆菌基因表达载体,大肠杆菌基因表达载体可分为3个系统：,DNA复制及重组载体的选择系统,外源目的基因的转录系统,蛋白质的翻译系统,（1）DNA复制及重组载体的选择系统,复制子,复制子：是一段包含复制起始位点（ori）和反式因子作用区在内的DNA片段。,大肠杆菌基因表达载体一般是质粒表达载体，含有能在大肠杆菌中有效复制的复制子。,常见的复制子,pMB1、p15A、ColE1:松弛复制型，每细胞质粒拷贝数1020个。,pSC101:严谨复制型，每细胞质粒拷贝数少于5个。,在同一大肠杆菌细胞内，含同一类型复制子的不同质粒载体不能共存，但含不同类型复制子的不同质粒载体则可以共存于同一细胞中。,选择标记,目的：使转化体产生新的表型，将转化了的细胞从大量的菌群中分离出来。,微生物表型选择标记,显性标记,营养缺陷型标记,在基因克隆中采用的质粒载体的选择标记记号，包括有新陈代谢特性、对大肠杆菌素E1的免疫性，以及抗菌素抗性等多种。而绝大多数的质粒载体都是使用抗菌素抗性记号，并且主要集中在氨苄青霉素抗性、四环素抗性、链霉素抗性、氯霉素抗性以及卡那霉素抗性等少数几种抗菌素抗性记号上。其原因一方面是由于许多质粒本身就是带有抗菌素抗性基因的抗药性R因子；另一方面则是因为抗菌素抗性记号具有便于操作、易于选择等优点。,大肠杆菌表达载体上一般都带有一个以上的抗生素抗性基因。表达载体上的抗药性基因赋予宿主特定的抗药性，使其能在抗生素的培养条件下正常生长。这样就可以筛除掉不含载体的宿主，同时保证载体在宿主中的稳定存在。在构建大肠杆菌表达载体的过程中，选择何种抗生素抗性基因，还必须考虑到是否会对特定宿主细胞的代谢活动产生影响。,（2）外源目的基因的转录系统,这一系统包括启动子、抑制物基因和转录终止子。启动子和终止子因宿主的不同而有差别，往往在不同的宿主中表达的效率也不一样，特别是原核生物和真核生物宿主间完全不同，相互间不能通用。,启动子,启动子（promotor）：是一段能被宿主RNA聚合酶特异性识别和结合并指导目的基因转录的DNA序列，是基因表达调控的重要元件。,外源目的基因转录的起始是基因表达的关键步骤。选择可调控的强启动子是构建一个理想的表达系统首先要考虑的问题。,启动子位于基因的上游，其序列的长度因生物的种类而异。当RNA聚合酶定位并结合到启动子序列上时，便可启动基因的转录。启动子具有序列特异性、启动的方向性、作用位点的特异性和种属特异性等特征。在大肠杆菌细胞中大多数基因的启动子与转录起始位点间的距离为69bp，但对于要表达的外源基因来说，启动子与转录起始位点的最佳距离还有待实验来确定。,外源基因在强启动子的控制下容易发生转录过头的现象，形成长短不一的mRNA混合物，而过长的转录产物不仅会影响到mRNA的翻译效率，同时也会使外源基因的转录速度大大降低。因此，在构建表达载体的时候一般采用强的启动子和强的终止子，以达到高效表达的目的。,抑制物基因,抑制物基因的产物是一种控制启动子功能的蛋白质，对启动子的起始转录功能产生抑制作用。在适当的诱导条件下可使抑制物失活，启动子功能重新恢复。,通过抑制物基因产物可使目的基因在宿主培养到最佳状态时进行转录，从而保证转录的有效进行，特别是表达产物对宿主有害时，控制转录的时机尤其重要。理想的可调控的启动子在细胞生长的初期往往不表达或低水平表达，而当细胞增殖到一定的密度后，在某种特定的诱导因子（如光、温度或化学药物等）的诱导下，RNA聚合酶才开始启动转录，合成mRNA。,转录终止子,转录终止子（terminator）：是一段终止RNA聚合酶转录的DNA序列。,转录终止子可分为本征终止子和依赖终止信号的终止子两类。,转录终止子的功能不同于启动子，但它对基因的正常表达同样有着重要的意义。一方面，它使转录在目的基因之后立即停止，避免多余的转录以节省宿主内RNA的合成底物，提高目的基因的转录量；另一方面，正常转录终止子的存在能够防止产生不必要的转录产物，有效地控制目的基因mRNA的长度，提高mRNA的稳定性，避免质粒上其它基因的异常表达。,（3）蛋白质的翻译系统,在原核生物中影响翻译起始的因素有：起始密码子、核糖体结合位点（SD序列）、起始密码子于SD序列之间的距离和碱基组成、mRNA的二级结构、mRNA上游的5端非翻译序列和蛋白编码区的5端序列等。,蛋白质的翻译系统,核糖体结合位点（SD序列）,翻译起始密码子,翻译终止密码子,核糖体结合位点,核糖体结合位点：是指原核基因转录起始位点下游的一段DNA序列，即Shine-Dalgarno序列（简称SD序列）。SD序列与核糖体16SrRNA特异配对而与宿主核糖体结合，它对mRNA的翻译起着决定性的作用。,核糖体与mRNA的结合程度越强，翻译的起始效率越高，而核糖体与mRNA的结合程度主要取决于SD序列与核糖体16SrRNA碱基的互补性，因此，在构建表达载体时，要尽可能使SD序列与16SrRNA序列互补配对。影响mRNA翻译效率的因素：包括SD序列、翻译的起始密码子和SD序列与翻译起始密码子之间的距离和碱基组成等。大肠杆菌SD序列的碱基组成为5AGGAGG3,其中以GGAG四个碱基最为重要，这四个碱基中的任何一个发生突变都会引起翻译效率的大幅度下降。,SD序列与起始密码子之间的距离对保证准确和高效翻译也很重要。SD序列与起始密码子之间的距离一般为68bp，多数情况下为7bp，此间的碱基多一个或少一个都会影响翻译的起始效率。SD序列与起始密码子之间的碱基组成也影响翻译的起始效率。研究表明，SD序列后面的碱基为AAAA或UUUU时，翻译的起始效率最高，而当序列为CCCC或GGGG时，翻译的起始效率分别为最高值的50和25。有的载体的启动子后接有SD序列，而另一些载体的启动子后没有接SD序列，那么则需要目的基因上游带进SD序列。若在大肠杆菌中表达真核基因或本身所含核糖体结合位点较弱的原核基因，则必须从外部同时提供启动子和有效的核糖体结位点。,翻译起始密码子,起始密码子是翻译的起始位点，通常为AUG（ATG），编码甲硫氨酸（MET），是首选的起始密码子。也有极少数生物利用其它密码子作为翻译的起始位点，如GUG、UUG等。,翻译终止密码子,翻译终止密码子与核糖体相遇时，能使核糖体从mRNA模板上脱落下来，终止蛋白质的翻译过程。在大肠杆菌中，合成多肽链的释放由RF1和RF2两个释放因子所调控，RF1识别终止密码UAA和UAG，而RF2识别终止密码UAA和UGA，由于UAA同时为两个释放因子所识别，一般被选作翻译的终止密码。,在实际应用中，为了保证翻译的有效终止，通常将几个终止密码串连在一起。具报道，在大肠杆菌中以四个核苷酸组成的顺式序列UAAU作为终止密码，可有效地终止多肽链的合成。,不同生物基因组甚至是同种生物不同蛋白质的基因，所用的密码子都具有一定的选择性。有的密码子在一种基因组中使用的频率高，被称为主密码子，而在另一种基因组中使用的频率较低，被称为罕用密码子。如果外源目的基因mRNA的主密码子和受体细胞基因组的主密码子相同或接近，则该基因的表达效率就高；反之，若外源基因含有较多的罕用密码子，其表达水平就低。因此，在构建大肠杆菌表达载体时，要考虑所表达基因的种类和性质，或对外源基因的碱基进行适当置换，或对克隆载体上的调控序列进行适当的调整。,6.3.1.2宿主菌,重组异源蛋白在大肠杆菌中不稳定的原因：,大肠杆菌缺乏复杂的翻译后加工和蛋白质折叠系统；大肠杆菌不具备类似真核细胞的亚细胞结构和表达产物稳定因子；大量的异源重组蛋白在大肠杆菌细胞中形成高浓度的微环境，导致蛋白质分子之间的作用增强。,常见的大肠杆菌基因表达受体菌株,6.3.1.3常见的大肠杆菌表达系统,Lac和Tac表达系统：是以lac操纵子调控机制为基础设计和构建的表达系统。,PL和PR表达系统：是以噬菌体早期转录启动子PL和PR构建的。,T7表达系统：是利用大肠杆菌T7噬菌体转录系统元件构建的表达系统，它具有很高的表达能力。,6.3.1.4外源基因在大肠杆菌表达的形式,表达形式：不溶性蛋白和可溶性蛋白两种。,包涵体蛋白,包涵体：在一定条件下，外源基因的表达产物在大肠杆菌中积累并致密地集中在一起形成无膜的裸露结构，这种结构称为包涵体。,包涵体存在部位：细胞质、细胞周质,包涵体的组成,蛋白质,非蛋白质,外源基因的表达产物：占大部分，具有正确的氨基酸序列，但空间构相错误，因而包涵体蛋白一般没有生物学活性。,受体细胞本身的表达产物：如RNA聚合酶、核糖核蛋白、外膜蛋白以及表达载体编码的蛋白等。,：包括DNA、RNA和脂多糖等。,包涵体形成的本质是细胞内蛋白质的不断聚集，主要包括三个方面：,折叠状态的蛋白质的聚集作用；非折叠状态的蛋白质的聚集作用；蛋白质折叠中间体的作用。,融合蛋白,融合蛋白将外源蛋白基因与受体菌自身蛋白基因重组在一起，但不改变两个基因的阅读框，以这种方式表达的蛋白称为融合蛋白。,*融合蛋白与单独表达的外源蛋白相比具有以下优点：,稳定性好；表达效率高；较易于分离纯化。,寡聚型外源蛋白,在构建外源蛋白表达载体时，将多个外源目的蛋白基因串连在一起，克隆在质粒载体上，以这种方式表达的外源蛋白称为寡聚型外源蛋白。,外源基因多分子线性重组的方式通常有三种：,多表达单元的重组：每个表达单元都含独立的启动子、终止子、SD序列、起始密码和终止密码，形成独立转录与串连翻译的表达单元。表达的外源蛋白不需经过裂解处理。该方式适合表达相对分子质量较大的蛋白。,多顺反子重组：多拷贝外源基因有各自的SD序列、翻译起始和终止信号，但转录是在共同的转录启动子和终止子控制下进行的，表达的外源蛋白分子是相互独立的。该方式适合表达中等大小分子量的外源蛋白。,多编码序列重组：将多个外源基因串连在一起，利用同一套转录调控元件、翻译起始与终止密码子，在各编码序列的接口引入蛋白酶酶切位点或可被化学断裂的位点。该方式特别适合表达外源小分子蛋白或多肽。,整合型外源蛋白,将要表达的外源基因整合到染色体的非必需编码区上，使之成为染色体结构的一部分而稳定地遗传，以此种方式表达的外源蛋白即为整合型外源蛋白。,实现外源基因与宿主染色体整合是根据DNA同源交换的原理，因此在待整合的外源基因两侧必须分别组合一段与染色体DNA完全同源的序列。此外，还必须将可控的表达元件和选择标记基因连接在一起。,为获得含整合基因的重组体，被选择的载体一般是那些在受体细胞内不能自主复制或温度敏感型质粒。那么当外源基因被交换到染色体上后，由于宿主菌的不断分裂和增殖，细胞内的质粒逐渐被稀释直至消失。外源基因整合到染色体上后虽只含有单拷贝，但在合适的条件下仍能高效表达外源蛋白。,分泌型外源蛋白,外源基因的表达产物，通过运输或分泌的方式穿过细胞的外膜进入培养基中，即为分泌型外源蛋白。,外源蛋白以分泌型蛋白表达时，须在N端加入1530个氨基酸组成的信号肽（signalpeptides）序列。信号肽N端的最初几个氨基酸为极性氨基酸，中间和后部为疏水氨基酸，它们对蛋白质分泌到细胞膜外起决定性作用。当蛋白质分泌到位于大肠杆菌细胞内膜与外膜之间的外周质时，信号肽被信号肽酶所切割。,以分泌型蛋白的形式表达外源基因的优点：,分泌型可能使蛋白质按适当的方式折叠，有利于形成正确的空间构相，获得有较好生物学活性或免疫原性的蛋白质。甚至有些在细胞内表达时无活性的蛋白质分泌后则有活性。,分泌到细胞外周质的蛋白质产物较稳定，不易被细胞内蛋白酶所降解。简化了发酵后处理的纯化工艺。,缺点：外源蛋白分泌型表达通常产量不高，有时信号肽不被切割或在不适当的位置发生切割。,6.3.1.5在大肠杆菌中高效表达目的基因的策略,高效表达外源基因须考虑的基本原则：,优化表达载体的设计。提高稀有密码子tRNA的表达作用。提高外源基因mRNA的稳定性。提高外源基因表达产物的稳定性。优化发酵过程。,6.3.2芽孢杆菌表达系统,芽孢杆菌属革兰氏阳性菌，细胞壁不含内毒素，能将表达蛋白分泌到细胞外。目前常用作基因表达系统的有枯草杆菌和短小芽孢杆菌等。,利用芽孢杆菌作为表达外源基因的受体菌的优点：,许多芽孢杆菌是非致病性微生物，培养条件简单，生长迅速；表达产物能分泌到细胞外的培养基中，且多数表达产物具有天然构相和生物学活性；某些芽孢杆菌的遗传背景比较清楚，便于进行遗传操作；利用芽孢杆菌进行发酵的技术相当成熟。,6.3.2.1芽孢杆菌表达载体,复制子,金色葡萄球菌的复制子：如pUB110、pC194和pE194等,短小芽孢杆菌的复制子：如pHY481和pWT481等,含金色葡萄球菌复制子的质粒表达载体在宿主细胞中拷贝数高，但不稳定，原因是质粒载体与宿主染色体DNA之间发生遗传重组。,短小芽孢杆菌型复制子的质粒表达载体在宿主细胞中的拷贝数较低，但能稳定存在于宿主细胞中，甚至在没有抗生素选择压力下也不易造成质粒的丢失。,启动子,芽孢杆菌含多种转录起始识别因子（）。芽孢杆菌启动子的表达具有明显的时序性，它与菌体的生长周期和生理代谢活动密切相关。,表达载体,自主复制质粒：是一类穿梭质粒，能在大肠杆菌中复制，同时含有能在芽孢杆菌中复制的起始序列，因而也能在芽孢杆菌中进行自主复制。,整合质粒：在大肠杆菌质粒基础上构建而成，不含在芽孢杆菌进行复制的起始序列，因而不能在芽孢杆菌中自主复制，但它能插入到宿主染色体并将外源基因和标记基因整合到染色体上，随细胞染色体复制而复制，该方式表达外源基因解决了芽孢杆菌中质粒不能稳定遗传的问题。,噬菌体：以芽孢杆菌温和型噬菌体构建的表达载体能将外源基因定位整合到染色体上，并且在合适条件下（温度）诱导外源基因表达。,6.3.2.2宿主菌,常用的宿主菌,枯草芽孢杆菌,短小芽孢杆菌,地衣芽孢杆菌,6.3.2.3外源基因在芽孢杆菌中的分泌表达,芽孢杆菌的细胞膜不同与大肠杆菌，通常只有一层细胞膜，当分泌型蛋白质跨膜后就进入到培养基中，因此，外源蛋白的表达量可以达到很高的水平，其表达量可达30g/L。,6.3.2.4在芽孢杆菌中高效表达外源基因的策略,提高表达质粒在细胞中的稳定性,灭活芽孢杆菌胞外蛋白酶,6.3.3链霉菌表达系统,链霉菌是一种革兰氏阳性细菌，广泛分布于土壤中，能够产生多种生理活性物质。,链霉菌作为外源基因表达的受体细胞所具有的特点：,为非致病性细菌，不产生内毒素；可进行外源蛋白的分泌表达；可进行高密度培养，具有丰富的次级代谢途径和初、次级代谢调控体系，表达外源蛋白的时间较长；链霉菌在传统发酵工业中应用历史悠久，有良好的工业化基础。,6.3.3.1链霉菌基因表达载体,启动子,结构多样，至少存在三类链霉菌基因的启动子：,与大肠杆菌基因-10区和-35区类似的启动子,仅与大肠杆菌基因-10区类似的启动子,与大肠杆菌基因-10区和-35区序列均不相同的启动子,终止子,具有较长的不完全互补反向重复序列。,核糖体结合位点,密码子,链霉菌对编码蛋白质的密码子具有明显的偏爱性。编码蛋白质的碱基序列中GC的平均含量高达73，密码子的第一、第二和第三位碱基的GC含量分别达66、53和93，而该现象不存在于非编码区。在所有氨基酸的简并密码子中某些密码子使用频率低于2。密码子的第三位碱基具有明显的选择性，一般C的频率明显高于G的频率。,类似于其它原核生物的SD序列：5(A/G)GGAGG3。,6.3.3.2宿主菌,变铅青链霉菌,天蓝色链霉菌是整个链霉菌属中分子遗传学研究最清楚的菌体，但它具有较强的修饰系统。,变铅青链霉菌作为外源基因表达的受体细胞所具有的优点：遗传背景清楚，不含内源性质粒；对外源DNA无明显的修饰作用；能高效表达链霉菌基因以外的其它基因；具有高效的异源蛋白分泌系统，并且其内源蛋白酶和外源蛋白酶合成量低。,主要有,6.3.3.3外源基因在链霉菌中的表达（自学）,异源重组蛋白的分泌表达次级代谢产物合成酶基因表达,6.3.3.4在链霉菌中高效表达外源基因的策略（自学）,影响外源基因在链霉菌中表达的因素,启动子的特性,信号肽的序列,基因的结构,发酵条件,6.3.4蓝藻表达系统,蓝藻又称蓝绿藻或蓝细菌，它含有叶绿素a(缺乏叶绿素b)和藻胆素，具有光合系统(PS)和光合系统(PS)、能进行光合作用，但它又具有细菌的特征，无细胞核及双层膜结构的细胞器，染色体裸露，是一种典型的原核生物。,蓝藻与真核生物藻类最大的区别是：它无叶绿体，无真核，有70S核糖体，细胞壁中含有肽聚糖，因而对青霉素和溶菌酶十分敏感等。,6.3.4.1蓝藻外源基因表达载体（了解）,6.3.4.2用作外源基因表达的宿主蓝藻,蓝藻作为表达外源基因的受体菌兼具微生物和植物的优点，具体表现在：,基因组为原核型，除了裸露的染色体DNA外，不含叶绿体DNA和线粒体DNA，遗传背景简单，便于基因操作和外源DNA的检测。细胞壁属G，主要由肽聚糖组成，便于外源DNA的转化。营光合自养生长，培养条件简单，只需光、CO2、无机盐、水和适宜的温度就能满足生长需要。多种蓝藻含内源质粒，为构建蓝藻质粒载体提供了极好的条件。蓝藻富含蛋白质，并且多数蓝藻无毒，早已用作食物或保健品，在此基础上采用转基因技术，把一些重要药物的基因转入无毒蓝藻，就可达到锦上添花的效果。,蓝藻在各生长时期均处于感受状态，均可用于转化，但通常采用对数生长中期到后期的细胞进行转化。转化过程中遮光或添加光合作用抑制剂可提高转化效率。,6.3.4.3外源目的基因在蓝藻细胞中的表达（略）,6.3.4.4在蓝藻细胞中高效表达外源目的基因的策略,构建在蓝藻细胞中稳定性好的表达载体系统。组装含强启动子的外源基因表达盒。外源基因融合表达。,6.3.5酵母表达系统,酵母（yeast）是一类以芽殖或裂殖进行无性繁殖的单细胞真核生物，是外源基因最理想的真核生物基因表达系统。,酵母菌的特点：,基因表达调控的机制比较清楚，遗传操作相对简便，并于1996年完成了对酿酒酵母基因组全序列的测定；具有原核生物所不具备的蛋白质翻译后加工和修饰系统；可将外源基因表达产物分泌到培养基中；对人体和环境安全，不含毒素和特异性病毒；可进行大规模的发酵，工艺简单而成熟，成本低廉。,6.3.5.1酵母基因表达载体,酵母克隆和表达载体是由酵母野生型质粒、原核生物质粒载体上的功能基因（如抗性基因、复制子等）和宿主染色体DNA上自主复制子结构（ARS）、中心粒序列（CEN）、端粒序列（TEL）等一起构建而成。酵母基因表达系统的载体一般是一种穿梭质粒，能在酵母菌和大肠杆菌中进行复制。,DNA复制起始区,酵母表达载体包含两类复制起始序列：,在大肠杆菌中复制的复制起始序列,在酵母菌中引导进行自主复制的序列,选择标记,营养缺陷型选择标记：它与宿主的基因型有关。,显性选择标记：可用于各种类型的宿主细胞，并提供直观的选择标记。,有丝分裂稳定区,酵母菌表达载体相当于微型染色体。表达载体上的有丝分裂稳定区，决定载体在宿主细胞分裂时，能平均分配到子细胞中去，它来源于酵母菌染色体着丝粒片段。,表达盒,表达盒由启动子、分泌信号序列和终止子等组成，是酵母表达载体的重要元件。,启动子的长度一般在12kb，其上游含各种调控序列（如上游激活序列、上游阻遏序列、组成型启动子序列等），下游存在转录的起始位点和TATA序列（TATA序列可被质转录因子蛋白识别、结合并形成转录起始复合物）。一般在构建表达载体时须组入强启动子，如酵母磷酸甘油酯激酶（PGK）基因启动子、甘油醛磷酸脱氢酶（GAPDH）基因启动子等。分泌信号序列是前体蛋白N端一段长为1730个氨基酸残基的分泌信号肽编码区，主要功能是引导分泌蛋白从细胞内转移到细胞外，并对蛋白质翻译后的加工起重要作用。常用的分泌信号序列有：因子前导肽序列、蔗糖酶信号肽序列、酸性磷酸酯酶信号肽序列等。终止子序列相对较短，是决定酵母中mRNA3端稳定性的重要结构。与高等真核生物类似，mRNA的3端需经过前体mRNA的加工和多聚腺苷化反应。,6.3.5.2酵母基因表达载体的种类,自主复制型质粒载体（yeastreplicatingplasmid，YRP）,该载体含有酵母基因组的DNA复制起始区、选择标记和基因克隆位点等元件，能够在酵母细胞中进行自我复制。在酵母细胞中的转化效率较高，每个细胞中的拷贝数可达200个，但经过多代培养后，子细胞中的拷贝数会迅速减少。,整合型质粒载体（yeastintegrationplasmid，YIP）,整合型质粒载体不含酵母DNA复制起始区，不能在酵母中进行自主复制，但含有整合介导区，可通过DNA的同源重组将外源基因整合到酵母染色体上，并随染色体一起进行复制。质粒与染色体DNA的同源重组主要有单交换整合和双交换整合两种方式。,着丝粒型质粒载体（yeastcentromericplasmid，YCP）,该型质粒载体是在自主复制型的基础上，增加了酵母染色体有丝分裂稳定序列元件。在细胞分裂时，质粒载体能平均分配到子细胞中，稳定性较高，但拷贝数很低，通常只有12个拷贝。,该载体在酵母细胞中以线性双链DNA的形式存在，每个细胞内只有单拷贝，包含酵母染色体自主复制序列、着丝粒序列、端粒序列、酵母菌选择标记基因、大肠杆菌复制子和选择标记基因等。在细胞分裂和遗传过程中，能将染色体载体均匀分配到子细胞中，并保持相对独立和稳定。酵母菌选择标记基因SUP4表达时转化子菌落呈白色，不表达时呈红色。外源基因的插入可灭活SUP4基因，获得红色的重组转化子。YAC载体可插入200800kb的外源基因片段，因而特别适合高等真核生物基因组的克隆与表达研究。,酵母人工染色体（yeastartificialchromosome，YAC）,6.3.5.3酵母基因表达系统宿主菌,主要包括,酿酒酵母*,巴斯德毕赤酵母,乳酸克努维酵母,多型汉森酵母,酿酒酵母,它具有作为宿主菌必须具备的许多条件，是最早应用于外源基因克隆和表达的酵母菌。目前已表达了诸如乙型肝炎疫苗、人胰岛素、人粒细胞集落刺激因子等多种外源基因产物。其缺点是在发酵过程中会产生乙醇，影响酵母的生长代谢和基因产物的表达。此外，酿酒酵母在蛋白质的加工过程中会发生过度糖基化作用，其分泌表达能力也有待提高。,巴斯德毕赤酵母,它是一种甲醇营养菌，甲醇可诱导与甲醇代谢相关酶基因的高效表达，如乙醇氧化酶基因（AOX1）的表达产物可在细胞中高水平积累。AOX1的启动子是一种可诱导的强启动子。以AOX1为启动子，选择AOX1基因缺失的突变株作为受体细胞，可高效表达外源基因。目前也可选择组胺醇脱氢酶突变株作为受体细胞，利用该受体系统时，可对载体上携带his标记基因的转化子进行筛选。在毕赤酵母中得到表达的重组异源蛋白有乙型肝炎表面抗原、人肿瘤坏死因子、人表皮生长因子、链激酶等几十种。毕赤酵母的分泌表达能力比酿酒酵母强，但对其遗传背景了解还比较少，且发酵周期也比较长。,乳酸克努维酵母,该酵母的遗传背景比较清楚，工业上用来发酵生产-半乳糖苷酶。某些质粒载体可在该酵母中稳定的保存下来，不容易丢失。该酵母可表达分泌型和非分泌型重组异源蛋白，其表达水平和效果高于酿酒酵母。在分泌表达过程中，能形成正确的蛋白构象，因而利用其表达高等哺乳动物蛋白具有一定的优越性。目前已有多种外源蛋白在该酵母系统中得到表达，如人白细胞介素-1和-牛凝乳酶等。,6.3.5.4在酵母中高效表达外源基因的策略,选择合适的受体细胞系统提高表达载体在细胞中的拷贝数提高外源基因的转录水平,6.3.6哺乳动物细胞基因表达系统*,哺乳动物细胞是最高等的真核生物细胞，其结构、功能和基因表达调控更加复杂。要表达具有生物学功能的蛋白质和具有特异性催化功能的酶，需要在高等真核生物细胞中进行。外源基因在哺乳动物细胞中的表达包括基因的转录、mRNA翻译及翻译后蛋白质加工等过程。,6.3.6.1哺乳动物基因表达载体的组成特征,哺乳动物基因表达载体,质粒载体,病毒载体,哺乳动物基因表达质粒载体是一类穿梭质粒，能够在细菌（大肠杆菌）和哺乳动物细胞中进行扩增。,哺乳动物基因表达载体组成元件一般包括：,基因的转录元件，即转录的启动子、增强子、终止子、poly(A)信号和内含子剪接信号等；,用于筛选转化子的选择标记；,在细菌中进行复制和筛选的元件；,基因表达的调控元件。,复制子,表达载体的复制子一般采用病毒基因组的复制子，带有这些复制子的表达载体能以附加体的形式进行复制。通常用于构建哺乳动物表达载体的复制子有SV40、多瘤病毒和牛乳头瘤病毒等的复制子。不同表达复制子的效率是不相同的。,启动子和增强子,表达载体的启动子长为100200bp，位于转录起始位点上游，一般由核心启动子和上游启动子两部分组成。目前构建的哺乳动物基因表达载体的启动子，主要来源于病毒，如SV40早期和晚期转录启动子、腺病毒晚期启动子等。病毒载体的增强子位于转录起始位点的上游，它可大幅度提高启动子的转录水平。多数增强子具有宿主特异性。,终止信号和加poly(A)信号,RNA聚合酶的转录终止和加poly(A)信号依赖于DNA模板上两种特异的序列，一是位于poly(A)位点上游1130个核苷酸的一段高度保守的六核苷酸序列AAUAAA，二是poly(A)位点下游的GU丰富区或U丰富区。因此，在构建表达载体的时候必须加上这两种序列。常用的加poly(A)信号来自SV40，它是一段长为237bp的BamHI-BclI限制酶酶切片段，它同时含有早期转录和晚期转录单位的切割信号与加poly(A)信号。,剪接信号,外源基因的表达在一级转录物加上poly(A)信号后，内含子被剪除并形成成熟的mRNA。mRNA剪接所必需的最短序列位于内含子5和3边界上。在构建真核表达载体时都组入一个SV40的内含子，利用该内含子及其剪接信号构建的载体，表达外源基因的水平比普通的载体要高。若外源基因为cDNA，表达载体中不含内含子剪接信号，也不会影响其表达。,选择标记基因,为了快速有效地筛选哺乳动物转化细胞，必须在构建表达载体时组入动物细胞特异性选择标记基因。目前已发展的哺乳动物细胞基因转化筛选标记如下表所示：,6.3.6.2哺乳动物基因表达载体,不带真核复制起始序列的质粒型载体带真核病毒调控序列元件的质粒表达载体SV40衍生的表达载体牛乳头瘤表达（BPV）衍生载体人疱疹病毒（EBV）衍生的表达载体人腺病毒（adenovirus）衍生的表达载体反转录表达（retrovirus）衍生的表达载体,6.3.6.3哺乳动物基因表达宿主细胞,哺乳动物基因表达宿主细胞选择的基本原则：来源丰富、转化效率高、表达效果好。,在哺乳动物基因表达过程中，与正常细胞生理特性尽可能接近的肿瘤细胞常被选择为基因转移的受体细胞。目前用作哺乳动物基因表达系统的受体细胞主要有：CHO-K1细胞、COS细胞、鼠骨髓瘤细胞等。,CHO-K1细胞,CHO-K1细胞是从中国仓鼠卵巢中分离出的一株上皮细胞。目前被用于基因表达的受体细胞是一株缺乏二氢叶酸还原酶（dhfr）的突变株，它可在氨甲蝶呤选择压力下，使外源基因拷贝数扩增并得到较高水平的表达，表达量可达10g/ml以上。,外源基因在没有选择压力的情况下能稳定保持；适合多种蛋白质的分泌表达和胞内表达；对培养基的要求较低，可在无血清培养基中培养；细胞可进行贴壁培养，也可进行大规模悬浮培养。,该细胞株是目前应用最广泛的哺乳动物基因表达受体细胞之一，已有多种外源基因如人组织型纤溶酶原激活剂（tPA）、干扰素、干扰素、凝血因子等在CHO细胞中得到表达。,CHO-K1细胞特点,COS细胞,它来源于非洲绿猴肾细胞系（CV-1），能组成性表达SV40的大T抗原。,COS细胞的特点：,细胞来源丰富；细胞易于培养和转染；能使转染到该细胞中的带有SV40复制子的转录载体快速扩增；能瞬时大量表达外源基因的产物。,由于转染质粒在COS细胞中无节制复制，最终将导致细胞无法忍受而死亡。利用COS细胞作为外源基因瞬时表达的受体细胞可广泛用于哺乳动物基因的表达与调控、蛋白结构与功能分析等研究。,鼠骨髓瘤细胞,鼠骨髓瘤细胞如Sp2/0、NSO和J558L等已被用作基因表达的受体细胞。目前已有免疫球蛋白（Ig）、tPA等多种外源基因在鼠骨髓瘤细胞中得到表达。,鼠骨髓瘤细胞的特点：,细胞易于培养和转染，可在无血清培养基中进行高密度悬浮培养；能进行分泌表达，且表达量高；能对蛋白质进行糖基化修饰。,6.3.6.4提高哺乳动物基因表达系统表达效率的策略*,（1）设法提高外源基因的表达水平和产量,表达载体启动子的强度和宿主范围，是外源基因高表达的关键因素之一，选择外源性强启动子可获得高效表达。外源基因的表达水平还与细胞中基因的拷贝数有关，拷贝数对于瞬时表达系统尤为重要。为此，可考虑将载体构建为一种自主复制型载体。将外源基因与选择标记基因的表达结合在一起，使细胞在选择压力下培养时，两种基因产物都能获得高表达。,（2）改造宿主细胞的特性,宿主细胞的特性对外源基因的表达至关重要。以一种或几种宿主细胞表达不同特性和要求的外源蛋白是不够的。因此，根据表达载体和外源蛋白的特性，对宿主细胞进行改造，或采用一些新的宿主细胞系统，对提高外源基因的表达水平有重要作用。,方法,（3）抑制细胞凋亡，延长细胞周期,方法,为细胞生长提供足够的营养和充分的氧源；加入抗氧化剂延缓细胞凋亡；将抗细胞调亡基因导入宿主细胞中。,（4）提高表达蛋白糖基化水平,哺乳动物蛋白的一个重要特点就是糖基化，而糖基化的方式决定蛋白质的特性。蛋白质糖基化的方式有两种（N-糖基化和O-糖基化）。决定蛋白质糖基化的主要因素包括宿主细胞内糖基化酶和细胞的培养环境等。,方法,寻找不同类型的哺乳动物宿主细胞（包括人类细胞），使其表达的蛋白质尽可能和人类天然蛋白的糖基化相同或相似；通过基因工程方法改造现有的宿主系统，将某些糖基化酶引入宿主细胞中，使其对表达蛋白进行有效糖基化；对哺乳动物细胞表达条件进行改进，使有利于表达蛋白的糖基化。,6.3.7植物细胞基因表达系统,6.3.7.1植物细胞基因表达与调控的特点,6.3.7.2植物基因表达载体的组成特性,大多数的植物基因表达载体是以Ti质粒为基础构建的，其组成主要包括：启动子、T-DNA、终止子和报告基因等。,农杆菌,根癌农杆菌,含Ti质粒,诱发冠瘿瘤,发根农杆菌,含Ri质粒,诱发茎瘿瘤,一般只侵染双子叶植物，很少感染单子叶植物,几乎可侵染所有双子叶植物和少数单子叶植物,Ti质粒,根癌农杆菌的Ti质粒，是一种长约200250kb，分子量为90103150103KD的双链环状的染色体外的DNA分子。与其它类型的质粒一样，Ti质粒也是一种能够独立复制的遗传单元。它除了能够诱发植物产生冠瘿瘤之外，还具有多方面的功能：,为其寄主根癌农杆菌提供附着于植物细胞壁的能力；参与寄主细胞制造植物激素