DNA疫苗ppt课件VIP

.,GenicGuard基因疫苗,.,疫苗的发展,.,”基因疫苗的发展,1992年，Tang等将表达人生长激素的基因质粒DNA，导入小鼠的表皮细胞小鼠血中：检测到特异性抗生长激素抗体再次注入加强剂量质粒：免疫反应增强。,Wolff等：小鼠基因治疗试验(1990)对照动物将带有报告基因的质粒DNA直接肌肉注射入意外发现：肌细胞内：检测到该外源基因的表达产物,.,Ulmer等（1993）将重组甲型流感病毒核蛋白(nucleoprotein，NP)的cDNA片断插入含有巨细胞病毒(CMV)启动子的质粒中将该质粒直接注射入小鼠的四头肌内结果：小鼠产生了特异的细胞毒T淋巴细胞(CTL)应答和高滴度的抗体。,1994年在日内瓦召开的专题会议上将这种疫苗定名为基因疫苗。,.,概念,基因疫苗(geneticvaccine)是指一类将抗原基因重组到表达载体上的重组质粒疫苗，经肌肉注射或黏膜免疫等方法导入宿主体内，通过宿主细胞表达抗原蛋白，诱导宿主细胞产生对该抗原蛋白的免疫应答，以达到预防和治疗疾病的目的。,新型疫苗（1990-）第三次疫苗革命”美国纽约科学院：疫苗学的新纪元(1995）又称为：DNA疫苗(DNAvaccine)基因免疫(geneticimmunization)核酸免疫(nucleicacidimmunization),.,基因工程疫苗,基因疫苗,.,“基因工程疫苗”与“基因疫苗”,基因疫苗即将编码外源性抗原的基因插入到含真核表达系统的质粒上，然后将质粒直接导入人或动物体内，让其在宿主细胞中表达抗原蛋白，诱导机体产生免疫应答。抗原基因在一定时限内的持续表达，不断刺激机体免疫系统，使之达到防病的目的。,基因工程疫苗也称遗传工程疫苗使用DNA重组生物技术，把天然的或人工合成的遗传物质定向插入细菌、酵母菌或哺乳动物细胞中，使之充分表达，利用表达的抗原产物，或重组体本身制成的疫苗。主要包括基因工程亚单位疫苗，基因工程载体疫苗，核酸疫苗，基因缺失活疫苗，及蛋白工程疫苗等五种。,.,基因免疫的原理,质粒DNA导入细胞后，抗原编码基因表达抗原蛋白，随后被降解为812个氨基酸短肽。,短肽上含有抗原表位，分别与MHC-1类和MHC-2类分子结合并被呈递到细胞表面,与MHC-类分子结合的短肽激活CD8+T细胞(Tc),与MHC-类结合的短肽激活CD4+T细胞（Th）。,分泌到细胞外的抗原被带有相应抗体的B细胞捕捉，在T辅助细胞分泌淋巴因子的刺激下转化为浆细胞，大量分泌抗体。,.,基因免疫的原理,.,DNA疫苗的构建,目的基因的选择：侧重于免疫原性，即所表达的目的蛋白刺激机体免疫应答的能力。目的蛋白中是否具有受MHC分子限制的T细胞抗原表位，是保证核酸免疫有效的先决条件。核酸疫苗所选择的目的基因应尽量避免有害基因成分，特别是病毒或肿瘤的核酸免疫。,.,载体的选择：构建DNA疫苗的质粒通常是非复制型的真核表达质粒，能高水平地表达目的基因。,重组质粒可分为两个部分：转录部分：由启动子、插入的目的抗原cDNA和polyA终止子组成，指导目的蛋白在体内表达，诱发特异性免疫应答。佐剂部分：CpG基序。,.,启动子的选择：质粒在宿主细胞内表达外源性蛋白的水平与调控DNA表达的启动子关系密切。表达水平的不同又直接影响免疫应答的强度和持续性。,.,DNA疫苗的优化联合构建：在载体质粒中插入2个或2个以上目的抗原基因，既能激活CD8T细胞产生特异性CTL，又能激活CD4Th2细胞产生体液免疫。协同构建：将目的基因与某种细胞因子的基因构建成嵌合基因，以促进目的基因的免疫效果。,.,免疫途径、剂量、时间：常见免疫途径有：注射方式（皮内、皮下、肌内等），也可以用基因枪注射接种非注射方式：口服、鼻内滴注、鼻腔喷雾接种等,.,DNA注射剂量以实验动物种类而异。对小鼠而言，最适宜的注射剂量为50100ug，对小牛注射则需500ugDNA，太少基因表达很低，太高则不呈剂量相关。,年龄越小，DNA疫苗产生的效果越好,.,DNA疫苗的特点,（1）既能诱导细胞免疫反应，也能刺激产生体液免疫反应,原因：表达产物一部分在降解后与MHC-I类分子结合一部分也可分泌出去，经抗原递呈细胞(APC)等途径与MHC-II类分子结合,.,（2）安全可靠可根据需要设计、选择DNA疫苗的抗原基因，靶向性明确;质粒载体上的CpG基序具有强烈的佐剂作用，故DNA疫苗接种时一般不需外加佐剂。,.,（3）价格低廉质粒经转化细菌扩增后，其提取、纯化等制备过程远比蛋白质纯化技术简单得多，省钱、省时和省力，适宜于规模性生产；DNA疫苗在常温下性能稳定，可以室温保存，不需要冷链运输，容易保证高效接种率。,.,（4）多途径免疫接种，易为免疫对象所接受，也有利于模拟自然感染途径。注射方式（皮内、皮下、肌内等），也可以用基因枪注射接种非注射方式：口服、鼻内滴注、鼻腔喷雾接种等,.,基因枪,利用高压气体加速，将包裹了DNA的球状金粉或者钨粉颗粒直接送入完整的植物组织或者细胞中这一加速设备称为基因枪,.,DNA疫苗的应用,牛病毒性腹泻病毒（BVDV)以表达BVDV1型主要糖蛋白E2的质粒DNA肌肉注射小牛，可产生病毒中和抗体和抗原特异的细胞增殖反应；免疫后16周进行攻毒试验，发现免疫牛能产生针对BVDV1型和2型的血清中和抗体强烈的记忆抗体反应，对牛有部分免疫保护作用,.,鸡传染性喉气管炎病毒（ILT)将分别构建的含有鸡传染性喉气管炎病毒王岗株gB、gC和gD基因的重组真核表达质粒及空载体质粒分组注射雏鸡，攻毒后观察免疫保护效果。结果表明，重组质粒诱导了免疫应答，免疫保护率达到79%，该基因疫苗可以作为预防ILV的1个补充。,.,DNA疫苗的优点：,DNA接种载体（如质粒）的结构简单，提纯质粒DNA的工艺简便，因而生产成本较低，且适于大批量生产；,DNA分子克隆比较容易，使得DNA疫苗能根据需要随时进行更新；,DNA分子很稳定，可制成DNA疫苗冻干苗，使用时在盐溶液中可恢复原有活性，因而便于运输和保存；,.,质粒本身可作为佐剂，因此使用DNA疫苗不用加佐剂，既降低成本又方便使用.,比传统疫苗安全，虽然DNA疫苗具有与弱毒疫苗相当的免疫原性，能激活细胞毒性T淋巴细胞而诱导细胞免疫，但由于DNA序列编码的仅是单一的一段病毒基因，基本没有毒性逆转的可能，因此不存在减毒疫苗毒力回升的危险.,将多种质粒DNA简单混合，组成多价疫苗，使DNA疫苗生产的灵活性大大增加。,.,DNA疫苗发展中存在的问题,目前，DNA疫苗尚未得到广泛的应用，除了因为它是一种新事物，不大为人所了解之外，它本身的安全问题则是人们对它的最大顾虑。DNA疫苗存在的问题如下：,外源DNA进入机体后是否整合到宿主基因组，导致癌基因激活或抑癌基因失活。,DNA疫苗长期在体内表达是否会诱导机体产生免疫耐受，长远来说，导致机体免疫功能低下。,DNA疫苗作为一种外来物质，是否会引起机体产生抗DNA抗体。,DNA疫苗诱导的CTL反应是否会对其他细胞产生杀伤作用。,.,DNA疫苗的发展前景,近年来，许多畜禽病毒性传染病，已不能