畜牧学-兽医学畜牧学-兽医学畜牧学-兽医学畜牧学-兽医学畜牧学-兽医学畜牧学-兽医学畜牧学-兽医学畜牧学-兽

第三章遗传的物质基础,第一节遗传物质的本质,一、DNA是遗传物质（一）DNA是遗传物质的证明1928年Griffith等进行的肺炎球菌转化（transformation）实验.1944年Avery证明DNA是遗传物质.,（二）DNA携带两类不同的遗传信息1.负责基因结构的信息2.负责基因选择性表达的信息,二、RNA也可作为遗传物质（一）RNA病毒病毒颗粒（viron）：由病毒RNA基因组和包被在外的蛋白质外壳组成.病毒的生存方式：病毒编码包装基因组所需的蛋白，以及一些在感染循环中复制病毒所需的蛋白质。其他蛋白质由宿主提供。因此病毒不能独立生存。,（二）类病毒（viroid）类病毒:是使高等植物产生疾病的有传染性的因子，由很小的环状RNA分子构成。与病毒不同，类病毒的RNA本身就是感染因子。类病毒只由RNA组成，其中广泛存在不完全的碱基配对，形成一种特有的棒状结构。类病毒的基因组不能编码蛋白质。,类病毒的复制：必须由宿主的酶来完成，其RNA作为模板。类病毒对宿主的影响：类病毒可通过复制占有宿主细胞中关键的酶，从而影响宿主细胞的正常功能；类病毒也能影响必需的RNA的产生而引发疾病；它们还可以作为一个不正常的调控分子，对个别基因的表达产生特殊的影响。,三、是否存在核酸之外的遗传物质？（一）朊病毒（prion）：是一个28KDa的疏水性糖蛋白，由细胞的核基因编码，在正常动物的脑组织中有表达。（二）朊病毒的存在形式：朊病毒以感染性形式（PrPSC)，和非感染性形式（PrPC）两种形式存在。,（三）两种形式的朊病毒的异同：PrPCPrPSC功能：不详导致退行性神经疾病分布：正常脑被感染脑抗蛋白酶性：可被完全降解只能被部分降解溶解性：可溶难溶一级结构：两者相同二级结构：40%-螺旋20%-螺旋，50%-折叠,（四）朊病毒的感染方式PrPSC作用需要PrPC的参与PrPSC蛋白的错误折叠形式可以催化天然PrPC分子从正常的可溶性的螺旋构象向不溶性的-折叠构象转化，最终导致了疾病和感染。,（五）朊病毒的多株现象不同PrPSC株可使一种PrP结构转化为不同的构型；而同一种PrPSC可以在具有不同PrP蛋白的多种生物中传代，即使经过多次传代仍然保持自身的生物学特征。（六）朊病毒是遗传物质吗？多株现象难以解释其感染方式能否被视为遗传复制？,第二节DNA的一级结构,一、DNA一级结构的组成一级结构：4种脱氧核苷酸的连接及其排列顺序。(一）含氮碱基（nitrogenousbases）,胞嘧啶（cytosine,C）、胸腺嘧啶（thymine,T）、腺嘌呤（adenine,A）、鸟嘌呤（guanine,G）,DNA中的常见碱基有：胞嘧啶（cytosine,C）、胸腺嘧啶（thymine,T）、腺嘌呤（adenine,A）和鸟嘌呤（guanine,G）,(二）戊糖：核糖和脱氧核糖,（三）脱氧核糖核苷（nucleoside）由碱基和戊糖（D-脱氧核糖）缩合而成。有4种脱氧核糖核苷：胞嘧啶脱氧核糖核苷、胸腺嘧啶脱氧核糖核苷、腺嘌呤脱氧核糖核苷和鸟嘌呤脱氧核糖核苷。,+,+,H2O,H,（四）脱氧核糖核苷酸脱氧核糖核苷和磷酸缩合形成的磷酸酯,（五）脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid,DNA）脱氧核糖核苷酸以3，5磷酸二酯键聚合成为脱氧核糖核酸（DNA）链。链的一端的核苷酸有自由的5磷酸基团，称5端；另一端核苷酸具有自由的3羟基，称3端。,一个脱氧核苷酸的3端与下一个的5端通过磷酸二酯键连接。,DNA链的方向就是从5端到3端。DNA分子通常以线性或环状的形式存在。大多数DNA由两条互补的单链构成。少数生物的DNA，如某些噬菌体或病毒是以单链形式存在的。,二、序列测定方法（一）小片段重叠法（二）凝胶直读法1.酶法（1）加减法（Sanger,1975）（2）末端终止法(双脱氧法/间接拷贝法)（Sanger,1977）2.化学法（Maxam/Gilbert,1977）适用于DNA短片段的测定,末端终止法的应用循环测序（cyclesequecing)实验及原理a.测序反应的设定体系中包括：DNA模板，TaqDNA聚合酶，寡核苷酸引物，4种dNTP和荧光ddNTP（4种荧光）等b.反应包括：DNA变性，引物与模板配对，DNA聚合酶使引物延伸（在引物3末端接上dNTP或ddNTP）；c.反应的终止20-30个循环后，新合成所有可能的DNA片段，每个片段的3末端都被接上ddNTP，延伸终止；d.反应产物电泳分离及检测在聚丙烯凝胶中，不同大小的DNA片段在高压电场作用下迁移，小分子迁移速度快，先被位于凝胶底部的装置检测到。e.结果的处理及输出根据被检测到的DNA片段的顺序及颜色，绘出DNA片段的电泳图谱。DNA序列中的每个核苷酸由一系列按顺序排列的彩色峰型显示出来,双脱氧核苷三磷酸,ddATP,ddGTP,ddTTP,ddCTP,GTATGCTAGCAT,三、一级结构的重要性携带遗传信息决定DNA的二级结构决定DNA的空间结构,第三节DNA的二级结构,一、DNA螺旋的几种构象及其动态平衡（一）WatsonCrick右手双螺旋结构（B-DNA构象）相对湿度为92%时，DNA钠盐纤维为B-DNA构象。在天然情况下，绝大多数DNA以B构象存在。,a.反平行双链右手螺旋b.糖Pi在螺旋线上c.碱基伸向内部其平面垂直于轴d.A=T、G=Ce.直径=2nm，一圈上升10对核苷酸，螺距为3.4nmf.大沟（majorgroove）、小沟（minorgroove）,WatsonCrick双螺旋结构模型特点：,（二）A-DNA构象为相对湿度改变（75%以下）或由钠盐变为钾盐、铯盐，DNA的结构可成为A构象。它是B-DNA螺旋拧得更紧的状态。DNA-RNA杂交分子、RNA-RNA双链分子均采取A构象。,（三）Z-DNA构象在一定的条件下（如高盐浓度），DNA可能出现Z构象。Z-DNA是左手双螺旋，磷酸核糖骨架呈Z字性走向。不存在大沟，小沟窄而深，并具有更多的负电荷密度。,A-型B-型Z-型,A-DNA、B-DNA和Z-DNA的一些结构特征,B-DNA是活性最高的DNA构象，B-DNA变成A-DNA后，仍有活性，但若局部变构为Z-DNA后，活性明显降低。,二、决定双螺旋结构状态的因素（一）氢键1.碱基的氢供体氨基、羟基2.碱基的氢受体酮基、亚氨基3.G-C对及A-T对之间的氢键:（在一定范围内DNA的稳定性与G-C百分含量成正比）,（二）碱基堆积力1，碱基堆积力同一条链中的相邻碱基之间的非特异性作用力2，碱基堆积力的来源疏水作用力累积的VanderWaal的作用力3，碱基堆积作用的证据单链多核苷酸倾向于碱基平行排列的规则螺线结构破坏疏水作用和双链的氢键可降低DNA的稳定性,Pu的双环结构，其长度接近或超过螺旋轴心每对Bp又以propellertwist形式存在,（三）带电荷的磷酸基的静电斥力磷酸集团的负电对DNA双链的稳定性起负作用。阳离子可对之产生屏蔽。DNA溶液的离子浓度越低，DNA越不稳定。（四）碱基分子内能碱基内能越高，氢键和碱基堆积力越容易被破坏，DNA双链越不稳定,第四节DNA的三级结构,形成超螺旋的原因和条件：原因：因某种原因引入了额外的螺旋。条件：a,DNA双螺旋闭合或被蛋白结合，末端不能自由转动；b,DNA双链上无断裂。,一、超螺旋结构DNA的三级结构是指DNA双螺旋的进一步扭曲盘绕所形成的构象，主要表现为超螺旋结构。,松弛态（relaxedstate）:DNA中心轴与平面平行即不扭曲的状态。,超螺旋：双螺旋结构的DNA再次扭曲形成的螺旋结构。a.右旋超螺旋负超螺旋（Negativesupercoil）b.左旋超螺旋正超螺旋（positivesupercoil）,环状DNA分子的拓扑学性质L=T+WW=L-TL：连环数（Linkingnumber）指一个封闭环状DNA双螺旋分子中的两条链彼此盘绕的次数；T：双螺旋中转数（Twistingnumber，也叫螺圈数）是双螺旋本身所有的性质。其数量等于碱基对总数除以每一圈的碱基对数（如：520010.4=500）；W：超螺旋数（Writhingnumber）。DNA的拓扑异构体：松弛型：W=0，L=T；负超螺旋：LT,例：动物病毒SV40的DNA（环状，含5200bp），在无超螺旋时，L=500，T=500，W=0；但实际上从细胞中分离出的SV40DNA含有25个负超螺旋，所以它的L=475，因此，L对一个DNA分子来讲是一个拓扑学特性，在不发生链的断裂时它是一个常数。（475=500-25）,L=T+WW=L-T,比连环差（Specificlinkingdifference)（以表示）用来表示超螺旋的程度；当初级螺旋数不变时，代表超螺旋密度。公式：=（L-L0）/L0（L0：表示松弛环型DNA的连环数）如一超螺旋DNA的L=23，L0=25，则=-0.08，大多数天然存在的DNA分子超螺旋密度在-0.03-0.09之间。,超螺旋结构存在的意义密度大，体积小，在细胞中所占体积较为经济；超螺旋结构能影响双螺旋的解链程度，因而影响DNA分子与其它分子，如酶、蛋白质等分子的相互作用，参与DNA复制、重组、转录等重要功能。DNA的拓扑异构体可用凝胶电泳分开。,影响DNA高级结构的酶L值的改变需要至少一条DNA链断裂一次。断裂造成的DNA自由末段的一断可绕着另一端旋转，随后被重新连接，DNA拓扑异构酶通过催化此类反应将DNA从一种拓扑结构转变成另一种。,l拓扑异构酶(topoisomeraseI,II)参与构型的改变,TopI对负超螺旋处的单链DNA具有极强的亲合力,TopII,1.I型DNA拓扑异构酶底物：DNA单链ATP：不需酶活性：DNA内切酶和连接酶活性代表：E.Coli的DNA拓扑异构酶I：可催化负超螺旋DNA转化为松弛环型。鼠DNA拓扑异构酶I：对正、负超螺旋有相同的松弛能力。,原理：E.coli拓扑异构酶识别部分解螺旋的DNA分子，与DNA单链部分结合后，切断一条链，并以其酪氨酸残基与DNA的5磷酸相连。磷酸二酯键从DNA转移蛋白质上。酶将完整的DNA链拉过缺口后（L=+1），重新连接原先单链上磷酸二酯键。,上述过程除了改变DNA的超螺旋结构外，还可使单链环状分子形成三叶结构，以及使两个单链环状分子成为环连体分子。,2.II型DNA拓扑异构酶底物DNA双链ATP需要酶活性DNA内切酶和连接酶活性代表E.Coli旋转酶（DNA拓扑异构酶II），可引入负超螺旋。无ATP时，此酶只能缓慢地松弛负超螺旋。,E.Coli的旋转酶还具有形成和拆开双链DNA环连体和成结分子的能力。此类酶无碱基序列特异性。,3.DNA拓扑异构酶催化反应的实质：其本质是先切断DNA的磷酸二酯键，改变DNA的链环数后再连接，兼具DNA内切酶和DNA连接酶的功能。然而这些酶并不能连接事先已经存在的断裂DNA，即其断裂及连接反应是相互偶联的。,二、生物体内的超螺旋,1.环状DNA的超螺旋生物体如某些小病毒、细菌质粒、真核线粒体、叶绿体、噬菌体PM2、以及某些细菌的DNA为双链环状，在细胞内进一步扭曲形成超螺旋的三级结构。,2.染色体DNA的三级结构为DNA双螺旋盘绕在组蛋白上的超螺旋结构。,H1,H2A、H2B、H3、H4各2分子组成聚合体,H1结合在核小体间的DNA上,三、三股螺旋DNA(TribleHelixDNA,T.SDNA),T.SDNA的发现与证实,l1953年以前Pauling(Chemist)提出T.SDNA存在的可能性,l1953年Watson&CrickD.SDNAmodel证明沿大沟存在多余的氢键给体与受体,潜在的专一与DNA(蛋白质)结合的能力,形成T.SDNA可能性,l1957年Davis,Felsenfeld,Rich发现,T.SDNA的概念,l1966年Miller&Sobell,实现RNA+D.SDNA,TriblepolyNt,asRepressor关闭基因,但由于D.SDNA的提出而被忽视,但因证明LacI产物为Repressor而被忽视,1975年Perlgut人工合成T.SDNA并证明其Tm值,沉降系数(S),l1987年Mirkin.S.MNature330(495)证明plasmidDNA在pH=4.3的溶液中,有T.SDNA的存在,1987年Dervan.MoserScience238(645)合成S.SDNA+D.SDNAT.SDNA,实现DNA的定点切割研究X-rayphotograph核磁共振结构功能,继Davis（1957）后30年第一次证明T.SDNA在生物体内的存在,T.S.DNA的类型,1.D.S.DNA+D.S.DNA,T.S.DNA+S.S.DNA,HomologouspalindromicsequenceinaD.S.DNANoduleDNAorHingedDNA,l2.S.S.DNA+D.S.DNAT.S.DNAPU+PU/PY(偏碱性介质中稳定)PY+PU/PY(偏酸性介质中稳定)常见类型,第三条链位于B-DNA的Majorgroove中与D.S.DNA一起旋转,T.S.DNA的连接键,WatsonbondingATGC(D.S.DNA),H+,HoogsteenbondingGC+(pH小于7)第三链质子化第二链的pu6,7与第三链的碱基形成H键,三股螺旋DNA形成的条件及结构特点,第三条单链DNA分子位于B-DNA大沟内,与B-DNA以Hoogsteen键连接,T.S.DNA可能的功能,a)T.S.DNA可阻止调节蛋白与DNA结合,关闭基因转录过程,b)T.S.DNA与基因重组,交换有关,加入第三条S.S.DNA作为分子剪刀(molecularscissors),定点切割DNA分子,d)加入反义的第三条链(anti-sencepolydNt)终止基因的表达,四、四股螺旋DNA(tetraplexDNA,TetrableHelixDNA),发现,均有形成四股螺旋DNA的可能,结构特点,LinkedbyHoogsteenBonding,2poly(T4G4)2poly(G4C4),结构特点,GGGGTTTGGGGTTTGGGGTTT,真核生物染色体端粒DNA结构,可能的功能,A稳定真核生物染色体结构,B保证DNA末端准确复制,C与DNA分子的组装有关,D与染色体的meiosis&mitosis有关,第五节DNA的变性、复性、杂交和Cot曲线,一、DNA的变性DNA变性（熔解）：DNA被加热或某些试剂的作用下，配对碱基之间氢键和相邻碱基之间的堆积力受到破坏，逐步变为近似于无规则的线团构像的过程。（一）单、双链DNA的紫外光吸收双链DNA：A260=1.0时，50g/ml单链DNA：A260=1.0时，33g/ml（单链RNA：A260=1.0时，40g/ml）,D.S.DNA,S.S.DNA,(加温,极端pH,尿素,酰胺),（二）DNA的熔解曲线Tm值：缓慢而均匀地升高DNA溶液的温度，当A260增加到最大增值的一半时的温度，叫做DNA的熔解温度（Meltingtemperature）或熔点，用Tm表示。（一般在70-85）DNA变性不仅受外部各种因素的影响，而且取决于DNA分子本身的稳定性，即Tm值直接与DNA的性质相关。,1.185,=OD增加值的中点温度(一般为85-95),不同DNA的Tm值对G-C含量作图能得到一条直线，因此测定Tm值可以推算出DNA碱基分子组成。,（三）影响Tm值的因素,在A,T,C,G随机分布的情况下,GC%含量相同的情况下,GC%愈高Tm值愈大,GC%愈低Tm值愈小,AT形成变性核心，变性加快，Tm值小,碱基排列对Tm值具有明显影响（除变性核心外）（碱基堆积力的差异）,大片段D.S.DNA分子之间比较,片段长短对Tm值的影响较小,与组成和排列相关,小于100bp的D.SDNA分子比较,片段愈短，变性愈快，Tm值愈小,变性液中含有尿素，酰胺等,盐浓度的影响,单链DNA主链的磷酸基团,负电荷的静电斥力,两条单链DNA的分离,Na+在磷酸基团周围形成的电子云对静电斥力产生屏蔽作用,减弱静电斥力,Tm,Tm,二、复性DNA复性：变性DNA在一定条件下恢复天然DNA结构的过程。（一）复性的条件1，消除磷酸基的静电斥力；2，破坏连内氢键（二）复性的机制1，随机碰撞取决于DNA浓度、溶液温度、离子强度等2，成核作用（nucleation)3，拉拉链作用（zippering）,3-ATCTATGCTGTCAT-5,5-TAGATACGACAGTA-3,5-TAGATACGACAGTA-3,3-ATCTATGCTGTCAT-5,3-ATATATATATAT-5,5-TATATATATATA-3,3-ATATATATATAT-5,5-TATATATATATA-3,5-TATATATATATA-3,3-ATATATATATAT-5,3-ATATATATATAT-5,5-TATATATATATA-3,影响DNA复性过程的因素：,影响DNA复性过程的因素：,DNA分子中,dNt的排列状况(随机排列,重复排列),S.S,DNA的初始浓度C0,三、Cot曲线在一定条件，复性速度变化可用Cot值衡量。Co表示变性DNA的最初浓度（bp，mol/L），T为复性时间（s），即Cot值为变性DNA的最初浓度与复性时间的乘积（mols/L）。病毒和原核生物基因组的Cot曲线是单一的s形曲线，真核生物基因组的Cot曲线是多s形Cot曲线，重复频率高的序列复性速度快，重复频率低的则慢。,不同物种核酸的Cot曲线,原核生物DNA的复性动力学,原核生物Cot曲线形状：不同生物曲线形状相似，都是单一的S形；原核生物Cot曲线：跨度一般只有两个数量级；原核生物Cot曲线位置：基因组越大越靠右。,Cot（mols/L）,真核生物Cot曲线特点：阶梯状，跨度7-8个数量级。真核生物Cot曲线的组成：快复性组分/中间复性组分/慢复性组分。,真核生物DNA复性动力学,E.ColiDNA,Ct/C0,C0t,0.03,6,3000,40%,60%,CalfthymusDNA,1,0,四、杂交重要的杂交技术：SouthernBlottingNorthernBlotting,一、RNA的结构特征RNA的碱基组成与一级结构（1）碱基组成：A、G、C、U（2）一级结构：基本组成单位核苷酸（AMP、GMP、CMP、UMP）核苷酸间的连接键35磷酸二酯键存在状态单链、只有少数为双链（暗色蛾CPVRNA5150bp）,第六节RNA的结构,双螺旋、内部环、单碱基、突起和突环、发夹环、多分支环或结合环、假结、单链区,二、RNA二级结构元件：,三、mRNA结构1.原核生物mRNA为多顺反子mRNA（polycistron），即一条mRNA可编码几条肽链。无帽子结构和尾巴，不含稀有碱基，半寿期为13min，二级结构有丰富的自身回折产生的双链区.,2.真核生物mRNA为单顺反子mRNA（monocistron），即一条mRNA只编码一条肽链。5有帽子结构，3有尾巴，含少量稀有碱基，半寿期可达1小时。,四、rRNA的结构rRNA形成大量的双螺旋、突环、结合环等,E.coli5SrRNA二级结构,E.coli16SrRNA二级结构,1.一级结构（1）分子量25000左右；7399个核苷酸，大多数是76个核苷酸。（2