“生物化学实验”理论知识考查题

1.酶与普通催化剂有什么不同？酶分离纯化过程中应注意哪些环节？1.高效率2.特征3.温和的条件4.酶活性的调节5.酶催化活性与辅酶、辅助基团和金属离子有关。6.不稳定且易于停用酶是一种特殊的蛋白质。在分离纯化过程中，要注意温度和酸碱度的控制，以及纯化过程中所用缓冲溶液的离子强度的控制(常用的是PBS缓冲溶液)。在实际的纯化过程中，通常在低温冰箱中进行，并且向缓冲溶液中加入乙二胺四乙酸二钠盐(1-5mM)螯合和重金属离子，以通常避免酶失活。2.如何评价蛋白质纯化方法的优缺点？为了判断分离和纯化方法的优缺点，通常使用两个指标来衡量它们。一是恢复全部活力。它是生命力的倍数。理想的分离纯化方法希望活力和总活力越高越好，但两者往往不是两者兼而有之。因此，在考虑分离条件和方法时，有必要通过增加比活性和回收总活性来做出适当的选择。3.纯化蛋白质的色谱方法有哪些？凝胶过滤色谱法；离子交换色谱法；疏水色谱；亲和层析；聚焦色谱；高效液相色谱。请回答用琼脂糖凝胶柱色谱法纯化蔗糖酶的基本原理。离子交换剂是以纤维绳或葡聚糖凝胶等不溶性物质为基质，通过酯化、醚化或氧化等化学反应引入正负离子基团的特殊制剂。它能与带相反电荷的化学物质交换吸附。琼脂糖凝胶柱代表四级氨基琼脂糖色谱。琼脂糖作为不溶性基质引入季铵基团作为强阴离子交换剂。酵母转化酶的等电点约为5.0，在Tris-HCl缓冲液(pH 7.3)中带负电荷。在pH7左右，琼脂糖凝胶带正电，并与带负电的蔗糖酶结合。当洗脱液中的离子基因与结合到离子交换剂上的蛋白质离子基团竞争时，具有小亲和力的蛋白质分子首先解吸并洗脱，而具有大亲和力的蛋白质分子随后解吸并随后洗脱。因此，通过增加缓冲溶液的离子强度和/或改变酸碱度，可以改变蛋白质的吸附状态以分离具有不同亲和力的蛋白质。什么是酶活性？根据实验经验，测定酶活性时应该注意哪些问题？什么是酶活性：酶活性也称为酶活性，是指催化某些化学反应的酶的活性。酶活性的测定实际上是确定酶促反应的速度。通常，确定酶促反应初始速度的方法用于确定酶活性。酶促反应的速度可以用单位时间、单位体积底物的减少或产物的增加来表示。酶催化反应速度越高，酶活性越高，而活性越低。酶活测定中的注意事项：(1)应使用专用移液器进行测量，并应立即添加新试剂进行混合。将每个试管中的液体混合均匀。摇匀。移液器使用方法，根据减少的量准确添加。(2)吸光度测量要求：测量数据为(0.1-0.7A)，波动可达0.2-0.8，最小值不小于0.1，最大值不超过1.0。R2要求接近1，至少为0.999。(3)从低到高稀释样品，即CBA，因为使用了相同的容量瓶来防止污染物改变浓度。(4)酶解蔗糖反应：反应前，将稀释的酶溶液和蔗糖在35度水浴中预热，准确计时每个试管，分别结束每个单独的反应。加入0.05毫升，2毫升/升氢氧化钠/毫升，立即摇匀！(5)测量反应溶液的吸光度：从每个水解反应溶液中取出合适的体积(v测量)。对于用移液管测量每种反应液，应在取反应液之前进行控制。如果测得的外径值为n酶活性也称为酶活性，是指催化某些化学反应的酶的活性。酶活性的测定实际上是确定酶促反应的速度。通常，确定酶促反应初始速度的方法用于确定酶活性。酶促反应的速度可以用单位时间、单位体积底物的减少或产物的增加来表示。酶催化反应速度越高，酶活性越高，而活性越低。酶活性的单位是酶活性的测量单位。酶活性单位可以自己定义。一个酶活性单位是指在特定条件(25或其他最佳条件)下，在单位时间内将一定量的底物转化为产物所用的酶的量。国际酶学委员会在1961年规定，在确定的最佳反应条件下，每分钟催化1mol底物转化为产物所需的酶量为一个酶活性单位，单位符号为国际单位或美国单位比活性(性别)是衡量酶纯度的一个指标。比活性是指每毫克蛋白质的酶活性单位数，通常表示为酶活性单位/毫克蛋白质。在酶学研究中，酶的比活用来衡量酶的纯度。对于相同的酶，比活性越高，酶的纯度越高。比活性可用于比较酶制剂中单位质量蛋白质的催化能力，这是酶纯度的一个重要指标。7.福林酚试剂法测定蛋白质浓度的基本原理是什么，这种方法的优缺点是什么？该方法的显色原理与缩二脲法相同，只是加入了第二种试剂福林酚试剂，以增加显色量，从而提高了蛋白质检测的灵敏度。这两种颜色反应产生深蓝色的原因是，在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合形成复合物。福林酚试剂中的磷钼酸盐-磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基还原，生成深蓝色(钼蓝和钨蓝的混合物)。在某些条件下，蓝色深度与蛋白质的量成正比。这种蓝色溶液在750纳米和660纳米具有很强的光吸收能力，可用于测量未知样品的蛋白质浓度。优点：灵敏度高，比缩二脲法灵敏得多；缺点：耗时长，操作时间应严格控制，蛋白质浓度与吸光值的线性关系不够严格，特异性差，干扰物质多。任何干扰缩二脲试验的基团，如-CO2-NH2，-CH2-NH2，CS-NH2，Tris缓冲液，蔗糖，硫酸铵和巯基化合物，都会干扰福林-苯酚反应，对后者的影响更大。此外，酚类和柠檬酸也会干扰这一反应。8.微量凯氏定氮法的基本原理是什么？运行中应注意哪些环节？原理：将蛋白质、硫酸和催化剂一起加热消化分解蛋白质，分解后的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后通过碱化蒸馏除去氨，用硼酸吸收，用硫酸或盐酸标准溶液滴定。根据酸的消耗量，可以计算出样品中的氮含量，根据换算系数，可以计算出蛋白质含量。氮含量*6.25=蛋白质含量。本方法适用于测定0.2 2.0毫克的氮(0.1 2.0毫克在教师PPT上)。在操作过程中，应注意完全消化(溶液是清澈的浅绿色)。蒸馏过程中，密封以减少氨挥发损失。氨被硼酸完全吸收，滴定应该准确。9、十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质相对分子量是基于什么原理？SDS是一种阴离子洗涤剂。作为变性剂和增溶剂，它可以破坏分子内和分子间的氢键，使分子展开并破坏蛋白质分子的二级和三级结构。然而，强还原剂如巯基乙醇和二硫苏糖醇可以破坏半胱氨酸残基之间的二硫键。向样品和凝胶中加入还原剂和十二烷基硫酸钠后，分子解聚成多肽链，当分子量在15KD和200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数成线性关系，符合下式：logMW=K-bX，其中MW是分子量，X是迁移率，K和B是常数。如果已知分子量的标准蛋白质的迁移率相对于分子量的对数作图，可以得到标准曲线。未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据其电泳迁移率在标准曲线上获得分子量。10.沉淀蛋白质常用什么方法？蔗糖酶可以用其他沉淀方法分离吗？说出至少3种方式。中性盐沉淀(盐析法)、有机溶剂沉淀、选择性沉淀(热变性沉淀和酸碱变性沉淀)、等电点沉淀、有机聚合物沉淀、重金属离子沉淀11.你在生化实验中学会了多少种蛋白质含量测定方法？试着比较优点和缺点。1.凯氏定氮法：蛋白质氮被转化成氨，氨被酸吸收并被滴定。该方法干扰少，可用于标准蛋白质含量的准确测定。低灵敏度，适用于0.1-1.0毫克的氮气，需要3-4小时。2.缩二脲法(缩二脲法):肽键碱性Cu2+紫色复合物。低灵敏度20毫克，中速2030分钟，干扰物多(硫酸铵、Tris缓冲液)。用于快速测定，但不是非常敏感；不同的蛋白质有相似的颜色发展。3.紫外线吸收法：蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在280纳米处有很大的吸光度值。灵敏50 100毫克，快速10分钟，各种嘌呤和嘧啶干扰结果，用于色谱柱流出物的测定。4.福林酚试剂法(Lowry法):磷钼酸-磷钨酸试剂被Tyr和Phe还原。灵敏度高5 mg，耗时40 60分钟，干扰多，操作时间严格，试剂配置困难。5.考马斯亮蓝法(布拉德福德法):考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时，其最大吸收波长从465纳米变化到595纳米。灵敏度高达5毫克，快速5 15分钟，干扰物质(洗涤剂)少；颜色稳定。12.测试问题：在微量凯氏定氮实验中，消化过程中加入的硫酸钾和硫酸铜有什么作用？恒定凯氏定氮和微量凯氏定氮的操作差异是什么？硫酸铜的作用：催化剂K2SO4的作用是提高沸点，将反应过程从330加速到400。不同：常数适用于低蛋白质含量的样品，因为所有消化液可以一起蒸馏进行测定。该装置的微小区别在于，它们都属于蒸汽蒸馏操作，除了前者直接将蒸汽引入反应室，而后者将蒸汽引入反应室进行加热。由于两者都是消化液的一部分，所以可以平行蒸馏，但检测限高于常量法。测试问题：酶活性的定义是什么？酶活测定应注意什么？酶活性的定义是什么？酶活测定应注意什么？答：也叫酶活性，是指酶催化反应的能力。酶活性单位是在一定条件下和一定时间内将一定量的底物转化为产物所需的酶的量。注：(1)仪器不干净，含有其他物质，如外来蛋白质、抑制剂和本实验的其他还原性物质。(2)基质在空气的影响下会自然分解。(3)大多数酶的活性会因长期储存而降低，并储存在4的冰柜中。(4)在酶促反应过程中，反应速度仅在第一段时间内与酶浓度成正比。随着反应时间的延长，反应速度逐渐降低(5)酸碱度和温度(6)底物(7)反应时间测量期间(8)其他因素14.需要探索什么条件来建立蛋白质纯化的离子交换方法？答：(1)缓冲溶液的酸碱度对蛋白质结合离子交换色谱有很大影响。有必要找到你(3)柱体积。虽然各种离子交换色谱都有理论结合蛋白量，但各种蛋白的情况不同。有必要找到能够完全结合靶蛋白的合适的柱体积。既不太大会导致洗脱浓度太低，也不太小会导致目标蛋白过量。(4)温度、温度可能引起蛋白质变性等。琼脂糖凝胶的基质是什么？它所承载的活跃群体是什么？为什么这个离子交换器被用在这个实验中？琼脂糖凝胶是由琼脂糖作为不溶性基质引入的季铵基团，是一种强阴离子交换剂。它具有硬度高、性能稳定、凝胶后流速好、分离能力强等优点。(1)提高实验效果。琼脂糖凝胶离子交换介质负载量高，分离纯化蔗糖酶的穿透峰小，分辨率高，回收率高。蔗糖酶与外源蛋白分离良好，提高了纯度，真正体现了离子交换层析在蛋白纯化中的优势，增强了实验的意义。(2)缩短实验时间。减少不必要的实验重复，实验过程相对紧凑。(3)节省实验费用。琼脂糖培养基在分辨率、回收率和流速方面具有优势。此外，它还具有极高的化学稳定性，不易破碎，能耐受1mo的清洗，再生效果好，可使用数百至数千次，从而降低成本。16.胞内酶提取过程中需要破壁。常用的破壁方法有哪些？机械方法：液氮研磨、高压均质、高速珠磨和超声波破碎非机械方法：甲苯自溶法、化学渗透法、酶溶解法、SDS提取法、反复冻融法和低渗透溶液法17.消化在微量凯氏定氮实验中的作用是什么？SDS的化学名称是什么？功能：样品和浓硫酸一起加热，含氮有机物分解产生氨(消化)十二烷基磺酸钠18.SDS-PAGE在测定蛋白质相对分子量中的作用是什么？SDS是一种阴离子洗涤剂。作为变性剂和增溶剂，它可以破坏分子内和分子间的氢键，使分子展开并破坏蛋白质分子的二级和三级结构。然而，强还原剂如巯基乙醇和二硫苏糖醇可以破坏半胱氨酸残基之间的二硫键。在样品和凝胶中加入还原剂和十二烷基硫酸钠后，分子解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和十二烷基硫酸钠结合成蛋白质-十二烷基硫酸钠胶束，蛋白质携带的负电荷大大超过蛋白质的原始电荷量，消除了不同分子之间的电荷差异和结构差异。19.简述浓缩胶的浓缩效果。学长给出的答案(感觉不太好)当样品装入装载孔时，样品有一定的高度，样品中的蛋白质不在起始线上。浓缩凝胶的作用是将样品中的蛋白质压缩成一条细线，并站在同一条起始线上，因此影响蛋白质迁移率的因素只是分子量的大小，这一点更具可比性。DNA电泳的驱动力取决于DNA骨架本身的负电荷，而蛋白质电泳的驱动力则取决于与蛋白质结合的SDS所携带的负电荷。SDS将蛋白质变性成线性分子并紧紧地包裹它们，使蛋白质携带的电荷与蛋白质的分子量成正比，因此当样品用完浓缩凝胶时，剩下的就和核酸电泳一样了。生物化学是指蛋白质分子由于凝胶孔径的不连续性(2个孔径)、缓冲离子组成的不连续性(2个缓冲体系)、酸碱度的不连续性(3个酸碱度)和电泳电位梯度的不连续性而在浓缩凝胶和分离凝胶的界面上浓缩成一条窄缝，成为浓缩效应。我自己检查过了。凝胶由两层不同的凝胶层组成，上层为浓缩胶，下层为分离胶。浓缩胶为大孔胶，缓冲液电泳开始后，快离子向前方移动，在快离子和慢离子之间形成一个低离子浓度的