氨基酸幻灯片.ppt

欧阳红生动物生物技术系吉林大学畜牧兽医学院Email:biotechsTel第三章氨基酸,Chapter3AminoAcid,Copyright2008byOuyangHongsheng.Allrightsreserved.,1,主要内容：,主要介绍氨基酸的结构、分类、酸碱性质、化学性质、光谱性质和分析分离方法。,2,分子中既含有氨基又含有羧基的化合物是氨基酸。-氨基酸是组成蛋白质的基本单位。,3,一、氨基酸-蛋白质的构件分子,（一）蛋白质的水解（二）-氨基酸的一般结构,4,一、氨基酸-蛋白质的构件分子,（一）蛋白质的水解蛋白质完全水解和不完全水解蛋白质三种水解方法：酸水解、碱水解和酶水解,5,（一）蛋白质的水解,(1)酸水解水解方法：6mol/LHCl或4mol/LH2SO4;回流煮沸20h特点：完全水解缺点：色氨酸破坏；羟基氨基酸小部分分解；天冬酰胺和谷氨酰胺的酰胺基被水解下来。(2)碱水解水解方法：5mol/LNaOH共煮10-20h特点：完全水解缺点：消旋作用；引起精氨酸脱氨。(3)酶水解水解方法：胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶特点：不完全水解,6,（二）-氨基酸的一般结构,7,（二）-氨基酸的一般结构,肽键由一个氨基酸的氨基与另一个氨基酸的羧基缩合，失去一分子水形成的酰胺键，称为肽键。,Peptidebond,8,二、氨基酸的分类,从各种生物体中发现的氨基酸已有180多种，参与蛋白质组成,由基因编码的氨基酸有20种。,9,10,(一)常见的蛋白质氨基酸,按侧链基团的化学结构可将20种常见氨基酸分为3类.,11,(一)常见的蛋白质氨基酸,按侧链基团的极性可将20种常见氨基酸分为4组.,12,13,14,15,16,17,18,19,(二)不常见的蛋白质氨基酸,不常见的蛋白质氨基酸不被基因编码，是氨基酸修饰结果羟基修饰的氨基酸5-羟赖氨酸与5-羟哺氨酸。存在于结缔组织的胶原蛋白中。甲基修饰的氨基酸3-甲基组氨酸、-N-甲基赖氨酸。存在于肌肉蛋白如肌球蛋白中。-羧基谷氨酸存在于与血液凝固有关的蛋白质如凝血酶原中。焦谷氨酸存在于细菌紫膜质的一种光驱动的质子泵蛋白质中。磷酸化修饰的氨基酸丝氨酸、苏氨酸与酪氨酸中的羟基进行磷酸化。,20,(二)不常见的蛋白质氨基酸,三碘甲腺原氨酸存在于甲状腺素和甲状腺球蛋白中。,21,(三)非蛋白质氨基酸,存在于各种生物各种组织和细胞中。,22,三、氨基酸的酸碱化学,(一)氨基酸的兼性离子形式,偶极离子(dipolarion)兼性离子(zwitterion),氨基酸晶体熔点很高，达200以上。说明氨基酸晶格与介质分子的维系不是范德华力，而是较强的静电引力。,23,(二)氨基酸的两性解离,Brnsted的酸碱理论，即广义酸碱理论。HAA-+H+酸碱质子,24,氨基酸在水中的两性离子既能像酸一样放出质子，也能像碱一样接受质子，氨基酸具有酸碱性质，是一类两性电解质。Asanacid（protondonor）：Asabase（protonacceptor）：,25,不同pH时氨基酸以不同的离子化形式存在,26,酸碱滴定曲线,Henderson-Hasselbalch方程,pH=pKa+lg,质子受体,质子供体,27,28,29,(三)氨基酸的等电点,氨基酸所带静电荷为“零”时，溶液的pH值称为该氨基酸的等电点（isoelectricpoint），以pI表示。,30,实验证明在等电点时，氨基酸主要以两性离子形式存在，但也有少量的而且数量相等的正、负离子形式，还有极少量的中性分子。当溶液的pH=pI时，氨基酸主要从两性离子形式存在。pHpI时，氨基酸主要以负离子形式存在。,31,等电点计算中性氨基酸：以Gly为例,K1=,GlyH+,Gly+,K2=,Gly-H+,Gly,pI时，,Gly+=Gly-,GlyH+,K1,=,GlyK2,H+,H+2=K1K2,pH=（pK1+pK2）/2,pI=（pK1+pK2）/2,pI=（2.34+9.60）/2=5.97,Gly,32,等电点计算-酸性氨基酸以Asp为例,33,等电点计算-碱性氨基酸以Lys为例,34,(四)氨基酸的甲醛滴定,35,36,四、氨基酸的化学性质,37,（一）-氨基参加的反应1.与亚硝酸(HNO2)反应,氨基酸的氨基在室温下与亚硝酸作用生成氮气。在标准条件下测定生成氮气的体积，即可计算出氨基酸的量。需要注意的是生成的氮气只有一半来自氨基酸。,38,2.与酰基试剂反应,酰氯：,（R酰基）,苄氧酰氯（Cbz-Cl）:,对甲苯磺酰氯(Tos-Cl):,叔丁氧酰氯(Boc-Cl):,酸酐：,邻苯二甲酸酐：,弱碱,这些酰化试剂在多肽和蛋白质的人工合成中被用作氨基的保护试剂。,39,Cbz-Cl,Cbz-氨基酸,40,氨基酸与5一二甲氨基萘-1-磺酰氯(丹磺酰氯dansylchloride,DNS）的反应,此反应可用于多肽链N末端氨基酸的标记和微量氨基酸的定量测定。,41,3.烃基化反应,（R烃基）,与2、4二硝基氟苯的反应,2，4二硝基氟苯,弱碱,42,DNFB,DNP-氨基酸（黄色）,氨基酸与DNFB的反应被英国的Sanger用来鉴定多肽、蛋白质的N末端氨基酸。,43,与苯异硫氰酸（酯）的反应,PTC-氨基酸,PTH-氨基酸,44,与苯异硫氰酸（酯）的反应,PTC-氨基酸,PTH-氨基酸,此反应被Edman用于鉴定多肽或蛋白质的N端氨基酸。它在多肽和蛋白质序列分析方面占有重要地位。,45,3.形成西佛碱反应,氨基酸的氨基能与醛类化合物反应生成西佛碱。,4.脱氨基反应,在氨基酸氧化酶催化下脱去-氨基生成酮酸。,46,(二)-羧基参加的反应,1.成盐和成酯反应,47,酰化氨基酸,对硝基苯酚,酰化氨基酸对-硝基苯酯,（活化酯）,（式中Y酰基）,48,2.成酰氯反应,49,3.成酰胺反应,体外：体内：Asp+NH4Asn,ATP,酶,50,4.脱羧基反应,51,5.叠氮反应,氨基酸叠氮化合物常用于肽的人工合成。,52,(三)-氨基和-羧基共同参加的反应,1.茚三酮反应,53,2.成肽反应,54,(四)侧链R基参加的反应,R-SH：HS-CH2CH2OH巯基乙醇（mercaptoethanol）,HS-CH2COOH巯基乙酸（mercaptoaceticacid）,HS-CH2(CHOH)2-CH2SH二硫苏糖醇（dithiothreitol,DTT）,过甲酸,55,半胱氨酸的-SH很活泼，很容易在空气中重新氧化形成二硫键，一般可用卤代化物对-SH进行保护。,56,苯环的黄色反应,TyrOr+浓HNO3黄色Trpphe+少量浓H2SO4+浓HNO3黄色,57,酚基的Millon反应（米伦氏反应）,HgNO3Tyr+Hg(NO3)2红色HNO3,58,pauly反应,His+重氮苯磺酸红色（棕红色）Tyr+重氮苯磺酸橘黄色,59,Folin酚反应,Tyr磷钼酸Or+蓝色（钼蓝与钨蓝混合物）Trp磷钨酸,60,五、氨基酸的光学活性和光谱性质,构型：组成蛋白质的氨基酸除Gly以外都有手性碳原子，在三维空间上就有两种不同的排列方式，它们互为镜影，这两种不同的构型分别称为D-型和L-型。,61,以丙氨酸为例：,62,如含两个手性碳原子，则有种立体异构体，分别称为-,-，别-和别-氨基酸。,L-苏氨酸,(L-threonine),D-苏氨酸,(D-threonine),L-别-苏氨酸,(L-allo-threonine),D-别-苏氨酸,(D-allo-threonine),63,蛋白质中的氨基酸都是L-型。(Gly除外),64,紫外吸收光谱,组成蛋白质的氨基酸中，Trp、Tyr和Phe对紫外光有一定的吸收，这是因为它们分子中含有苯环，是苯环的共轭双键造成的，这三个氨基酸的光吸收都在280nm附近。,65,66,六、氨基酸混合物的分析分离,(一)分配层析法的一般原理主要根据被分析的样品（如aa混合物）在两种互不相溶的溶剂中分配系数的不同而达到分离的目的。分配系数Kd=CA：一种物质在A相（流动相）中的浓度CB：一种物质在B相（固定相）中的浓度,CA,CB,67,用逆流分配的方法说明分配层析原理,68,69,纸层析,70,双向纸层析图,71,薄层层析,72,离子交换层析,原理：分离氨基酸时，用离子交换树脂作为支持物，利用离子交换树脂上的活性基团与溶液中的离子进行交换反应，由于各种离子交换能力不同，与树脂结合的牢固程度就不同，在洗脱过程中，各种离子以不同的速度移动，从而达到分离的目的。这种分离主要与各种离子所带电荷有关，在电荷相同时，与极性，非极性有关。,73,离子交换树脂：,外观：化学本质：是一种人工合成的聚苯乙烯一苯二乙烯组成的具有网状结构的高分子聚合物。,74,阳离子交换树脂：活性基团是酸性的，如磺酸基-SO3H（强酸型），羧基-COOH（弱酸型）阴离子交换树脂：活性基团是碱性的，如季胺基-N+(CH3)3OH-,75,76,茚三酮显色：仪器灵敏度10-9molOPA（邻苯二甲醛），荧光胺：灵敏度10-12mol。,77,高效液相层析（highperformanceliquidchromatography,HPLC）,特点使用固定相支持剂颗粒很细，因而比表面积很大；溶剂系统采取高压，因此洗脱速度增大。,78,HPLC：,（1）反相层析（reversephasechromatography）（2）离子交换层析（3）凝胶过滤HPLC可使氨基酸分析的灵敏度达到10-12m