3.第四章 抗菌药物敏感试验.ppt

第四章抗菌药物敏感试验,抗菌药物敏感试验（AST）：指体外测定药物抑制或杀死细菌能力的试验。AST意义：预测抗菌治疗的效果指导临床选择用药进行耐药菌监测评价新药的效果,第一节抗菌药物敏感性试验,一、抗菌药物选择A组常规首选药物，全部报告B组医院感染重要药物，选择性报告C组用于A、B组耐药或过敏的患者U组用于尿道分离细菌O组一般不允许常规试验并选择的药物,（一）非苛养菌肠杆菌科、葡萄球菌、肠球菌、假单胞菌及其他非肠道杆菌、链球菌（肺炎链球菌除外）（二）苛养菌肺炎链球菌、奈瑟菌属、嗜血杆菌属等,二、纸片扩散法（K-B法）,（一）实验原理将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上，纸片中所含有的药物溶解后向周围扩散形成递减的梯度浓度，在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制，从而形成无菌生长的透明圈即为抑菌圈。抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的MIC呈负相关,（二）培养基和抗菌药物纸片1.抗菌药物纸片专用药敏纸片：直径-6.35mm吸水量-20微升2.培养基水解酪蛋白（M-H）琼脂，琼脂厚度4mm链球菌属、肠球菌属、脑膜炎奈瑟菌：加5%脱纤维羊血嗜血杆菌属：、因子,纸片扩散法,3.菌液比浊管-0.5麦氏比浊管的制备：1%氯化钡：0.5ml1%硫酸溶液：99.5ml625nm处吸光度值为0.080.10，相当于1.5108cfu/ml用前混匀有效期：6个月,纸片扩散法,（三）实验方法,1.制备接种菌液菌液调至0.5麦氏比浊标准，15min内使用2.接种平板用无菌棉试子蘸取菌液，均匀涂布于琼脂表面室温干燥35min3.贴纸片纸片间距24mm边距15mm4.孵育置35孵育1618h测量抑菌圈直径,纸片扩散法,（四）结果判读和报告,1.敏感（S）：表示测试菌可被测定药物常规剂量给药后所达到的血药浓度所抑制或杀死2.中介（I）：提高药物浓度或药物浓集部位有效。意义不确定3.耐药（R）：测试菌不能被在体内感染部位可能达到的抗菌药物浓度所抑制，且不管其剂量大小或细菌所在部位,影响纸片法药敏结果的因素,1.培养基（1）合格的MH琼脂pH7.27.4（2）厚度：4mm90mm平板：25ml（3）保存28：7天用前35孵育30min（4）不含钙、镁离子（5）特殊营养要求细菌添加必要的营养成分,2.菌悬液浓度标准0.5麦氏比浊标准管，用前混匀，每月更换3.含药纸片备用纸片：-20工作纸片：44.操作质量5.孵育条件、温度和时间6.抑菌圈测量工具的精度7.质控菌株本身的药敏性是否合格,（五）质量控制,1.菌液浓度：0.5麦氏比浊2.培养基：M-H肉汤3.质控菌株：金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、肠球菌等ATCC:AmericanTypeCultureCollection,（1）大部分需氧菌：（352），空气培养，1618h；如肠杆菌科细菌、假单胞菌属细菌、葡萄球菌、肠球菌和霍乱弧菌等；（2）不动杆菌、洋葱伯克霍尔德菌和嗜麦芽窄食单胞菌：（352），空气培养，2024h；（3）嗜血杆菌属：（352），5%CO2，1618h；链球菌属和奈瑟菌属的培养时间为2024h；,（4）淋病奈瑟菌：（361）（不能超过37），5%CO2，2024h。（5）葡萄球菌检测对甲氧西林、苯唑西林、奈夫西林和万古霉素时培养时间必须延长至24h（金葡为18h）且温度不超过35；检测肠球菌对万古霉素的敏感性时，必须延长培养时间至24h。,三、稀释法,（一）肉汤稀释法有常规稀释法和微量稀释法原理：以M-H液体培养基将抗菌药物做不同浓度稀释，然后接种待测菌，定量测定抗菌药物抑制或杀死该菌的最低抑菌浓度（MIC）或最低杀菌浓度(MBC)。,MIC：抗菌药物能够抑制细菌生长所需要的最低浓度。单位：g/ml或U/mlMBC：抗菌药物能够杀灭99.9%接种菌所需要的最低浓度,1.培养基离子校正M-H肉汤（CAMHB）：Ca2+、Mg2+2.药物稀释（1）配制抗菌药物原液：1000g/ml重量（mg）=溶剂（ml）浓度（g/ml）/药物效价（g/mg）体积（ml）=重量（mg）药物效价（g/mg）/浓度（g/ml）（2）稀释抗菌药物的制备,例1：需配制100ml浓度为1280g/ml的抗生素贮存液，所用抗生素为粉剂，其药物的有效力为750g/mg，需要精确称取抗生素粉剂的量为多少？例2：称取抗生素粉剂的量为182.6mg，需要溶解在多少毫升溶剂中？,3.菌种接种菌液的准备：0.5麦氏比浊标准，1：10稀释试验步骤抗菌药物终含量：512、216、1280.25、0.125g/ml最终菌液浓度：5105CFU/ml,1）抗菌药物稀释：取试管13支，另取3支标记上“肉汤对照”、“测试菌生长对照”、“质控菌生长对照”。除第1管外每管加肉汤2ml，1、2号管加待测最高浓度药液2ml，依次对倍稀释至13管。2）测试菌的准备：0.5麦氏比浊标准，1：10稀释3）接种：取0.1ml待测菌依次由低浓度到高浓度加到13支管中。4）孵育：35孵育1618h,4.结果判读以肉眼观察无菌生长孔为最低抑菌浓度（MIC）结果报告：MIC（g/ml）,5.质量控制,（1）细菌终浓度：5105CFU/ml（2）基础培养基：离子校正的MH肉汤苛养菌：加入必要的补充物质（3）质控菌株：同纸片法,（二）琼脂稀释法原理将待测菌接种于含不同浓度的抗菌药物的琼脂平板上。经培养后观察菌落的生长情况，以能抑制细菌生长的最低药物浓度为该菌的最低抑菌浓度（MIC）。,优点比液体稀释法重复性好每个平板同时可测定多株细菌可观察被检菌集落生长良好与否可发现污染菌落,1.培养基：M-H琼脂2.含药琼脂的制备抗菌药物原液的配制2000g/ml药物：琼脂=1：9（2.5ml药液+22.5ml琼脂）贮存日期：5天接种菌液的准备0.5麦氏标准，10倍稀释,琼脂稀释法,3.细菌接种（1）画格编号（2）点种待测菌：13l/格直径5-8mm（104CFU/点）（3）培养1824h观察结果,琼脂稀释法,4.结果判读先读质控平板的MIC，再读待检菌平板的MIC；在前后二个不同梯度浓度的抗生素M-H琼脂平板上，细菌生长数量由80%90%突然减少为结果终点，即MIC值。结果报告：MIC（g/ml）或敏感（S）、中介(I)、耐药(R),琼脂稀释法,注意事项薄雾状生长不算小于5个菌落不算若在数个平板上出现跳管生长现象应重做。,琼脂稀释法,四、E试验,结合了稀释法和扩散法的原理和特点操作简便同扩散法可以直接定量出测试药物对测试菌的MIC,（一）原理E试条是一条5mm50mm，内含有一系列预先制备的、浓度呈连续指数增长稀释抗生素。将E试条放在接种细菌的平板上，孵育过夜，出现椭圆形抑菌圈，圈的边缘与试条交点的刻度浓度即为抗生素抑制细菌的特定浓度，又称抑菌浓度（IC）。,（二）培养基M-H琼脂（三）细菌接种和加样1.接种菌准备、平板接种：同扩散法2.用E试验加样器或镊子将试条放在接种细菌的平板表面，试条刻度面朝上。150mm平板：可放6条90mm平板：12条,E试验,（四）结果判断和报告读取椭圆环和E试条交界点的IC值1.试条两侧的抑菌圈与试条相交在同一点，读取相交处的刻度数值。2.试条两侧的抑菌圈与试条相交处位于试条上所示上下两刻度之间时，读取较高的刻度值。,E试验,3.试条两侧的抑菌圈与试条相交处不一致时，读取刻度值较高的一侧所示的读数。4.沿试条边缘生长的纤细菌线可忽略不计。5.在椭圆形抑菌圈与试条相交处或圈内有小菌落或大菌落时，应读生长被完全抑制的部分与试条相交处的读数。,E试验,五、联合药物敏感试验,（一）联合药敏试验意义1.目的：（1）用于病原菌尚未确定的急、重症感染的经验治疗（2）治疗多种细菌引起的混合性感染（3）预防或推迟细菌抗生素耐药性的发生（4）可以减少用药剂量（5）对于某些耐药菌可取得协同抗菌效果,2.结果与类型无关作用:两种药物联合作用的活性等于其单独活性。拮抗作用：两药联合作用显著低于单药活性累加作用：两种药物联合作用的活性等于其单独活性之和。协同作用：两种药物联合作用显著大于其单独作用的总和。,（二）联合抑菌试验,1.单药纸片搭桥法定性试验两种含药纸片贴于含菌琼脂表面，药物联合对被检菌作用可出现不同的图形。根据图形解释结果。两种药物间距：34mm,单药纸片搭桥法,2.棋盘稀释法定量试验,（1）原理将甲乙两药的各种稀释度加以组合，组成联合药敏管。同时两种药物每一稀释度都有一只加单一药物的单独药敏管。根据单一药物对被检菌的MIC和联合药敏管中的抑菌情况，可精确测定两药在适当浓度比例下所产生的相互作用。,（2）试验步骤1）确定单药的MIC2）确定联合药敏的药物稀释度每一稀释度浓度为联合药敏管内所需单药终浓度的2倍用MH液体培养基将甲乙两药稀释68个稀释度,3.棋盘状排列无菌试管排列6排无菌试管，每排6支4.加甲、乙两药（分别从横、竖排加入）每管各1ml，横排和纵排的第一管为无药对照，第一排为单药对照管5.加待测菌液各管加入被检菌液0.01ml菌液终浓度：105CFU/ml,甲药稀释,乙药稀释,例：甲药MIC单独16mg/L乙药MIC单独4mg/L,结果判读FIC：部分抑菌浓度指数甲药联合时MIC乙药联合时MICFIC=+甲药单独时MIC乙药单独时MICFIC2拮抗作用,32168420甲药浓度,00.130.250.512乙药,FIC=8/16+1/1=1.5,0163264128256乙药,FIC=0.03/0.25+64/256=0.37FIC=0.06/0.25+32/256=0.365,0.250.1250.060.030.0150,第五章细菌的分类与命名,第一节概述一、基本概念1.分类（1）人为分类法：以形态、生理生化特征为依据（2）系统分类法：以细菌大分子物质结构的同源程度分类2.命名3.鉴定,二、分类等级,细菌的分类层次界、门、纲、目、科、属、种1.种(species)是细菌分类的基本单位。生物学性状基本相同的细菌群体构成一个菌种；2.菌属：性状相近关系密切的若干菌种组成一个菌属（genus）,3.亚种和型：同一菌种的各个细菌，虽性状基本相同，但在某些方面仍有一定差异，差异较明显的称亚种(subspecies,subsp.)，差异小的则为型(type)。血清型：依据抗原结构的差异噬菌体型：噬菌体的敏感性生物型：生化反应和生物学性状,4.菌株：对不同来源的同一菌种的细菌称为该菌的不同菌株(strain)。标准菌株(standardstrain)或模式菌株(typestrain）：具有某种细菌典型特征的菌株。,三、细菌的命名法,拉丁双名法Escherichiacoli（E.coli）属名种名中文：大肠埃希菌种名属名,第二节细菌的分类方法,一、生物学特性分类法传统分类法、数值分类法二、遗传学分类法-系统分类法（一）DNA碱基比例的测定DNA碱基比例指DNA分子中G、C所占的摩尔百分比值，反映细菌间DNA分子同源程度。,第三十五章细菌耐药性检测,第一节抗菌药物种类及作用机制,抗菌药物（antibioticsagents）具有杀菌或抑菌活性的抗生素和化学合成药物。杀菌药（bactericidaldrug）青霉素类、氨基苷类等抑菌药（bacteriostaticdrug）大环内酯类、四环素、磺胺等,抗菌药物的种类,一、青霉素类,（一）种类1.天然青霉素：青霉素G、青霉素V；2.耐青霉素酶青霉素：甲氧西林、奈夫西林、苯唑西林、氯唑西林等；3.广谱青霉素氨基组：氨苄西林、阿莫西林羧基组：羧苄西林、替卡西林脲基组：美洛西林、派拉西林,（二）作用机制与青霉素结合蛋白（PBP）结合，抑制肽聚糖合成中所需的转肽酶，阻止肽聚糖链的交叉连接，干扰细胞壁合成。繁殖期杀菌药,1.肽聚糖合成过程中的关键步骤（1）N-乙酰胞壁酸-五肽的合成：细胞浆内（2）N-葡萄糖胺-N-乙酰胞壁酸-五肽-磷脂：细胞膜上完成（3）肽聚糖的交叉连接：细胞膜外原有细胞壁上完成,2.肽聚糖合成过程中需要的酶（1）转糖基酶：催化-1，4糖苷键形成（2）转肽酶：使N-乙酰胞壁酸-五肽脱去末端的D-丙氨酸，与另一条肽链的肽桥（五肽交联桥）交联，形成三维网状结构（3）羧肽酶：催化五肽末端D-丙氨酸水解（4）内肽酶：催化水解已合成肽聚糖上的肽键细菌生存必需的是转肽酶和转糖基酶,二、头孢菌素类,1.第一代头孢：头孢氨苄、头孢唑啉、头孢拉定、头孢噻吩、头孢羟氨苄等2.第二代头孢：头孢孟多、头孢呋辛等3.第三代头孢：头宝噻肟、头孢曲松、头孢他定、头孢派酮等；4.第四代头孢：头孢匹罗、头孢吡肟,三、其他-内酰胺类,（一）单环类：氨曲南、卡芦莫南（二）拉氧头孢类：头孢西丁、头孢替坦等（三）碳青霉烯类：亚胺培南、美罗培南等（四）酶抑制剂：克拉维酸、舒巴坦、三唑巴坦,二、氨基糖苷类,1.种类链霉素、庆大霉素、卡那霉素、妥布霉素、阿米卡星、丁胺卡那霉素等2.作用机制选择性地与核糖体30S小亚基结合，影响蛋白质合成的全过程。静止期杀菌药,三、喹诺酮类,1.种类吡哌酸、氟哌酸、环丙沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星、罗美沙星、诺氟沙星等2.作用机制作用于细菌的DNA旋转酶，干扰DNA合成,四、大环内酯类,1.种类红霉素、罗红霉素、螺旋霉素、吉他霉素、麦迪霉素、阿齐霉素等2.作用机制与细菌核糖体50S亚基结合，抑制转肽作用，影响核蛋白位移，从而抑制蛋白质合成,五、磺胺类,1.种类磺胺嘧啶、甲氧苄胺嘧啶、复方新诺明等2.作用机制影响核酸合成，抑制细菌生长繁殖,六、其他抗生素,1.四环素类种类：四环素、土霉素、多西环素（强力）作用机制：与细菌30S亚基结合，抑制蛋白质合成2.氯霉素类与细菌50S亚基结合，抑制蛋白质合成,3.硝基呋喃类种类：呋喃妥因、呋喃唑酮（痢特灵）作用机制：干扰细菌体内氧化还原酶系统4.硝基咪唑类种类：甲硝唑、替硝唑作用机制：阻断细菌DNA合成,抗菌药物的作用机制,第二节细菌的耐药性和产生机制,细菌的耐药性：对某种药物敏感细菌变成对该药物耐受机制产生耐药酶：水解酶、钝化酶等药物作用的靶位点改变细胞膜的通透性改变细菌主动外