DB21∕T 2589-2016 东部白松种源相关序列多态性（SRAP）分子鉴定实验方法

64 宁 省 地 方 标 准 25892016 东部白松种源相关序列多态性（分子鉴定实验方法 of 016 - 03 - 18发布 2016 - 05 - 18实施辽宁省质量技术监督局 发 布 25892016 I 目 次 前言 . 适用范围 . 1 2 规范性引用文件 . 1 3 术语和定义 . 1 4 原理 . 1 5 仪器和设备 . 1 6 引物 . 2 7 试剂与溶液 . 2 8 实验程序 . 2 9 分析和鉴定 . 5 附录 A（规范性附录）. 6 附录 B（规范性附录）. 7 附录 C（规范性附录）. 9 附录 D（规范性附录）. 10 附录 E（资料性附录）. 11 参考文献 . 12 25892016 言 本标准依据 本标准的附录A、附录B、附录录本标准由辽宁省林业厅提出并归口。 本标准起草单位：辽宁省林业科学研究院。 本标准主要起草人：陈 罡，冯 健，王骞春，魏忠平，叶景丰，马冬菁，白丽萍，刘 平，刘怡菲，孟凡金，田永霞，张素清，陈阿梅，谭桂清，王 丹，房春果，杨长明，李国军，丁 彪，李玉铎，佟 帅，王显军，侯燕倢，高英旭。 本标准首次发布。 25892016 1 东部白松种源相关序列多态性（子鉴定实验方法 1 适用范围 本标准规定了东部白松种源分子鉴定的实验方法。 本标准适用于利用相关序列多态性（对东部白松种源鉴定的实验过程。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 1 部分：标准的结构和编写 3 术语和定义 以下术语和定义适用于本标准。 关序列多态性 用一对引物对开放阅读框（行扩增，因个体不同以及物种的内含子、启动子与间隔序列长度不等而产生多态性。 合酶链式反应 耐热体外快速大量特异扩增待定物扩增多态性 对引物在两个或两个以上不同材料基因组到数目不同或长度不同的4 原理 通过一对 向引物（有 17个碱基，对外显子进行特异扩增；反向引物（有 18 个碱基，对内含子区域、启动子区域进行扩增。因个体不同以及物种的内含子、启动子与间隔区长度不同而产生多态性。最终通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳将这些特异的多态性片段分离开来，通过比较待测种源和对照品种源纹谱带数据的差异，来判断待测种源与对照种源是否为相同种源。 5 仪器和设备 增仪。 25892016 2 脂糖凝胶电泳系统。 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳系统。 胶成像系统和照相系统。 纯水系统。 温高速冷冻离心机。 微量紫外/可见分光光度计。 压灭菌锅。 氮罐。 低温冰箱。 压电泳仪及配套电泳槽。 液器（枪）。 6 引物 引物相关信息见附录A。 7 试剂与溶液 要常规试剂见附录B。 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂见附录C。 染试剂见附录 D。 8 实验程序 验材料 选用东部白松新鲜针叶为材料提取基因组取适量样品，装入冻存管，液氮速冻，置于超低温冰箱中， 保存备用。 取 0.5 灭菌剪刀剪成小段置1.5 至 加适量乙烯吡咯烷酮）和 坏血酸），向离心管中加入液氮后用塑料研磨杵将针叶研磨成粉末。 入 1 0 预冷的 取液，混匀，0 冰浴 10 间轻轻颠倒 2，在4 下 10000 r/0 上清液。若上清液黏稠，用 入 650 L 65 预热的4无菌枪头小心将其混匀，65 水浴 30 入等体积的氯仿:异戊醇(V:V)=24:1 的抽提液，轻轻颠倒离心管 10 其混匀，10000 r/ 25892016 3 离心 10 后用去尖的移液器吸头小心吸取450 L 上清液至另一离心管中。重复步骤 白色中间层消失为止。 入2 倍体积的冰冷（0 以下）无水乙醇，颠倒混匀，出现絮状沉淀，放置 2 h。10000 r/心 10 上清液。 0%乙醇清洗2遍，风干后加入100 L 灭菌 冲液配制l g/g/ g/g/ 10 g/子量标准，各取3 L L 脂糖凝胶上电泳，稳压90 V，电泳缓冲液为125 相，通过与标准溶液的荧光进行比较估测未知1.5 入石英比色杯中，用紫外分光光度计检测，记下其在260 按公式（1）计算出D= n50/1000 （1） 式中： D 位为纳克每微升（g/L）； 260 n 稀释倍数。 冰盘中或 4 条件下进行操作，在 25 有10 ， 2.0 ，.2 ，正向、反向引物各 ，模板0 L。 4 预变性 5 5 个循环为：94 变性 1 7 退火 1 2 延伸 1 35 个循环为：94 变性 1 0 复性 1 2 延伸 1 72 延伸8 条件下保存。 束后，于 25 倒摇晃混匀后，备用。 丙烯酰胺凝胶的制备 璃板的清洗 用洗涤剂清洗玻璃板（长板和短板），自来水冲洗干净，随后将玻璃板用蒸馏水冲洗2 次，再用无屑纸巾沾取无水乙醇擦拭 2 遍，置于通风橱内垂直晾干待用。 25892016 4 胶槽装配 璃板的固定 将长板玻璃板平铺于通风橱内，边条擦拭后置于玻璃板两侧，随后用短板玻璃板整齐地压盖住，确认边条与两玻璃板均对齐后，将其放入封胶框中并用夹子固定在制胶板上。 胶 配制 1%的琼脂糖凝胶，彻底煮沸后用胶头滴管吸取，沿底边从左至右缓缓灌注入封胶框中，避免出现气泡，待琼脂糖凝胶完全漫过玻璃板底部，停止灌注，待其室温凝固后进行下一步操作。 烯酰胺胶的配制 在 50 % 非变性聚丙烯酰胺储备液中加入 100 L 10%过硫酸铵和 200 L 四甲基乙二胺（迅速轻轻混匀。 胶 将固定有封好玻璃板的制胶板向后倾斜放置，配好的 8%非变性聚丙烯酰胺工作液沿玻璃板壁缓慢匀速倒入灌胶口中，避免出现气泡，待胶刚要溢出灌胶口时停止灌胶，将梳子轻轻插入灌胶口中，室温凝固 1 h 以上。 样和电泳 待凝胶完全凝固后，将装有凝胶的玻璃板轻轻从制胶板上取下，灌胶口向内用夹子固定在电泳槽上，使用 1冲溶液灌注电泳仪的上下两槽，使下槽溶液漫过封胶框，上槽溶液漫过灌胶孔。垂直缓慢将梳子从灌胶口中拔出，并用 1用 200 L 移液器从左至右逐个对点样孔进行吹打，直至点样孔内无碎胶、气泡以及其他杂质。取 5 在胶板的一侧或适当位置的样品槽中加入 4 L 的 2000 为对照，电泳在200 V 稳压，电流 300 件下进行，电泳时间约为2.5 h3 h。 泳结束，关闭电源，将上槽中 1冲液放出，取下固定的夹子，将玻璃板水平放置，起胶铲一侧沿灌胶口边缘缓慢撬起，将紧贴有凝胶的玻璃板放入装有双蒸水的洗胶盘中，使凝胶与玻璃板分离，取出玻璃板，放净双蒸水。 染 定 将取出的凝胶小心放入装有 1 L 新配制的 10%冰乙酸（固定/终止液）的塑料方盒中，水平摇床上80 r/摇10 洗 将胶小心转入双蒸水中漂洗2 次，每次2 净双蒸水。 色 在新配好的 500 7%甲醛溶液，充分混匀后沿一角倒入装有凝胶的方盒中，水平摇床上 80 r/净染色液。 25892016 5 方盒中加入1 L 双蒸水，脱色摇床上80r/s，倒净双蒸水。 2 7%甲醛溶液加入提前4 预冷的500 分混匀后沿一角倒入方盒中，水平摇床上 80r/影 将胶小心取出，用双蒸水冲洗一次后迅速放入 10%冰乙酸中，水平摇床轻摇3 净固定液。 洗 在双蒸水中漂洗 2 次，每次 2 测 将凝胶轻轻放在白色透明的日光灯观测箱上，用玻璃棒铺平凝胶并赶出气泡，观察和记录电泳结果，用数码相机进行拍照；或用凝胶成像系统扫描拍照。 带记录 选取电泳图上清晰、易于辨认的多态性条带进行记录和统计，根据算出每个扩增条带相应的似值），以分别用“1”和“0”代表“有”带和“无”带的方法仔细记录，获得可利用计算机模拟分析图谱。 9 分析和鉴定 将待测种源的电泳结果与原种源的标准谱带相比较，从而鉴定出该种源的真实性。 25892016 6 A A 附 录 A （规范性附录） 关序列多态性）标记引物序列 所用关序列多态性）标记引物序列 引物编号（上游） 序列（53） 引物编号（下游） 序列（53） 25892016 7 B B 附 录 B （规范性附录） 主要试剂的配制 0.5 液 g 乙二胺四乙酸二钠（于80 2入氢氧化钠（超纯水定容至100 压灭菌，4 保存。 1 液 解于160 浓盐酸（超纯水定容至200 压灭菌，4 保存。 5 于160 容至200 压灭菌，4 保存。 00 50 .5 在600 g 动溶解后，加入200 100 0 定容至1000 压灭菌，4 保存。 4质量浓度）溴代十六烷基三甲胺（100 20 .5 1.4 ）。在500 g 动溶解后。加入100 40 .5 280 容至1000 压灭菌，4 保存。 TE（冲液 取1 .5 .2 水定容至100 压灭菌，4 保存。 mg/液 取 B）用 50 铝箔或黑纸包裹容器，室温保存，工作浓度为 1 mg/10 取80 先用160 加水定容至200 压灭菌，室温保存。 脂糖凝胶的配制 称取0.8 入100 微波炉中熔化至溶液透明（确保所有琼脂糖颗粒均完全熔化），冷却至50 60 ，加入 mg/g/匀后倒入放好梳子（距底板约1 载版上，凝胶厚度为3 凝胶完全凝固后放入电泳槽中，然后向槽内加入1 25892016 8 6 6质量分数）溴酚蓝、质量分数）二甲苯青、30 6% （质量分数）甘油和用时按照每5 L L 合接加到点样孔即可。 25892016 9 C C 附 录 C （规范性附录） 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂 0%丙烯酰氨（备液 成 分 用 量 备 注 丙烯酰氨（380 g 用400 叉双丙烯酰氨（20 g 用200 终体积 1000 色瓶中室温保存 0%过硫酸铵（液 成 分 用 量 备 注 过硫酸铵（1 g 双蒸水（10 装后- 20 保存。 0倍三羟甲基氨基甲烷0成 分 用 量 备 注 108 g 硼酸（55 g 0.5 40 双蒸水定容至1000 终体积 1000 温保存 % 非变性聚丙烯酰氨工作液 成 分 用 量 备 注 40%丙烯酰氨贮备液 10 用现配 10 双蒸水（35 10%过硫酸铵（100 L 四甲基乙二酸（200 L 25892016 10 附 录 D （规范性附录） 银染试剂 定/脱色液 成 分 用 量 备 注 冰乙酸（100 时配制 双蒸水（900 酸银（色液 成 分 用 量 备 注 硝酸银（3 g 37%甲醛（1.6 双蒸水（500 时配制，避光室温保存 氧化钠（影液 成 分 用 量 备 注 氢氧化钠（10 g 用前在4冰箱预冷30 7%甲醛（2 双蒸水（500 时配制，避光室温保存 25892016 11 附 录 E （资料性附录） 本实验方法选用辽宁地区引种的15个东部白松种源及15个东部白松种源一览表 脂糖凝胶电泳检测结果 物组合号 种子区域 种批 纬度 经度 来源/原产地 1 004 44 30 76 30 抚顺/加拿大 2 967 46 15 82 45 抚顺/加拿大 3 003 43 30 81 30 抚顺/加拿大 4 991 46 15 79 抚顺/加拿大 5 694 46 15 79 抚顺/加拿大 6 002 43 81 30 抚顺/加拿大 7 986 44 80 15 抚顺/加拿大 8 985 45 15 79 45 抚顺/加拿大 9 993 44 15 79 45 抚顺/加拿大 10 700 46 15 84 抚顺/加拿大 11 963 45 30 78 抚顺/加拿大 12 965 45 30 77 15 抚顺/加拿大 13 008 46 30 83