【基金标书】2010CB126300-重要养殖鱼类功能基因组和分子设计育种的基础研究

项目名称： 重要养殖鱼类功能基因组和分子设计育种的基础研究 首席科学家： 桂建芳 中国科学院水生生物研究所 起止年限： 2010 年 1 月 8 月 依托部门： 中国科学院 湖北省科技厅 一、研究内容 基于拟解决的鱼类分子设计育种的策略和理论基础以及鱼类分子设计育种的 可行性途径这 两个 关键科学问题， 本项目拟集中在鱼类主要经济性状如生殖、生长、抗性 的功能基因组和分子设计育种的基础方面， 重点解析这些主要经济性状的基因调控网络，开拓关键技术，其主要研究内容包括： 1） 鱼类生殖基因调控网络 及其分子设计育种的基础研究 采用基因转移、 导的基因敲降等技术，配合整体原位杂交、细胞示踪和免疫荧光定位等方法，重点解析鱼类生殖质 (基因调控网络；揭示重要生殖调控基因在鱼类卵母细胞成熟和卵 讨鱼类配子发生过程中双亲特异性甲基化在生殖调控中的作用及其及其调控网络；通过大规模 析等呈现技术，筛选雌雄个体间性别特异的 段标记，进而通过 隆分离与性别决定和性别分化相关基因；揭示鱼类性别决定和性别 分化的基因调控网络及其作用机理；筛选鉴定出可用于鱼类分子设计育种的性别特异表达基因和分子标记；开拓生殖调控基因和分子标记用于鱼类分子设计育种的可行性途径。 2） 鱼类生长的基因调控网络和分子设计育种的基础研究 采用 导的基因敲降、整体原位杂交、细胞示踪、免疫荧光定位以及组织碎片灌流和细胞孵育等在体和离体研究等技术，重点解析鱼类下丘脑/垂体控制生长的基因调控网络；揭示鱼类性成熟和生长的相互协调及其调控机理；探讨脑肠肽 /生长激素 /类胰岛素生长因子信号通路及其对鱼类生长的调控机制；揭示卵泡抑素等 抑肌素相关基因在调控鱼类肌肉细胞增殖和鱼肉蛋白 /脂肪平衡的作用机理；研制可控不育性转卵泡抑素等基因的转基因鱼品系；阐明鱼类个体大小调控基因的系统发育和进化规律；开拓生长基因调控网络和分子标记尤其是主控基因用于鱼类分子设计育种的可行性途径。 3） 鱼类抗性的基因调控网络和分子设计育种的基础研究 利用我们自主建立的分离鱼类抗病毒基因的细胞模型，重点解析鱼类干扰素系统和抗菌肽基因的调控网络和抗病作用机理；揭示重要鱼类病原与宿主免疫系统的相互作用及其作用机制；探讨在鱼类抗病免疫反应中主效基因调控网络、功能和抗病机理； 研制具有抗病性状的雌核发育系和近交家系；鉴别出与鱼类抗病性状密切相关的分子标记和等位基因及其抗病 位；建立鱼类抗病分子设计育种的理论和技术方法，开拓其可行性途径。 采用大规模测序和基因芯片分析等手段，通过比较转录组学和基因功能分析等研究手段，解析鱼类抗寒基因调控网络及其作用机理，揭示低温胁迫下不耐寒鱼类基因表达谱与耐寒鱼类基因表达谱的差异及其关键基因的功能；创制鱼类抗寒机理研究模型，开拓鱼类抗寒基因用于分子设计育种的可行性途径。 4）鱼类分子设计育种的关键技术研究 通过建立鱼类数量性状基因调控网络信息 整合技术和鱼类经济性状主效基因的图谱定位，揭示鱼类经济性状主效基因同线性和性状关联性关系，阐明鱼类经济性状主效基因转录组以及它们在群体和家系中的功能，确定鱼类经济性状主效基因标记和基因不同组合的遗传效应，评估其育种效率，由此创建可用于鱼类分子设计育种的数量性状多基因聚合育种的技术路线。 通过创制基于蛋白分子设计、 隆、转座子系统、 因靶位操作的稳定、高效的鱼类转基因技术，优化和完善基于蛋白质锌指结构的鱼类基因快速敲除系统，创建基于破坏原生殖细胞发生或维持的具有遗传安全的鱼类转基因技术体系 等建立可用于鱼类分子设计育种的基因操作技术路线，并揭示性腺特异小 基因表达调控中的作用，阐明 互作蛋白的调控途径，研制出持续激活的生长激素受体基因的转基因鱼，揭示持续转激活生长激素受体基因与转生长激素基因的转基因鱼的效应及其信号通路的调控差异。 二、预期目标 本项目的总体目标： 针对水产养殖业发展现状和可持续发展需求，通过开展重要养殖鱼类生殖、生长和抗性等主要经济性状的功能基因组研究，解析鱼类生殖的基因调控网络、鱼类生长的基因调控网络、鱼类抗病和抗寒的基因调控网络，筛选鉴定进行分子设计育种的主控或关键基因和分子标记，建立鱼类分子设计育种的关键技术及其技术体系，在理论上阐明鱼类生殖、生长、抗病和抗寒等主要经济性状和重要生命现象的基因调控网络及其作用机理，提出鱼类良种分子设计的策略；在技术方法上，建立鱼类分子设计育种的多基因聚合和基因操作技术，创制优质育种材料，创建鱼类分子设计育种的可行性途径。通过这些研究，使我国在鱼类功能基因组研究中居国际领先水平，为培育高产优质养殖新品种奠定理论和技术基础，为我国水产养殖业的可持续发展和渔业生物技术的创新做出贡献。 五年预期目标 : 1. 解析鱼类生殖、 生长、抗病和抗寒的基因调控网络； 2. 筛选鉴定 具有自主知识产权、 可用于鱼类分子设计育种的功能基因和分子标记 30 50 个 ； 3. 揭示鱼类性别决定与分化、卵母细胞成熟和卵 4. 阐明鱼类生长激素分泌的信号通路； 5. 阐明鱼类 干扰素系统关键基因和重要抗菌基因的抗病功能及其作用机理；阐明鱼类抗寒关键信号通路及其作用机理； 6. 建立鱼类数量性状多基因聚合育种技术； 7. 创建基于蛋白分子设计和遗传安全的稳定高效的基因操作技术； 8. 建立主要经济性状功能基因组研究和分子设计育种中间的有机联系，创制 2 3 个在生殖、生长 或抗性等目 标经济性状上表现优质的育种材料； 9. 凝聚和 培养一批有国际影响的中青年学术带头人 和学术骨干 ；发表一批高质量的学术论文，其中在有重要国际影响的期刊（ 相关领域引用排名前 15%的期刊或影响因子大于 5 的期刊）发表论文50 篇以上。 三、研究方案 （一）、学术思路： 针对 水产养殖业发展现状和可持续发展需求， 以鲫和鲤等为主要研究对象，启动我国 重要养殖鱼类功能基因组和分子设计育种的基础研究， 通过研究鱼类生殖、生长和抗性的基因调控网络及其作用机理，筛选鉴定进行分子设计育种的关键基因和分子标记，建立鱼类分子设计育种的关键技术 及其技术体系，解决鱼类分子设计育种的策略和理论基础以及鱼类分子设计育种的 可行性途径这两个 关键科学问题，为鱼类分子设计育种的实践和应用以及为我国水产养殖业的可持续健康发展和渔业生物技术的创新做出贡献。 （二）、技术途径： 1. 采用 度测序等大规模测序和基因芯片分析等手段，通过比较转录组学分析，了解鱼类生殖和生长不同阶段、以及抗病和不抗病、耐寒和不耐寒的基因表达谱差异，经生物信息学比较和分子特征分析，由此筛选调控鱼类生殖、生长、抗性的主要基因和关键基因； 2. 建立重要鱼类基因组 ，研究 基因的结构，克隆分离相应基因的启动子；将其启动子与 告基因重组融合，利用基因转移等技术，采用流式细胞仪等筛选分析技术，进一步研究生物学功能； 3. 建立鱼类 基因技术，用杂交方法或 法筛选重要功能基因的隆，在基因编码框的适当位置插入绿色荧光蛋白（ 因；利用以上构件制备转基因鱼，通过 析这些基因的时空表达情况及其生理学效应； 4. 通过基因连锁分析和原位杂交等技术，研究目的基因在染色体上的定位，揭示基因相互作用的基因组组织基础； 5. 用 位杂交和 法在 蛋白水平上检测基因表达的组织特异性和时序性 ;用免疫荧光定位确定其基因的蛋白产物的组织、细胞和亚细胞定位； 6. 采用染色质 免疫 沉淀法（ 凝胶迁移或电泳迁移率检测（ 技术研究 7. 采用免疫共沉淀（ 光共振能量转移（ 双分子荧光互补（ 技术研究蛋白相互作用； 对一些重要蛋白进行质谱分析、并对其进行泛素化、乙酰化和磷酸化等修饰分析； 8. 鉴定两性生殖鲫鱼卵子中双亲特异性甲基化、发育不等性基因， 分析单性生殖鲫鱼三倍体卵子中相关同源基因启动子 甲基化差异和基因表达调节差异，确定发生差异甲基化的目标基因；比较分析两性生殖与单性生殖鲫鱼卵子基因组中差异甲基化功能基因启动子，鉴定差异甲基化顺式调控序列。 9. 采用正常的和人工突变后的基因转移试验，辅以其它分子生物学方法如目的基因表达产物体内、外诱导处理等来分析目的基因的生理功能； 10. 用显微注射方法研究基因功能。将含有这些基因的真核表达载体，或在大肠杆菌中表达出的蛋白，注射到胚胎中或转染到细胞中，观察生物学效应； 11. 将目的基因的反义 察生物学效应； 12. 对生殖调控基因而言，设立人工性反转实验，分别提取不同性反转阶段实验组和对照组性腺的 蛋白，采用上述方法研究基因表达的时序性； 13. 对生长和生殖功能基因而言，合成重要调控生长生殖基因的结构类似物或表达具有生物活性重组蛋白，取鱼类的下丘脑、垂体、肝脏和性腺，通过碎片灌流和细胞孵育等离体研究方法，或直接注射结构类似物或重组蛋白，采用放射免疫测定等方法研究其活性，测定各种靶组织、血清中调控生殖生长激素的含量，分析这些生长调控因子和生殖调控因子的相互作 用及其信号传递机制，分析它们对鱼类生殖和生长的影响； 14. 通过体外合成小分子 立鱼类系统中适用于实验室日常工作的、简洁、高效的 术平台；通过克隆获得的鱼类来源的启动子构建针对草鱼出血病病毒的 体，建立抗病转 因鱼模型；通过 导的系统进行鱼类胚胎中的条件基因打靶研究；建立鱼类胚胎干细胞和生殖干细胞系，建立鱼类培养细胞体外基因操作和个体重建技术途径； 15. 通过 导的基因敲降技术，配合整体原位杂交、细胞示踪等方法，研究目的基因的生理 学功能及其基因调控网络、信号通路和作用机理等； 16. 采用已经建立的细胞模型，研究病毒与宿主细胞的相互作用，在此基础上，通过转染目的基因和 扰等技术手段，研究目的基因的生理学功能以及基因的调控网络； 17. 通过 微卫星等遗传标记的大规模筛选，鉴定出与鱼类性别等等主要经济性状相关的分子遗传标记，进而通过 隆鉴定相关功能基因；通过人工选育和家系分析，利用遗传标记进行基因型分析的优势，研究特定标记与某些经济性状（例如生长、性别、抗病或抗寒）的连锁关系，进行分子标 记辅助育种；开展鱼类生长、饲料转化率等经济性状的 位分析和位分析； 18. 改造基于蛋白质锌指结构的基因敲除载体系统，优化基因敲除载体，引入更多的克隆位点，以简化特异基因敲除载体的构建；利用 上软件包（ ,选取代表性基因进行锌指结构域的索寻，选择连续 20 或 30 个氨基酸的合适结构域，依据针对 联体的经验锌指氨基酸序列，设计靶标多肽和碱基序列；将靶标多肽的 段克隆到经改进后的基因敲除载体上；体外合成 微注射；观察表型，并利用 测显微注射个体的基因型，获得杂合体；将杂合体个体扩大培养，并进行相互交配，以获得基因的两个拷贝均缺失的纯合体；系统分析基因缺失纯合体的表型。 技术途径的示意图如下： 细胞示踪等研究细胞发育命运方法、胚胎细胞移植等 体外孵育或灌流结合放射性免疫测定研究生理功能 基化分析 启动子分析 导、 扰等基因敲降方法 基于蛋白质锌指结构的基因敲除 模式鱼类（斑马鱼、青 鳉 、河豚、三棘刺鱼 等 ）全基因组信息 前期 已获得 的 大量与鱼类生殖、生长和抗性相关基因资源 已建立 的大批鱼类细胞系 鱼类生殖、生长和抗性的主控基因和分子标记的功能揭示和作用机理 阐明 比较转录基因组分析 疫组化、 研究时空表达谱等方法 研究蛋白相互作用方法 研究核酸与蛋白相互作用等方法 白质质谱分析、蛋白质泛素化、乙酰化等修饰分析 鱼类分子设计育种数量性状多基因聚合技术 鱼类分子设计育种的基因操作技术 多基因信息整合 性状的 析 基因同线性与性状关联性分析 蛋白分子设计、 基于蛋白质锌指结构的基因敲除方法、 座子、 作、 控 鱼类生殖、生长和抗性 基因调控网络的解析 鱼类分子设计育种的策略和可行性途径 （三）、创新点与特色： 1) 重要的研究对象，体现了国家重大需求导向： 本项目以我国重要养殖鱼类鲫、鲤等为主要研究对象，围绕水产养殖业可持续健康发展和渔业生物技术创新所要解决的鱼类分子设计育种 的策略和理论基础以及鱼类分子设计育种的 可行性途径这两个 关键科学问题开展研究，着眼于解决国家中长期发展中所需要解决的重大科学问题，体现了重大的国家需求导向。 2) 独特的研究体系，注重发挥中国特色和优势： 银鲫多倍体的遗传背景和同时具有的雌核发育生殖和有性生殖双重生殖方式以及性逆转鱼类奇特的性别分化现象为解析鱼类生殖和性控的基因调控网络提供了 新颖、 独特的研究体系，有利于发挥我国的特色和优势。 3) 新 颖 的学术思路， 起到前瞻性、战略性和引领性作用 ： 本项目瞄准了国际上有关鱼类分子设计育种的难点和热点问题，试图直接通过解析鱼类生殖、生长和抗性的基因调控网络来阐明其调控机理，筛选鉴定可用于鱼类分子设计育种的关键基因和分子标记，由此创建鱼类分子设计育种的关键技术及其技术体系，对 指导并推动我国水产业的可持续健康发展具有重要的前瞻性、战略性和引领性作用。 （四）、可行性分析： 1) 厚实的前期研究基础，目标明确： 鱼类等水产动物的分子设计育种研究虽然还处于起步阶段，但可喜的是，随着斑马鱼、河 鲀 和青 鳉 等模式鱼类全基因组测序的完成和基因功能研究的不断深入，一些重要养殖鱼类的功能基因组研究已进展很快，特别是我们这个团队在上一期 973 计划 “ 重要鱼 类品种改良的遗传和发育基础研究 ” 的支持下，已筛选鉴定出一批与我国主要养殖鱼类的生殖、生长、抗性等经济性状相关的基因和分子标记，建立了 10 多个养殖鱼类细胞系， 积累了 厚实的前期研究基础。本项目的研究内容是在这些基础上进一步凝聚而来，目标更为明确。 2) 精干、务实的研究团队，成效突出： 本项目集中了中国科学院、中国水产科学研究院、中山大学、浙江大学、武汉大学等相关科研单位和高等院校在本领域的优秀人才，具有强烈的使命感和责任感，经过五年的合作，已取得了相当高的学术成绩，主要学术带头人在项目执行过程中发表了高水平的学术论文 ，有的还获得国家杰出青年科学基金资助，已形成一支经过磨练、对科学有执着追求、精干、务实、高效的研究团队，成为本项目顺利实施的人才保证。 3) 坚实、完善的研究基地，支撑有力： 本项目利用淡水生态与生物技术国家重点实验室、有害生物控制和资源利用国家重点实验室和多个部门重点开放实验室研究基地的研究条件，这些实验室拥有完善的一流研究设备，先进的研究条件，是顺利完成本项目的坚实支撑和重要物质基础。 （五）、 课题设置 围绕项目所要解决的鱼类分子设计育种的策略和理论基础以及鱼类分子设计育种的 可行性途径这两个 关键科学问题，以 及项目所要达到为鱼类分子设计育种的实践与应用和为我国水产养殖业的可持续健康发展与渔业生物技术的创新做出贡献的预期目标，根据项目所要进行的主要研究内容（研究鱼类生殖、生长、抗性的基因调控网络及其作用机理，筛选鉴定可用于分子设计育种的关键基因和分子标记，建立鱼类分子设计育种的关键技术及其技术体系），项目共设置 6 个课题。项目的主要研究内容、课题设置的思路、各课题间的联系和与项目拟解决的关键科学问题和总体目标的关系如下图所示。 项目的主要研究内容、课题设置和课题间的联系 与项目拟解决的关键科学问题和总体目标的 学术思路图 项目设置的 6 个课题是： 课题 1 鱼类生殖基因调控网络和分子设计育种的基础研究； 课题 2 鱼类生长基因调控网络和分子设计育种的基础研究； 课题 3 鱼类抗病基因调控网络和分子设计育种的基础研究； 课题 4 鱼类抗寒基因调控网络和分子设计育种的基础研究； 课题 5 鱼类数量性状多基因聚合育种技术研究； 鱼类主要经济性状的功能基因组 鱼类生殖功能基因组 鱼类分子设计育种的策略和理论基础 鱼类生长功能基因组 鱼类抗性功能基因组 主要研究内容 解决的关键 科学问题 总体目标 鱼类生殖基因调控网络和分子设计育种的基础研究 鱼类生长基因调控网络和分子设计育种的 基础研究 鱼类抗病基因调控网络和分子设计育种的 基础研究 鱼类 抗寒基因 调控网络和分子 设计育种的 基础研究 课题设置的 思路 鱼类分子设计育种的基因操作技术研究 鱼类数量性状多基因聚合 育种 技术研究 鱼类分子设计育种的可行性途径 鱼类分子设计育种的实践与应用 课题 6 鱼类分子设计育种的基因操作技术研究。 以下将具体说明各课题的主要研究目标、主要研究内容、承担单位、课题负责 人及主要学术骨干和经费比例等。 课题 1 鱼类生殖基因调控网络和分子设计育种的基础研究 主要研究目标： 解析鱼类生殖质 (基因调控网络，揭示鱼类生殖质主要成分的功能及其作用机制；阐明鱼类配子发生过程中双亲特异性甲基化在生殖调控中的作用及基因调控网络；揭示鱼类卵母细胞特异组蛋白、 胚转换机制；揭示鱼类性别决定和性别分化的基因调控网络及其作用机理；筛选鉴定出可用于鱼类分子设计育种的性别特异表达基因和分子标记；开拓生殖调控基因和分子标记用于鱼类分子设计育 种的可行性途径。 主要研究内容： 鱼类生殖质 的 成分解析及其基因调控网络研究； 鱼类生殖质主要成分的功能及其作用机制研究； 鱼类配子发生过程中特异性甲基化等位基因功能及其调控网络研究； 鱼类卵母细胞特异组蛋白、 卵子成熟中的作用及调控机制研究； 鱼类卵 鱼类性别决定和性别分化的基因调控网络、功能解析和作用机理研究； 鱼类性别特异表达基因和分子标记的鉴定及其分子设计育种可行性研究。 承 担 单 位 ： 中国科学院水生生物研究所、浙江大学 课题负责人 ： 桂建芳 主要学术骨干 ： 周莉、罗琛、汪洋、郑康、李忠、李志、魏丽华 经费比例： 25% 课题 2 鱼类生长基因调控网络和分子设计育种的基础研究 主要研究目标： 阐明鱼类下丘脑 /垂体控制生长的基因调控网络；揭示鱼类性成熟和生长的相互协调及其调控机理；阐明脑肠肽 /生长激素 /类胰岛素生长因子信号通路及其对鱼类生长的调控机制；揭示卵泡抑素等抑肌素相关基因在调控鱼类肌肉细胞增殖和鱼肉蛋白 /脂肪平衡的作用机理；研制出可控不育性转卵泡抑素等基因的转基因鱼品系；阐明鱼类个体大小调控基因的系统发育和进化规律；开拓生长基因调控网络和分子标记尤其是主控基因用于鱼类分子设计育种的可行性途径。 主要研究内容： 鱼类下丘脑 /垂体的功能基因组以及鱼类生长的基因调控网络研究； 鱼类性成熟和生长的相互协调及其调控机理研究； 脑肠肽 /生长激素 /类胰岛素生长因子信号通路和对鱼类生长调控机制研究； 抑肌素信号调控在鱼类肌肉细胞增殖和蛋白 /脂肪平衡中作用机理研究； 可控不育性转卵泡抑素等基因的转基因鱼品系研制及其生理学功 能分析； 鱼类个体大小调控基因的系统发育和进化规律研究； 生长调控基因和分子标记用于鱼类分子设计育种的可行性途径研究。 承 担 单 位 ： 中国科学院水生生物研究所、中山大学 课题负责人 ： 殷战 主要学术骨干 ： 林浩然 、 李文笙 、黄安林、 贺江燕、 王绪祯 、 陈尚萍 经费比例： 16% 课题 3 鱼类抗病基因调控网络和分子设计育种的基础研究 主要研究目标： 阐明鱼类干扰素系统和抗菌肽基因的调控网络和抗病作用机理；揭示在鱼类抗病免疫反应中主效基因的表达调控机制；阐明重要鱼类病原与宿主免疫系统的相互作用及其作用 机制；研制具有抗病性状的雌核发育系和近交家系；鉴别出与鱼类抗病性状密切相关的分子标记和等位基因及其抗病 位；建立鱼类抗病分子设计育种的理论和技术方法，开拓其可行性途径； 主要研究内容： 鱼类干扰素系统基因的功能解析、调控网络和作用机理研究； 重要鱼类病原与宿主免疫系统的相互作用及其作用机制研究； 鱼类抗细菌免疫基因的信号调控网络、功能分析和抗病机理研究； 具有抗病性状的雌核发育系和近交家系的创制和筛选； 与抗病性状相关的分子标记和等位基因的鉴定及其抗病 位研究； 鱼类抗病分子设计育种的理论和技 术方法的建立及其可行性途径研究。 承 担 单 位 ： 中国水产科学研究院黄海水产研究所、中国科学院水生生物研究所 课题负责人 ： 廖小林 主要学术骨干 ： 陈松林 张义兵 、 朱蓉、袁秀平、沙珍霞 、 田永胜、王娜 、 经费比例： 16% 课题 4 鱼类抗寒基因调控网络和分子设计育种的基础研究 主要研究目标： 阐明鱼类抗寒基因调控网络及其作用机理；揭示低温胁迫下不耐寒鱼类基因表达谱与耐寒鱼类基因表达谱的差异及其关键基因的功能；阐明鱼类耐寒基因调控网络及其作用机理；创制鱼类抗寒机理研究模型，开拓鱼类抗寒基因用于分子设计育种的 可行性途径。 主要研究内容： 鱼类耐寒基因调控网络、功能分析和作用机理研究； 不耐寒鱼类低温胁迫下基因表达谱与耐寒鱼类基因表达谱的差异比较及其关键基因的鉴定和功能研究； 耐寒与不耐寒鱼类温度适应调控机制的差异的解析； 鱼类抗寒机理研究模型的研制； 鱼类抗寒基因和分子标记用于鱼类分子设计育种的可行性途径研究。 承 担 单 位 ： 中国科学院遗传与发育研究所、中国科学院海洋研究所 课题负责人 ： 陈良标 主要学术骨干 ： 沈玉、曹立雪、谭训刚、尤锋 经费比例： 10% 课题 5 鱼类数量性状多基因聚合育种技术研究 主 要研究目标： 建立鱼类数量性状基因调控网络信息整合技术；揭示鱼类经济性状主效基因的图谱定位、同线性和性状关联性关系；阐明鱼类经济性状主效基因转录组以及在群体和家系中的功能；确定鱼类经济性状主效基因标记及基因不同组合的遗传效应，评估其育种效率；创建可用于鱼类分子设计育种的多基因聚合育种的技术路线。 主要研究内容： 鱼类数量性状基因调控网络信息整合技术研究； 鱼类经济性状主效基因的图谱定位、同线性和性状关联性研究； 鱼类经济性状主效基因转录组分析以及在群体和家系中的功能研究； 鱼类主效基因标记及基因不同组合的 遗传效应与育种效率评估研究； 可用于鱼类分子设计育种的多基因聚合技术研究。 承担单位： 中国科学院水生生物研究所、中国水产科学研究院黑龙江水产研究所 课题负责人 ： 童金苟 主要学术骨干 ： 孙效文 、王忠卫、俞小牧、张骁锋、耿波、贾智英、梁利群 经费比例： 16% 课题 6 基于鱼类分子设计育种的基因操作技术研究 主要研究目标： 创制基于蛋白分子设计、 隆、转座子系统、 因靶位操作的稳定、高效的鱼类转基因技术；优化和完善基于蛋白质锌指结构的鱼类基因快速敲除系统；揭示性腺特异小 基因表达调 控中的新途径，阐明 互作蛋白及其调控途径；创建基于破坏原生殖细胞发生或维持的具有遗传安全的鱼类转基因技术体系；研制出持续激活的生长激素受体基因的转基因鱼；揭示持续转激活生长激素受体基因与转生长激素基因的转基因鱼的效应及其信号通路的调控差异。 主要研究内容： 基于 隆、转座子系统、 因靶位操作的稳定、高效的鱼类转基因技术研究； 基于蛋白质锌指结构鱼类基因快速敲除系统的优化和完善； 持续激活的生长激素受体的分子设计及其转基因鱼的研制； 转持续激活生长激素受体基因鱼与转生长激素基 因鱼的效应及生长激素信号通路上下游关键因子的比较研究； 性腺特异的小分子 性别分化中的动态特性及其作用机理研究； 基于破坏生殖细胞发生或维持的具有遗传安全的鱼类转基因技术体系研究。 承 担 单 位 ： 中国科学院水生生物研究所、武汉大学 课题负责人 ： 孙永华 主要学术骨干 ： 肖武汉 、 刘静霞 、 程汉华 、 王燕舞 、 罗大极 、 刘江东 、 曹宏 经费比例： 17% 四、年度计划 年度 研究内容 预期目标 第 一 年 1. 重要养殖鱼类基因组 库构建以及与生殖、生长、抗病和抗寒等主要经济性状相关组织的比较转 录组分析； 2. 重要养殖鱼类与生殖、生长、抗病和抗寒等主要经济性状相关功能基因的克隆及其分子标记筛选 ； 3. 抑肌素信号表达水平改变对鱼体肌肉生长的调控研究； 4. 细菌病和病毒性疾病抗性群体和易感群体的筛选和建立； 5. 抗寒候选基因 的 转基因操作研究 ； 6. 鲤鱼 析家系的建立及其多态性微卫星和 遗传标记的发掘筛选和验证； 7. 鱼类生长和抗病等经济性状 8. 多种转座子元件介导的转基因试验 和 基因敲除载体系统 的改造 ； 9. 持续激活的生长激素受体基因的分 子设计 ， 原生殖细胞特异表达基因的鉴定 ，小 分离、克隆 和 深度测序。 1. 解析重要养殖鱼类与生殖、生长、抗病和抗寒等主要经济性状相关组织的转录组信息； 2. 鉴定调控鱼类生殖、生长、抗病和抗寒的功能基因或分子标记 6 3. 构建在养殖鱼类肌肉组织中高表达抑肌素抑制蛋白的转基因鱼 4. 建立牙鲆细菌病抗性群体和易感群体； 5. 建立转座子介导的抗寒候选基因转移体系，使候选基因在子一代鱼中出现的频率比用质粒转移提高 3倍以上 ； 6. 获得多基因性状基因遗传分析的鲤鱼家系材料 9，获得微 卫星和 2000 个， 记 1000多个； 7. 获得多种转座子元件介导的转基因鱼 ， 获得三联体锌指蛋白表达质粒和哺乳动物细胞系单杂交系统特异性检测质粒； 8. 获得鱼类生长激素受体基因及其持续激活形式的分子设计 ， 获得原生质细胞特异表达基因 ， 获得性腺相关的小 年度 研究内容 预期目标 第 二 年 1. 重要养殖鱼类基因组 库以及与生殖、生长、抗病和抗寒等主要经济性状相关组织的比较转录组 的进一步 分析； 2. 重要养殖鱼类与生殖、生长、抗病和抗寒等主要经济性状相关功能基因的克隆及其分子标记筛选 ； 3. 差异 顺式调控序列与相关基因启动子差异甲基化修饰的关系分析； 4. 可控性卵巢发育抑制转基因鱼类模式品系的构建； 5. 抑肌素信号通路研究； 6. 牙鲆抗病性状关联分析基础群体和 图群体构建； 7. 抗 寒基因转基因斑马鱼研究 及 子一代 的 耐寒性能评估 ； 8. 遗传图谱构建及其鲤鱼 主效基因在染色体上的同线性分析； 9. 多种转座子元件介导的转基因效率比较， 因靶位操作效率分析 ， 基因敲除试验 和表型观察 ； 10. 转持续激活的生长激素受体基因 鱼 的建立 ， 原生殖细胞特异表达基因的表达敲落 和启 动子分析，小 态变化规律 和 互作蛋白的研究。 1. 鉴定调控鱼类生殖、生长、抗病和抗寒的功能基因或分子标记 10 2. 揭示差异顺式调控序列与相关基因启动子差异甲基化修饰的关系及其功能特征； 3. 构建可控性性腺发育抑制转基因稳定遗传品系； 4. 完成对养殖鱼类肌肉组织中抑制抑肌素功能受阻的 对其进行肌肉生长性状特征的初步观察； 5. 获得构建牙鲆抗病性状关联分析基础群体和 6. 获得 3 个抗寒基因的 转基因斑马鱼 ； 获得 5 个抗寒基因的 转基因罗非鱼 。 7. 图谱上 300个标记以上；建立后备亲鱼的核心群体 100尾以上；图谱定位 得基因同线性分析的结果； 8. 获得可用于鱼类转基因的高效的转座子 和 获得 9. 获得转基因鱼 获得原生质细胞特异表达基因敲落 的胚胎和 原生殖细胞特异启动子系统 ， 揭示小得相关互作蛋白。 年度 研究内容 预期目标 第 三 年 1. 鱼类生殖、生长、抗病和抗寒的重要基因的功能分析； 2. 基因启动子的差异甲基化修饰在表达和生殖调控中的作 用研究； 3. 不同尺寸鱼类物种的分子系统学分析； 4. 创制育种上有价值的雌核发育系和近交家系； 5. 罗非鱼转抗寒基因研究 ； 6. 继续遗传图谱构建和 记或主效基因的基因型 7. 稳定高效的转座子系统转基因模型和 因靶位操作模型的建立；基因敲除斑马鱼的 +/- 子代个体 的获得 ； 8. 转持续激活的生长激素受体基因鱼 的筛选、鉴定及其信号通路活性分析 ， 原生殖细胞特异基因的分子设计和转基因初步试验 ， 小 续互作蛋白的研究。 、生长、抗病和抗寒的功能基因或分子标记 10 母细胞成熟、卵胚转换以及性别决定和分化中的功能；确定基因启动子的差异甲基化修饰在其表达和生殖调控中的作用； 3. 分析鱼类生长轴负反馈调控受阻对鱼体肌肉组织的生长和肉质特征的影响；揭示可控性卵巢组织发育抑制的转基因鱼品系操作特性以及其抑制效率，观察性成熟受阻对鱼体生长发育影响特征； 4. 构建所选择鱼类个体大小调控基因的系统发育关系，并对其起源提出假设； 5. 阐明 2关键抗病毒相关基因的抗病毒作用 及其功能机理；阐明抗菌肽基因的抗细菌功能及其功能机理；鉴定鱼类具有重要育种价值的与抗病性状紧密连锁的分子标记或功能标记 2； 6. 建立育种上有价值的抗细菌病的牙鲆等鱼类雌核发育系和近交家系 5个左右； 7. 揭示 4 个重要抗寒基因的生物学功能 ； 鉴定 4 5 个有可能用于育种的抗寒基因 ； 获得具有抗寒性能的转基因斑马鱼模型 ； 8. 图谱上 300 个标记以上；建立后备亲鱼成熟的核心群体年度 研究内容 预期目标 100 尾以上；验证鲤鱼和银鲫 10 个左右基因与生长、抗病（抗寒）或饲料转化率等性状的关联性，验证 4主效基 因的遗传效应和育种潜力； 9. 建立稳定高效的转座子系统和因靶位操作模型 ， 获得 基因敲除斑马鱼的杂合子个体； 10. 获得转持续激活的生长激素受体基因鱼 ， 完成原生殖细胞特异表达基因的分子设计 ， 揭示小 第 四 年 1. 鱼类生殖、生