酵母双杂交系统技术介绍ppt课件

酵母双杂交系统技术介绍,宝日医生物技术（北京）有限公司,主要内容,背景介绍:关注蛋白质,背景介绍:为什么要研究蛋白互作？,背景介绍:Clontech酵母双杂交系统的功能,背景介绍:Clontech分子生物学工具,ClontechMatchmaker,背景介绍:MatchmakerGold系统,背景介绍:MatchmakerGold系统原理,ReporterGene,ReporterGene,ReporterGene,主要内容,基本原理:酵母双杂交参考文献,Nature.1989Jul20;340(6230):245-6.Anovelgeneticsystemtodetectprotein-proteininteractions.FieldsS,SongO.DepartmentofMicrobiology,StateUniversityofNewYorkatStonyBrook,StonyBrook11794.,63000次引用,基本原理:GAL4转录因子的结构,AD,DNA-BD,BD结合结构域,AD激活结构域,基本原理:GAL4转录因子的分子机理,在GAL4based双杂交系统中:,正常情况在酵母细胞内:,Promoter,galmetabolicgene,GALUAS,Transcription,AD,BD,ReporterGene,GAL4AD,基本原理:三个启动子，四个报告基因,X-a-gal蓝白筛选,M1,G1,G2,降低假阳性！,主要内容,ClontechMM系统的优点,SMART方法与同源重组技术结合构建文库，聪明的酵母自己做克隆。,AbA抗性筛选的添加，有效抑制背景生长，大大降低假阳性。,文库构建于型酵母菌株型Y187中，方便后续与a型菌株Y2HGold进行mating直接筛选。,ClontechMM系统:蛋白互作基本流程,验证蛋白互作,自己构建文库：630490预制细菌文库：638802（传统型）预制酵母菌文库：630480（均一化，通用型）,Clontech蛋白互作相关试剂盒,文库筛选,文库构建,酵母双杂交系统：630489酵母菌转化试剂盒：630439酵母培养基（套装）：630495插入片段检测：630497酵母质粒提取：630467,体内验证：630489630305体外Co-IP验证：630458630459631723631604,文库构建:ClontechMM文库构建方法,SMART合成cDNA,共转化，涂板,培养，收集菌液,文库分装，冻存,1mlmating,AAAAAAAAA,TTTTTTTT,CCC,AAAAAAAAA,TTTTTTTT,GGG,CCC,AAAAAAAAA,TTTTTTTT,GGG,LD-PCR,CCC,AAAAAAAA,TTTTTTTT,GGG,SMART合成cDNA,共转化，涂板,培养，收集菌液,文库分装，冻存,1mlmating,聪明的酵母,自己做克隆,SD/Leu-,Y187,同源重组,SMARTcDNA,两小时构建文库,文库构建:ClontechMM文库构建方法,SMART合成cDNA,共转化，涂板,培养，收集菌液,文库分装，冻存,1mlmating,SD/Leu-,文库构建:ClontechMM文库构建方法,文库构建:ClontechMM自制文库筛选,SMART合成cDNA,共转化，涂板,培养，收集菌液,文库分装，冻存,1mlmating,Y187，AD文库,Y2HGold，BD诱饵培养液,DDO/X/A,混合,QDO/X/A,文库筛选:ClontechMM文库筛选,630489MatchmakerGoldYeastTwo-HybridSystem,Y187Y2HGold,三个载体阳性对照，阴性对照。,BDvector：pGBKT7ADvector:pGADT7,630439极大提高转化率可以单独购买,文库筛选:ClontechMM系统质粒,文库筛选:诱饵载体构建及其自激活检测,Y2HGold诱饵载体,文库筛选:Mating方法筛选,Y187型,DDO筛选,二倍体,Y2HGolda型,Mating接合反应酵母的有性生殖过程，Clontech利用这个过程，实现了文库筛选。,AD,BD,MixMating,QDO筛选,文库筛选:均一化通用文库筛选,Y187，AD文库,Y2HGold，BD诱饵培养液,DDO/X/A,混合,QDO/X/A,文库筛选:传统细菌文库筛选,取1ml菌液按照一定比例用LB稀释，150ul/板进行涂板，过夜培养。,将提取的质粒转化Y187，获得酵母文库。,将文库与诱饵培养液混合，进行Mating。涂筛选板，挑取阳性克隆子。,刮取平板上的菌落，提取质粒。,文库筛选:验证阳性克隆子（PCR确认）,25ul2mix,30PCRcycles,25ulH2O,630497MatchmakerInsertCheckPCRMix2,文库筛选:酵母质粒提取,630467EasyyeastPlasmidIsolationKit,验证互作:体内验证,SEAP,630305MammalianMatchmakerTwo-HybridAssayKit2,验证互作:体外Co-IP验证,ProteinA/GAgarosebeads,MatchmakerChemiluminescentCo-IPVectorSet（630458）MatchmakerChemiluminescentCo-IPKit（630459）ProlabelChemiluminescentDetectionKit（631723）,验证互作:体外Co-IP验证实验流程,PL检测,验证互作:FRET分析,632466pDsRed-Monomer-C1Vector,632470pAcGFP1-C1-Vector,ClontechMatchmaker系统产品选择指南,TheFRIGIDAComplexActivatesTranscriptionofFLC,aStrongFloweringRepressorinArabidopsis,byRecruitingChromatinModificationFactorsKChoi,JKim,HJHwang,SKim-ThePlantCell,2011-AmSocPlantBiolExtracellularsignal-regulatedkinase8(Erk8)controlsestrogen-relatedreceptor(ERR)cellularlocalizationandinhibitsitstranscriptionalactivityMRossi,DColecchia,CIavarone,AStrambi-JournalofBiological,2011ASBMBWSB-1,anovelIL-21receptorbindingmolecule,enhancesthematurationofIL-21receptorHNara,TOnoda,MRahman,AAraki-Cellular,2011ElsevierFHL1interactswithoestrogenreceptorsandregulatesbreastcancercellgrowthLDing,CNiu,YZheng,ZXiong-JournalofCellular,2011-WileyOnlineLibraryRab4interactswiththehumanPglycoproteinandmodulatesitssurfaceexpressioninmultidrugresistantK562cellsCFerrndizHuertas-JournalofCancer,2011-WileyOnlineLibrary6.DuplicatedC-classMADS-boxgenesrevealdistinctrolesingynostemiumdevelopmentinCymbidiumensifolium(Orchidaceae)SYWang,PFLee,YILee,YYHsiao-PlantandCell,2011-JpnSocPlantPhysiolProteinInteractionDomainMappingofHumanKinetochoreProteinBlinkinRevealsaConsensusMotifforBindingofSpindleAssemblyCheckpointProteinsBub1andBubR1TKiyomitsu,HMurakami-MolecularandCellular,2011-AmSocMicrobiol,ClontechMatchmaker系统近期参考文献,主要内容,常见问题分析:酵母双杂交文库如何获得？,购买Clontech公司预制文库,用630490自己构建文库,请Takara公司提供文库构建服务,如何获得酵母双杂交文库,常见问题分析:一定要做自激活检测吗？,必须滴！,自激活检测必须做：1.需要在Y2HGold菌株中进行。2.如果出现自激活现象需要调整AbA浓度或者调整序列。3.如果菌落生长过慢，可能是表达有毒性，需要用低拷贝质粒pGBT9(630490提供)。,常见问题分析:诱饵的大小有限制吗？,我们有文献报道的8-750个氨基酸都有成功的案例。Heery,D.M.etal.(1997)Nature387(6634):733736.2.Sc