第6章-目的基因克隆---基因工程原理与技术---刘志国-课件.ppt

第一节PCR扩增法获得目的基因,第六章目的基因克隆,本节要点,RT-PCR法RT-PCR的步骤三种不同引物引导的RT-PCR已知基因N端部分序列RT-PCR,其它PCR法反向PCR锚定PCR连接介导的PCR盒式PCRRACE,第一节PCR扩增法获得目的基因,一、RT-PCR法,第一节PCR扩增法获得目的基因,RT-PCR的步骤,反转录,PCR扩增,获得RNA模板,反转录：将RNA反转录成cDNA第一链,常用RNA模板,常采用异硫氰酸胍-酚-氯仿一步抽提法提取的总RNA中只有少部分是mRNA，大部分为rRNA和tRNA,第一节PCR扩增法获得目的基因,TRIzol是一种新型总RNA抽提试剂，含有苯酚、异硫氰酸胍等物质.,细胞总RNA,采用亲和层析法,第一节PCR扩增法获得目的基因,oligo(dT)纤维素柱分离纯化真核mRNA,mRNA,基因特异引物（genespecificprimer，GSP）多聚寡核苷酸引物（oligo(dT)primer）随机六核苷酸引物（randomhexamerprimer）,第一节PCR扩增法获得目的基因,三种引物扩增特异性高,低,反转录,将RNA反转录成cDNA第一链,反转录的引物：三种,以合成的cDNA单链为模板，采用基因特异引物进行常规PCR扩增过程：,第一节PCR扩增法获得目的基因,PCR扩增,上游引物与cDNA第一链退火，在DNA聚合酶的作用下合成cDNA第二链,以cDNA第一链和第二链为模板，用上、下游引物进行PCR扩增,2.三种不同引物引导的RT-PCR,第一节PCR扩增法获得目的基因,RNA提取,反转录,第一节PCR扩增法获得目的基因,PCR过程,3.已知基因N端部分序列RT-PCR,目的基因的DNA序列未知，但其编码蛋白的N端部分氨基酸序列已知根据氨基酸序列设计的简并引物和oligo（dT）进行RT-PCR,第一节PCR扩增法获得目的基因,简并引物,根据密码子的简并性设计的针对编码每个氨基酸的所有碱基组合的混合物,扩增对象,扩增方法,第一节PCR扩增法获得目的基因,已知基因N端部分序列RT-PCR示意图,获得的目的基因的DNA片段不完整，仅知道基因上一小段序列信息时,第一节PCR扩增法获得目的基因,二、其他PCR法,反向PCR锚定PCR连接介导的PCR盒式PCRRACE,适用对象,方法,用于扩增已知目的基因序列侧翼的DNA片段,1.反向PCR,第一节PCR扩增法获得目的基因,扩增对象,操作过程,酶切,连接环化,PCR扩增,测序分析,第一节PCR扩增法获得目的基因,反向PCR原理示意图,RS:限制性内切酶酶切位点GSP:基因特异引物,1.锚定PCR,根据已知序列设计的基因特异引物,2.锚定PCR,第一节PCR扩增法获得目的基因,扩增对象,也称之为单侧特异引物PCR（SSP-PCR），是根据已知目的基因的一小段序列信息来快速扩增已知序列上游或下游片段的技术,引物,引物1,引物2,即锚定引物，根据序列的共同特征设计的非特异性引物，非特异性引物所起的作用是在其中一端附着。与锚定引物结合的序列称为锚定序列。,第一节PCR扩增法获得目的基因,方法,扩增目的基因已知序列下游3端未知序列,oligo（dT）作为锚定引物,扩增目的基因已知序列上游5端未知序列,用DNA末端转移酶，在cDNA3末端加上Poly（dA）尾与此Poly（dA）相对应的Poly（dT）作为锚定引物,第一节PCR扩增法获得目的基因,PCR具体过程,包括两轮PCR扩增,第一轮：采用不对称PCR高浓度的基因特异引物和低浓度的非特异性引物,第二轮：以稀释后的第一轮PCR产物作为模板相同浓度的基因特异引物和非特异性引物进行扩增,第一节PCR扩增法获得目的基因,锚定PCR原理示意图,在普通PCR过程中增加了连接的步骤，即通过连接反应加上去一个公共接头,3.连接介导的PCR,第一节PCR扩增法获得目的基因,应用范围,只知道DNA一端的序列又要对未知的一端进行测序对体内甲基化图谱或DNA印迹进行分析,方法,引物,第一节PCR扩增法获得目的基因,通过目的基因的已知序列设计的基因特异引物,引物1,引物2,接头引物,第一节PCR扩增法获得目的基因,连接介导的PCR原理示意图,4.盒式PCR,方法,在普通PCR过程中加入了一个Cassette（盒）,人工合成的带有限制性内切酶的粘性末端的双链DNA分子,第一节PCR扩增法获得目的基因,Cassette在设计时其5末端没有磷酸基团目的DNA片段的3末端和Cassette的5末端的连接部位形成缺口在第一次PCR的第一个循环，从Cassette引物CP1开始的延伸反应在连接部位终止，限制了引物CP1和引物CP1同一引物之间的扩增，减少了非特异性PCR扩增,特点,第一节PCR扩增法获得目的基因,第一节PCR扩增法获得目的基因,盒式PCR原理示意图,CP:Cassette引物GSP:基因特异引物（正义引物）AGSP:基因特异引物（反义引物）,5端之间的未知序列5RACE,5.RACErapid-amplificationofcDNAends,第一节PCR扩增法获得目的基因,通过反转录和PCR技术进行cDNA末端快速扩增，得到基因转录本的未知序列，从而获得mRNA完整序列的方法,过程和分类,以mRNA为模板反转录成cDNA第一链,用PCR扩增出cDNA内某一已知序列位点到其,3端之间的未知序列3RACE,锚定PCR被用于RACE技术，根据锚定序列引入方式的不同，RACE分为经典RACE和新RACE,第一节PCR扩增法获得目的基因,经典RACE：以锚定序列作为引物，3RACE中在反转录时引入第一链cDNA，5RACE中在合成第二链时引入第二链cDNA,新RACE：锚定序列在反转录以前以寡聚核苷酸RNA的形式连入mRNA中,经典3RACE操作步骤,第一节PCR扩增法获得目的基因,以mRNA为模板，用反转录引物合成3端cDNA第一链，在5端引入了OP和IP序列,以基因特异引物GSP1和外侧引物OP进行第一轮PCR扩增,以第一轮PCR扩增的产物为模板，以基因特异引物GSP2和内侧引物IP进行第二轮PCR扩增,PCR产物进行直接测序或克隆于适当载体进行序列分析,即锚定引物TTT(T)n-IP-OP，含oligo（dT）序列、外侧引物区OP和内侧引物区IP,第一节PCR扩增法获得目的基因,经典3RACE原理示意图,TTT(T)n-IP-OP:锚定引物IP:内侧引物区OP:外侧引物区GSP:基因特异引物,经典5RACE操作步骤,第一节PCR扩增法获得目的基因,以基因特异引物GSP1作为反转录引物产生cDNA第一链,在脱氧核苷酸末端转移酶的作用下，在cDNA3末端加上Poly（dC）（或Poly（dA）尾,利用锚定引物（5OP-IP-oligo（dG）（或5OP-IP-oligo（dT）和基因特异引物GSP1进行第一轮PCR扩增,以第一轮PCR反应的产物为模板，以基因特异引物GSP2和内侧引物IP进行第二轮PCR扩增,第一节PCR扩增法获得目的基因,经典5RACE原理示意图,新型5RACE操作步骤,CIAP处理总RNA,使rRNA、tRNA或5端不完整无帽的mRNA去磷酸化脱掉5磷酸基团,TAP处理全长的mRNA，去掉其帽子结构，保留5端的一个磷酸基团,设计锚定序列，具OP和IP区，用T4RNA连接酶，将具有锚定序列的一段短RNA寡核苷酸与去掉帽子结构的mRNA进行连接,设计两条引物GSP1和GSP2，GSP1在GSP2的外侧，以第三步中形成的杂合体为模板，利用引物GSP1为反转录引物合成cDNA第一链,第一节PCR扩增法获得目的基因,用GSP1和OP，GSP2和IP进行巢式PCR,第一节PCR扩增法获得目的基因,新型5RACE原理示意图,CIAP:牛小肠碱性磷酸酶TAP:烟草酸性焦磷酸酶OP:外侧引物区IP:内测引物区GSP:基因特异引物,第二节基因的合成,随着技术的发展，用化学的方法人工合成基因成为可能，人工合成的基因可以是生物体内已经存在的，也可以是按照人们的愿望和特殊需要重新设计的。,1970年，美国麻省理工学院Khorana等人首次报道了酵母丙氨酸转移核糖核酸的全人工合成基因,H.G.Khorana（1922-）,一、DNA人工合成的原理,利用人为操纵的化学反应，使核苷酸间形成正确联接,发展历史：H-亚磷酸酯磷酸二酯法磷酸三酯法亚磷酸三酯法,固相亚磷酸三酯法：目前最通用的一种合成寡核苷酸的方法，是在偶联于固相支持物上的连接臂末端通过逐个加上核苷酸来实现的，其一个合成循环周期分为四个步骤去保护(deprotection)、偶联（coupling）、封端（capping）、氧化（oxidation）,二、人工合成基因,基因的人工合成是在寡核苷酸化学合成的基础上建立的，通常的策略是将需要合成的基因分成若干个相互重叠的片段，先利用化学合成法分别合成这些小片段，然后让这些片段退火配对，最后利用连接酶和聚合酶将这些片段连接成完整的基因序列。,DNA小片段全长基因,1、退火-连接法,2、多步退火-延伸-连接法,3、由内向外多步退火-延伸合成法,第三节基因组DNA的克隆,基因组文库构建,概述定义：某种生物基因组的全部遗传信息通过克隆载体储存于某一受体菌的群体中，这个群体就称为该生物基因组的文库(genomiclibrary)目的：a）分离有用的目的基因（可培养细菌未可培养细菌）b）保存某种生物的全部基因（可培养细菌）,一般流程,一般流程,高分子量环境样品DNA的准备,对象细胞收集,细胞裂解、内切酶消化,脉冲场凝胶电泳,细胞的低熔点Agarose凝胶包埋（琼脂糖栓Agaroseplug）,大片断DNA的回收与浓缩（100kb）,PFGE分离大片断DNA分子,脉冲场凝胶电泳,DNA分子在凝胶中的运动,载体的选择和制备,载体选择,BAC（Bacteialartificialchromosome）vector细菌人工染色体载体结构,BAC载体特点,对插入大片断的外源DNA（300kb）能够复制严谨、稳定通过电激发转化大肠杆菌的效率较高已超螺旋状态存在，分离抽提比YAC容易克隆中几乎不存在嵌合体(Chimrism),连接,克隆片段的大小与构建文库克隆子的关系（）文库实际克隆数（N）（）其中p为期望的可能性，f为片段平均长度与基因组总长的比值,大片段DNA是否能有效连接在载体上主要取决于插入DNA片段与载体的比例,对于不同生物采用的比例不同,大多数BAC文库采用15-15(摩尔比),目标DNA和载体浓度的确定,转化,制备用于电转化的感受态大肠杆菌细胞,电激转化,对于转化大肠杆菌而言,电转化是目前使用最普通的一种手段。电转化效率与插入片段的大小有关,插入片段越大,转化效率越低;反之,越高。此外,转化条件（如温度0-4度）也直接影响转化效率、插入片段大小及假阳性克隆的含量。,阳性克隆的挑选,可通过lacZ的-互补所形成的蓝白菌落筛选阳性克隆。,BAC文库的鉴定,评价一个BAC文库质量高低的标准：,假阳性克隆的含量,文库中克隆的数量,插入片段大小,细胞器DNA的含量,BAC文库的鉴定,从文库中随机挑选一定量的BAC克隆,提取质粒DNA,酶切后,脉冲电泳检查插入片段的大小,以Southern杂交来检验BAC克隆插入片段是否来源于原材料。检验假阳性克隆,保证库的质量,BAC文库的快速筛选,高密度膜杂交筛选,Southern杂交筛选,PCR筛选,基因组文库在环境微生物分子生态中的应用与意义,环境样品的基因组文库能够代表自然微生物群体中的主要基因信息,为原位染色体杂交技术鉴定不可培养细菌提供可靠的信息,增加了对不可培养微生物生理、生化和关键代谢机理的了解,通过基因芯片去探测不可培养微生物的分布、基因表达和对环境的响应,海洋环境BAC文库发现了海洋变形细菌视紫红质的结构模型,第四节cDNA文库构建及筛选,什么叫做cDNA文库？,以mRNA为模板，在体外经逆转录酶催化反转录生成cDNA，与适当载体连接后转化受体菌并繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。可认为是：不包含内含子的基因组文库。,构建cDNA文库的基本步骤：,制备mRNA；第一链cDNA合成；第二链cDNA的合成；双链cDNA的修饰及克隆；对构建的cDNA文库进行鉴定，测定文库的代表性以及重组cDNA片段的序列完整性。,内容提要,一、RNA提取与质量鉴定二、cDNA文库构建三、cDNA文库的质量评价,一、RNA提取与质量鉴定,1.细胞总RNA的提取,3.RNA的质量鉴定,2.mRNA的分离纯化,1.细胞总RNA的提取,cDNA文库构建的关键步骤：提取高质量的总RNA。RNA易降解：所用器皿和试剂必需经高温灭菌或DEPC处理,实验室常用：异硫氰酸胍法（Trizol）,Trizol试剂,原理：,优点：快速、简便、容易操作,氯仿抽提、离心分离水相和有机相,RNA抽提专用试剂，由异硫氰酸胍和苯酚组成，可以迅速破坏细胞结构，释放出细胞质和细胞核中的RNA,收集水相加入异丙醇，沉淀即为RNA,下一步mRNA的纯化,2.mRNA的分离纯化,常规方法：oligo（dT）-纤维素柱层析分离法磁珠吸附洗脱法,磁珠吸附洗脱法分离mRNA,3.RNA的质量鉴定,总RNA：紫外分光光度法、电泳法,mRNA：琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶法等,紫外分光光度法：OD260=1时，相当于RNA的浓度为40g/ml；OD260/OD280电泳法：28S和18S亮度接近2：1，mRNA分布均匀，则认为RNA质量较好。,1.cDNA第一链的合成,二、cDNA文库构建,2.第二链cDNA的合成,3.双链cDNA的修饰及克隆,1.cDNA第一链的合成,cDNA第一链的合成：mRNA在反转录酶的催化作用下得到cDNA；常用的反转录酶：AMV、MLV；常用引物：oligo（dT）、六核苷酸的随机引物(dN)6、已知序列引物；,注意：反应条件的调整；cDNA长度应为0.7-8kb；,cDNA第一链合成,2.第二链cDNA的合成,第二链合成是以第一链为模板，由DNA聚合酶催化；常用方法有3种：自身引导法、置换合成法和引物合成法。,自身引导法：第一链合成过程中形成cDNA/RNA杂交分子变性，降解RNA；单链cDNA分子的3末端自身环化，形成发夹结构；以此为引物，在DNA聚合酶作用下合成第二链。,缺点：S1核酸酶,置换合成法合成cDNA的第一链形成mRNA:cDNA杂交链；RNAaseH酶降解mRNA；mRNA链上出现切口，产生一系列mRNA引物；大肠杆菌DNA聚合酶合成cDNA的第二链。,目前合成cDNA常采用该方法,（1）修饰cDNA两端接头：人工合成的双链寡核苷酸，含酶切位点。末端转移酶：形成oligo（dG）、oligo（dC）或oligo（dT）、oligo（dA）,3.双链cDNA的修饰及克隆,（2）双链cDNA的克隆cDNA文库的载体主要有三种：质粒：仅在构建较高丰度cDNA文库和次级cDNA文库时使用（优、缺点）噬菌体：应用最为广泛（优、缺点）噬菌粒：兼具前两代的优点,cDNA文库构建过程示意图,三、cDNA文库的质量评价,1.文库的代表性一般可用文库的库容量来衡量,Clack-Carbor公式：N=ln（1-p）/ln（1-1/n）,2.重组cDNA片段的序列完整性,差异克隆技术,基因表达的变化是调控细胞生命活动过程的核心机制，高等生物含有数万个不同的基因，但在生物体发育的某一阶段只有约10-15%的基因按时空顺序有序地进行表达，这种表达方式即为基因的差别表达（differentialexpression）。,研究同一类细胞在不同生理状态下或在不同生长发育阶段基因表达的差异的方法很多，有代表性的技术主要有mRNA差异显示技术（DDRT-PCR）和抑制性差减杂交（SuppressionSubtractiveHybridization，SSH）技术。,DDRT-PCR技术,DDRT-PCR技术的基本原理以一对细胞（或组织）的总RNA反转录而成的cDNA为模板，利用PCR的高效扩增，通过5端与3端引物的合理设计和组合，将细胞（或组织）中表达的约15000种基因片段直接显示在DNA测序胶上，从而找出一对细胞（或组织）中表达有差异的cDNA片段。对获得表达差异的基因片段进行回收、克隆、鉴定及分析。,DDRT-PCR技术基本流程,DDRT-PCR技术的优点简单，技术上仅仅依靠PCR和DNA测序胶电泳；所得到的差别条带往往不只一条，通常包含某一基因的上游及下游的调控基因；灵敏性高，仅需0.2g总RNA作为起始材料，可检出低丰度mRNA；实验周期短，约8d即可完成，便于重复，而且可重复性好；最突出的优点是实验过程中可步步验证比较；可进行多基因家族的表达分析，可以同时分析多组样品。,DDRT-PCR技术的不足假阳性率高，假阳性的比例有时高达5075；研究表明，差显技术对高丰度mRNA具有明显的倾向性；由于某些序列的特异性，一些差异表达的转录不能得到分离，所以凝胶中的单条带可能由1种以上cDNA片段所构成；差异显示所得的cDNA片段较短，长度多在100bp500bp之间，且大多位于mRNA3端约300bp的非翻译区（3UTR），很少能扩增到ORF（openreadingframe）区和5UTR区；不适合小范围的比较，要达到显示96%以上的mRNA至少需240对引物，要完全显示细胞中所有的mRNA种类，据估计需300种引物对。,DDRT-PCR技术的改进对引物体系的改进，目前第3代引物由GenHunter公司于1996年设计，将3端poly（dT）锚定引物和5端随机引物都带上Hind酶切位点，引物条数分别减为3条和8条，而碱基数分别增加至18个和13个，这样经计算机同源性分析表明所得到的24个组合同样能覆盖所有mRNA，使操作和后续处理更简便、快捷。其他改进包括：RT-PCR模板的改进、PCR反应参数的优化、凝胶电泳及标记方法的改进、杂交方式的改进等。,SSH技术,SSH技术原理SSH是差减杂交与抑制PCR结合的快速分离差异基因的方法。运用杂交的二级动力学原理，丰度高的单链cDNA退火时产生同源杂交的速度要快于丰度低的单链cDNA，从而使得丰度有差别的单链cDNA相对含量达到基本一致。而抑制性PCR，则是利用非目标序列片段两端的反向重复序列在退火时产生类似发夹的互补结构，使其无法与引物配对，从而有选择地抑制了非目的基因序列的扩增，从而使目的基因得到富集、分离。,SSH技术操作流程,SSH的优点假阳性率低：这是它的最大优点，由于SSH方法采用两次消减杂交和两次PCR，保证了该方法具有较高特异性；高敏感性：在杂交过程中可使不同丰度基因均衡化，获得低丰度差异表达基因；速度快，效率高：一次SSH反应可以同时分离几十或成百个差异表达基因；实验结果复杂程度低，SSH技术由于采用了接头、差减杂交及两轮抑制性PCR扩增，可大量特异扩增那些代表了差异表达的cDNA片段，因而减少了结果的复杂性。,SSH的缺点SSH技术的不足之处在于，每次只能比较两种样品之间基因表达的差异；SSH依赖较高的Rsa消化效率和接头连接效率，否则不带接头的testercDNA的杂交方式将和drivercDNA相同，导致一些差异表达的cDNA得不到富集而丢失。同样地，如果两组testercDNA与接头的连接效率不同，也将丢失一些差异表达cDNA；有时会产生嵌合cDNA（几率为2%）；起始材料需要g级量mRNA；SSH差减克隆片段较小，获取cDNA全长序列有一定难度；SSH技术中所研究的材料的差异不宜太大，最好是只有细微差别。,DNA诱变,DNA诱变,定点突变随机突变,定点突变,基于PCR的点突变不依赖于PCR的定点诱变方法,基于PCR的点突变,重叠延伸PCR法(Over-lapextensionPCR)大引物PCR(MegaprimerPCR)特殊位置碱基的定点突变扩增环状质粒全长的突变方法,重叠延伸PCR法(Over-lapextensionPCR),重叠延伸PCR法介导的定点突变原理图,大引物PCR(MegaprimerPCR),大引物PCR法流程（图中黑色实心三角形代表突变位点）,特殊位置碱基的定点突变,唯一限制性位点删除法（uniquesiteeliminationtechnique，USE）原理图（黑色实心三角形代表突变位点，实心椭圆代表酶切位点）,PCR介导定点诱变的优点,突变体回收率高在任何位点引入突变降低模板DNA形成二级结构的能力可利用商业试剂盒快速简便,PCR介导定点诱变的缺点,PCR产物有相对高的错误率在扩增DNA的3末端引入非预设的核苷酸每套引物和模板的条件都需要优化以亲本野生型DNA为模板的PCR反应中，污染可导致高比例的非突变的克隆,不依赖于PCR的定点诱变方法,盒式诱变(Cassettemutagenesis)寡核苷酸介导的诱变(Oligonucleotide-directedmutagenesis)Kunkel法,随机突变,PCR介导的随机突变DNA改组,StEP重组（StaggeredExtensionProcess）,RAISE重组（RandomInsertional-deletionalStrandExchangeMutagenesis）,随机引导重组（random-primingrecombination，RPR）,第七节转化、筛选与鉴定,一、重组DNA导入受体细胞二、重组子的筛选与鉴定三、DNA序列测定,一、重组DNA导入受体细胞,（一）受体细胞（receptercell）：就是能够摄取外源DNA并能够使其稳定存在的细胞。选择原则：（1）细胞要比较安全，无致病性或致病缺陷型，不会对外界环境生物污染。（2）重组DNA分子导入受体细胞要方便。（3）重组DNA分子要能够在该受体细胞内稳定存在。（4）重组DNA分子的筛选要方便。（5）遗传稳定性要高，利于扩大培养或长期培养。（6）选择蛋白水解酶基因缺失或蛋白酶含量低的细胞，以利于稳定大量收集目的蛋白产物。,（二）重组DNA导入原核细胞,常用方法：接合，转导，转化，电穿孔。1.Ca2+诱导大肠杆菌感受态转化法:基因原理：受体细胞经过CaCl2处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞。,2.电穿孔转化法,基本原理：通过高强度的电场作用，瞬时提高细胞膜的通透性，即形成可逆的瞬时通道，从而吸收周围介质中的外源分子。,3.接合转化法,基本原理：通过供体细胞同受体细胞间的直接接触而传递外源DNA的方法。,4.噬菌体转导法,转导是噬菌体介导的一种DNA或RNA转移过程。DNA载体能够承载较大的外源DNA片段，可以达到4851kb。,二、重组子的筛选与鉴定,（一）依据载体的选择性标记对转化子进行初步筛选1.抗药性筛选法：重组DNA载体上携带有受体细胞敏感的抗生素抗性基因时，通常可以取用转化体系涂布含该抗生素的选择培养平板的方法进行转化子的第一轮筛选