中西医结合-基因诊断1

第十六章基因诊断与基因治疗,广州中医药大学生物化学教研室,第一节基因诊断GeneticDiagnosis,内容,基因诊断概述基因诊断的方法基因诊断的应用,1.基因诊断概述,（1）为什么要进行基因诊断,遗传因素(geneticfactors)在疾病发生发展中的作用已越来越被人们所认识。随着分子生物学、分子遗传学的迅速发展，人们对疾病发病机制的认识逐渐深入到基因水平，推动了诊断和防治技术的新发展。从分析基因变异着手对疾病进行诊断的方法应运而生，并正在逐步发展和完善，显现出了强大的生命力。,全球十大致命疾病,（一）心脏病北美、欧洲、大洋洲主要疾病，特别是老年人，仅美国每年就有75万人死于此病。（二）恶性肿瘤(癌)百余种，至今尚未发现特效治疗方法。（三）脑血管病变(亦叫中风或脑溢血)对老年人危害严重。（四）胃肠炎(包括痢疾)此病在不发达的国家和地区死亡率很高。（五）流行性感冒及肺炎无特殊预防和治疗方法，发病于世界各地。,（六）支气管炎(包括肺气肿和气喘)（七）糖尿病多见于发达国家，无根治的办法。（八）肝硬化与过量饮酒及某些维生素的缺乏有关。（九）结核病19世纪回升（十）感染性疾病及外伤在不发达国家，儿童死亡率较高。意外性死亡包括车祸等,2005年城市居民前十位死因为：恶性肿瘤、脑血管病、心脏病、呼吸系统疾病、损伤及中毒、消化系统疾病、内分泌营养和代谢疾病、泌尿生殖系统疾病、精神障碍、神经系统疾病，前十位死因合计占死亡总数的92.0%。,2005年农村居民前十位死因为：呼吸系病、脑血管病、恶性肿瘤、心脏病、损伤及中毒、消化系病、泌尿生殖系病、内分泌营养和代谢疾病、肺结核、精神障碍，前十位死因合计占死亡总数的91.9%。,疾病分类：非基因病基因病,非基因病：,基因病：心脏病肿瘤脑血管病糖尿病帕金森病哮喘关节炎阿尔茨海默病,（2）基因诊断(GeneticDiagnosis)的概念,应用分子生物学和分子遗传学的技术方法，在DNA或RNA水平，通过检测致病基因（内源或外源）的存在、基因结构缺陷或表达异常，对人体状态和疾病作出诊断的方法。,Fourtypesofdiagnosis,nucleus,Clinicalmanifestation,（3）基因诊断的特点,属于“病因诊断”，针对性和特异性强精确性和灵敏度高，微量标本即可进行诊断检测标本适应性广诊断感染性疾病早期、快速,（4）基因诊断的意义,遗传性疾病的诊断与产前及植入前诊断（优生优育）确定与疾病有关联的状态，如疾病易感性、可能的抗药性、发病类型和阶段等传染性疾病早期（产生抗体前）诊断以及带病毒人的检出分析基因型，使器官移植组织配型精确法医鉴定（DNA指纹法）,基因诊断的内容和技术（一）基因诊断的分子基础,遗传病的特定基因通常存在结构变异，其碱基序列与正常基因不同，可以通过DNA测序或多态性分析进行诊断。有些疾病的基因结构正常，但表达异常，（例如RNA的合成量异常或转录后加工异常），可以通过对RNA进行定量分析、检测RNA转录合成缺陷、转录后加工缺陷、外显子变异等进行诊断。,传染病的发生是病原体侵入、病原体基因表达的结果，可以通过设计病原体核酸探针、寻找病原体特异基因或特异序列进行诊断。,（二）基因异常的直接诊断,直接诊断是指检测与疾病有直接因果关系的致病基因，从而对疾病做出正确诊断。直接诊断的必要条件是：致病基因异常的确是导致疾病发生的根本原因；致病基因的定位已经明确；致病基因的异常结构或异常表达已经在分子水平上阐明。,（三）基因异常的间接诊断,许多疾病的致病基因从结构到产物及突变情况等尚未在分子水平上阐明，可以采用间接诊断，即分析与该致病基因关联的遗传标志（geneticmarker），也称为基因连锁分析。基因连锁（genelinkage）：是指在细胞分裂时，位于同一条染色体上的基因遗传给同一个子代细胞的现象,如果确定某遗传病的致病基因与某一特异性DNA片段紧密连锁，就可以用该片段作为该遗传病的遗传标志，判断家族成员或胎儿是否为患者或致病基因的携带者。eg：将非洲人基因组DNA用限制酶Hpa切割，与珠蛋白基因探针杂交，可以检出7.6kb和13kb两种相关限制性片段，其中13kb片段在健康人群检出率只有3%，在镰状细胞贫血患者检出率却高达87%，提示13kb片段可以作为间接诊断非洲人镰状细胞贫血的遗传标志。,基因诊断的常用技术方法,核酸分子杂交技术、PCR技术、基因芯片技术、DNA测序。,（1）核酸分子杂交,利用具有一定互补序列的两种核酸单链（探针和目标）在液相或固相体系中可缔合成异质双链的原理，用以分析被测样品中特定目标序列的方法。具体方法有印迹杂交(包括Southern和Northern印迹杂交)、斑点杂交(Dotblot)和原位杂交(Insitublot)等。,A.Southern印迹杂交,检测DNA,B.Northern印迹杂交,检测RNA操作过程类似Southern印记杂交，主要区别是在变性剂存在下，以琼脂糖凝胶电泳分离RNA。,C.等位基因特异寡核苷酸探针（ASO）斑点印迹杂交分析法,主要适用于检测已知点突变,受检者基因组DNA或含突变位点的PCR扩增产物与标记的ASO探针杂交,ASO1,ASO2,Normal,Hetero,Homo,镰状细胞贫血：b-珠蛋白基因点突变GAG(Glu)-GTG(Val)bAprobeACTCCTGAGGAGAAGTCTGCCbSprobeACTCCTGTGGAGAAGTCTGCC,Hetero,bAprobe,bSprobe,Homo,Normal,D.原位杂交insituhybridization,用核酸分子探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交并对其进行检测的方法。分类：DNA-DNARNA-DNARNA-RNA,（2）聚合酶链反应技术（PCR）,在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸（dNTP）存在的条件下，由耐热DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）在体外反复酶促合成双链DNA的反应称为聚合酶链式反应。反应分为三步：DNA模板变性单链DNA模板与引物退火引物延伸(denaturing)(annealling)(extension),为适应DNA诊断的需要，除上述常规PCR外，又逐步发展了不同目的特殊类型的PCR技术：逆转录PCR（reversetranscriptionPCR，RT-PCR）反向PCR（inversePCR）嵌套式PCR（nestingPCR）多重PCR（multiplexPCR）多重等位基因PCR（multiplexallelePCR）不对称PCR（asymmertricPCR）锚定PCR（anchoredPCR）原位PCR（insituPCR）定量PCR（quantitativePCR）长片段PCR（longfragmentPCR）,（3）PCR/单链构象多态性分析（SSCP）,PCR产物变性后，经非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，正常基因和变异基因的迁移位置不同，可分析确定致病基因的存在。,PCR-SSCP分析法适用于致病基因内尚未明确的点突变，可将检测范围缩小至某一外显子或某一片段，再对外显子或片段进行测序即可确定突变位点。,（4）限制性片段长度多态性分析(restrictionfragmentlengthpolymorphism,RLFP),在人类基因组中，平均约200对碱基可发生一对突变（称为中性突变），中性突变导致个体间核苷酸序列的差异，称为DNA多态性。不少DNA多态性发生在限制性内切酶识别切割位点上，酶解该DNA片段就会产生长度不同的片段，称为RFLP。,镰状细胞贫血：b-珠蛋白基因第六密码子GAG(Glu)GTG(Val)MstIICCTNAGGbACCTGAGGAG1.15kb0.2bSCCTGTGGAG1.35kb,1.15kb,1.35kb,A.导致某一限制性位点丧失或获得的点突变,bA/bS,bA,bS,b-地中海贫血：b-珠蛋白基因3末端缺失0.6kb|BgIIIBgIII5.2kb|BgIIIBgIII4.6kb,Homo,Hetero,Normal,5.2kb,4.6kb,B.导致某一限制性位点移位的大片段缺失或插入,C.基因缺失,a-地中海贫血：不同数量(1-4个)a-珠蛋白基因缺失aa14kbBamHIBamHIaa/aaaa/-aa/a-a-/-/-10kba,D.重复序列,等位基因组合,1/1,1/2,1/3,1/4,2/2,2/3,2/4,3/3,3/4,4/4,（5）DNA序列测定,DNA序列测定是诊断基因突变最直接可靠的方法。PCR技术的应用，使从过去的克隆后测序进入扩增产物直接测序的新阶段（PCR-Sequencingmethod）。新近发展的DNA自动测序仪采用4种