SDS-PAGE配方

SDS-PAGE1) 根据目的蛋白的分子量大小选择合适的凝胶浓度，再按照下面的表格配制SDS-PAGE的分离胶(即下层胶)：SDS-PAGE分离胶浓度最佳分离范围6%胶50-150kD8%胶30-90kD10%胶20-80kD12%胶12-60kD15%胶10-40kD成分配制不同体积SDS-PAGE分离胶所需各成分的体积（毫升）6%胶51015203050蒸馏水2.04.06.08.012.020.030%Acr-Bis(29:1)1.02.03.04.06.010.01M Tris,pH8.81.93.85.77.611.419.010%SDS0.050.10.150.20.30.510%过硫酸铵0.050.10.150.20.30.5TEMED0.0040.0080.0120.0160.0240.04成分配制不同体积SDS-PAGE分离胶所需各成分的体积（毫升）8%胶51015203050蒸馏水1.73.35.06.710.016.730%Acr-Bis(29:1)1.32.74.05.38.013.31M Tris,pH8.81.93.85.77.611.419.010%SDS0.050.10.150.20.30.510%过硫酸铵0.050.10.150.20.30.5TEMED0.0030.0060.0090.0120.0180.03成分配制不同体积SDS-PAGE分离胶所需各成分的体积（毫升）10%胶51015203050蒸馏水1.32.74.05.38.013.330%Acr-Bis(29:1)1.73.35.06.710.016.71M Tris,pH8.81.93.85.77.611.419.010%SDS0.050.10.150.20.30.510%过硫酸铵0.050.10.150.20.30.5TEMED0.0020.0040.0060.0080.0120.02成分配制不同体积SDS-PAGE分离胶所需各成分的体积（毫升）12%胶51015203050蒸馏水1.02.03.04.06.010.030%Acr-Bis(29:1)2.04.06.08.012.020.01M Tris,pH8.81.93.85.77.611.419.010%SDS0.050.10.150.20.30.510%过硫酸铵0.050.10.150.20.30.5TEMED0.0020.0040.0060.0080.0120.02成分配制不同体积SDS-PAGE分离胶所需各成分的体积（毫升）15%胶51015203050蒸馏水0.51.01.52.03.05.030%Acr-Bis(29:1)2.55.07.510.015.025.01M Tris,pH8.81.93.85.77.611.419.010%SDS0.050.10.150.20.30.510%过硫酸铵0.050.10.150.20.30.5TEMED0.0020.0040.0060.0080.0120.02注：如果配制非变性胶，参考上述配方，不加10%SDS即可配制成非变性PAGE胶。10%过硫酸铵配好后可以在4D冰箱放两周，但是最好新鲜配置效果好。1) 按照如下表格配制SDS-PAGE的浓缩胶(也称堆积胶、积层胶或上层胶)：成分配制不同体积SDS-PAGE浓缩胶所需各成分的体积（毫升）5%胶2346810蒸馏水1.42.12.74.15.56.830%Acr-Bis(29:1)0.330.50.671.01.31.71M Tris,pH8.80.250.380.50.751.01.2510%SDS0.020.030.040.060.080.110%过硫酸铵0.020.030.040.060.080.1TEMED0.0020.0030.0040.0060.0080.015XTris-Glycine 电泳缓冲溶液 1L0.125M Tris， 1.25M Glycine， 0.5% W/V SDSTris 15.1 gGlycine 95 gSDS 5.0 g5X SDS-PAGE 加样缓冲液：5ml250mM Tris-HCl (pH6.8), 10% SDS, 0.5% BPB, 50% glycerol, 5% 2-ME1M Tris-HCl (pH6.8): 1.25 mLSDS： 0.5 gBPB: 25mgGlycerol: 2.5ml2-ME: 使用时加入小份（25微升），新鲜使用。TBST 缓冲液每2L体积中含：1M TrisHCL(pH7.5)100mLNacl16gKCL0.4g吐温1ml1) 抗体去除液每50mL抗体去除液中含：0.5M TrisHCL（pH6.8）6.25mL10%SDS10mLBeta-ME0.175mL水33.75mLSDS-PAGE电泳的基本原理：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠），SDS会与变性的多肽，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关，在达到饱和的状态下，每克多肽可与1.4g去污剂结合。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关；制胶缓冲液：浓缩胶选择pH6.7，分离胶选择pH8.9，选择trisHCL系统，具体作用后面介绍；