【基金标书】2010CB529700-炎症过程中细胞间相互作用的信号转导机制及其应用研究

项目名称： 炎症过程中细胞间相互作用的信号转导机制及其应用研究 首席科学家： 耿建国 中国科学院上海生命科学研究院 起止年限： 2010 年 1 月 8 月 依托部门： 中国科学院 上海市科委 一、研究内容 本项目将针对炎症过程中细胞的识别、黏附、极性形成、迁移和效应等细胞间相互作用的不同步骤，分别有侧重的展开深入研究，发现新的信号调控分子 和揭示新的信号转导机制，并进一步对细胞参与炎症反应的整个过程进行综合分析和整体把握，加深我们对炎症反应过程本质的系统认知。主要研究内容包括以下几方 面： 1揭示 调控 炎症细胞 识别炎症信号 与其 它细胞或胞外基质发生黏附 ， 形成极性并响应炎症信号发生迁移 ， 以及 最终 发挥 生物学效应 的 信号转导机制 ： 从分子生物学、表观遗传学、生物化学和细胞生物学等角度，利用基因转录调控、表观遗传调控、生物化学分析和细胞活性检测等方面的现代生物学研究手段，深入探讨 膜受体、 整合 素等细胞黏附分子、 等 关键转录因子、组蛋白等表观遗传调控蛋白、细胞因子、 基质蛋白酶类以及 细胞分泌蛋白等，对炎症过程中细胞的识别、黏附、极性形成、迁移和效应等细胞间相互作用进行精确调控的分子机制和关键 因子 。 2. 解析炎症过程中细胞间相互作用的信号转导在炎症相关重大疾病发生发展中的生物学功能 ：利用基因工程小鼠技术和小动物炎症模型，建立与发展基于炎症中细胞间相互作用的重大疾病研究模型与系统，深入研究上述发现的新的信号转导分子、调节分子和信号途径间的交互作用与恶性肿瘤、心脑血管疾病、哮喘、类风湿性关节炎和全身炎症反应综合征等重大疾病发生发展的关系以及可能存在的致病机理。结合本项目团队中来自医科大学的成员所拥有的临床资源， 在病人样品和实例中确认所发现的炎症调控信号转导机制，对若干重大疾病的机理提出重要见解，并提供 潜在的诊治靶点。 3. 发现新的抗炎药物作用靶点，利用相应 的药靶筛选系统进行主要基于小分子化合物规模化筛选的抗炎药物研发： 争取发现针对炎症相关重大疾病的新的抗炎药物作用靶点，并建立有效的筛选系统，利用商业化合物库和已建立的小分子化合物库，进行针对候选靶点的小分子化合物活性筛选。根据活性化合物的结构，进行合理药物设计和结构多样性的合成，通过数轮的结构优化和全面的构效关系分析，获得先导化合物 。 根据构效关系，对活性化合物进 行选择性的分子标记（如生物素标记和荧光标记等），用作生物学研究的工具分子。同时积极开展活性先导化合物的体内抗炎活性评价。 4. 建立和完善炎症研究领域的技术和生物学分析体系： 在以上系统深入的研究过程中，依靠科技进步和技术创新，不断完善炎症中细胞间相互作用的研究技术和策略，建立更高效更合理的炎症领域研究系统和分析体系。 二、预期目标 （一）总体目标 本项目将围绕炎症及其相关重大疾病中细胞的识别、黏附、极性形成、迁移和效应等方面，系统研究炎症过程中的细胞间相互作用，阐释 炎症细胞 及其所处环境间相互作用的信号转导 机制和调控规律，探讨 炎症细胞 参与重大疾病发生发展的生物学基础，鉴定一系列调控炎症反应的关键蛋白，为炎症相关疾病的诊治提供具有自主知识产权的策略和手段。通过本项目的实施，获得一系列国际领先的研究成果，打造一支达到国际先进水平的炎症研究队伍，使我国的炎症相关基础研究和应用研究跻身于国际先进行列 。 （二）五年预期目标 1. 在基础理论研究方面 ： （ 1） 从分子、细胞到动物整体水平，发现并确认 多种 调控炎症过程中细胞间相互作用的新的关键调控因子和信号途径，阐明这些新的分子调控机理在 炎症细胞 的识别、黏附、极性形成、迁移和效应等过程中 的生理功能。 （ 2） 解析上述调控炎症过程中细胞间相互作用的信号转导机制在恶性肿瘤、心脑血管疾病、哮喘、类风湿性关节炎和全身炎症反应综合征等重大疾病发生发展中的分子病理学机制。 （ 3） 建立和完善炎症研究领域的技术和生物学分析体系，形成 1 2种新技术方法和本领域的前沿性研究体系。 2. 在应用基础研究方面 ： 通过发现和揭示与重大疾病相关的调控 炎症细胞 间相互作用的新分子、新功能和新机制，确定有效的抗炎 新通路或新靶 标，建立快速可靠的活性化合物筛选模型 。通过通量筛选、合理药物设计、多样性合成、和结构优化，获得 10个以上有效的抗炎活性先导 化合物，完成较全面的构效关系研究，并期望获得 2个以上具有显著抗炎效果的药物候选化合物。 3. 成果考核指标 ：努力在国际相关研究领域做出具有重要影响的工作，在国际一流杂志（ 0）发表 10 篇以上论文，在有影响力的杂志（ ）上发表50篇以上论文，申请 10项以上相关专利。 4. 人才培养 ：培养博士研究生 50 80人，国家杰出青年等高级人才 1 3名。 三、研究方案 （一）总体研究 思路 炎症反应的发生从本质上讲就是各种 炎症细胞 在致炎 /抗炎因子等作用下，通过不同的信号转导机制发生相互作用的过程，包括了从 炎症细胞 识别炎症 信号与其它细胞或胞外基质发生黏附，到 炎症细胞 形成极性并响应炎症信号发生迁移，以及最终 炎症细胞 发挥生物学效应的整个过程，既有明确的阶段和步骤，又是相互间 在时空上 密切联系、有机统一的完整过程 。 整个过程可分为细胞的识别、黏附、极性形成、迁移和效应等不同 步骤 ，而其中每一步骤都受到精细的信号调控，各种信号转导机制是调控细胞生命活动的基础。本项目将针对上述炎症过程中细胞间相互作用的每一步骤分设课题，分别展开深入的信号转导机制研究，以期能在整个项目层面上对整个炎症反应过程有一个系统综合的认知。只有在对炎症过程中调控细胞生 命活动的信号转导机制进行充分认知的基础上，才能深入了解细胞生命活动在炎症相关重大疾病发生发展中的作用，有效确定治疗炎症的药物作用靶点，并进行相应的药物筛选和开发，为炎症及其相关重大疾病的诊疗提供新的策略和手段，提高人民群众健康生活质量。 （二） 技术 路线 本项目将针对炎症过程中细胞的识别、黏附、极性形成、迁移和效应等细胞间相互作用的不同步骤，分别有侧重的展开集中深入的研究，设置了相应的六个研究课题，包括： 1、炎症过程中细胞识别的信号转导机制； 2、炎症过程中细胞黏附的信号转导机制； 3、炎症过程中细胞极性形成的信 号转导机制； 4、炎症过程中细胞迁移的信号转导机制； 5、炎症过程中细胞效应的信号转导机制； 6、抗炎活性化合物筛选及优化。以下根据各个课题的具体情况分别进行介绍： 总体技术途径示意图 （ 三 ）可行性 1. 本研究项目的总体研究方案切实可行 从学术思路上看 ，本项目 以炎症中细胞间相互作用为主线，以细胞间发生相互作用基本过程中调控各个步骤的信号转导机制为对象，并在前述基础研究的引导下进行抗炎药物的研发 。 六个研究方向 彼此间 时空有序、 相互补充、有机结合 ，综合研究了炎症过程中细胞间相互作用的各个层面，密切合作、互为指导， 避免了单独某个方向或层面研究的局限性，为实质性推进炎症及其相关重大疾病的治疗奠定 了基础。 从技术途径上看 ，本项目是在已有工作基础 上的拓展和深入，研究内容是在各参与研究组工作基础上提出的具有原创性的内容，前期的工作都已取得了国际水平的进展，具有扎实的工作基础。相关的实验方案合理可行，实验方法成熟，必需的实验技术也已掌握，在技术上是完全可行的。各学术骨干均有独特的技术专长，涵盖生物化学、分子生物学、细胞生物学、免疫学、药学、有机化学和基础医学等学科，优势互补，便于联合攻关。六个具体研究课题的技术途径和路线清晰 明确，切实可行。 2. 本研究项目凝聚了优秀的研究团队 本项目有高级职称人员 26 名，其他研究技术人员 41 名，平均年龄约为 35岁。研究队伍包括 “国家杰出青年基金 ”获得者 5 名、中科院 “百人计划 ”入选者 8名。本项目凝聚的优秀研究团队，确保了本项目切实可行。 研究团队成员已经承担过多项本研究项目相关项目，其中包括国家重大科学研究计划（首席科学家 2名）、科技部 “973”项目（首席科学家 1名、课题负责人3名）、科技部 “863”项目、国家自然科学基金重点项目、国家杰出青年基金等，具有相关国家级重大 /重点项目顺利实施的 丰富经验。 3. 扎实的工作基础确保了本研究项目顺利实施 本研究团队在炎症领域基础研究和应用研究方面有非常扎实的研究基础，近5年 来，项目组成员已经作为 通讯作者 /第一作者 在 其子刊上发表论文 7 篇，影响因子大于 10 分的共有 14 篇，影响因子大于 5分的共有 49篇。此外还有大量药物化学和应用研究方面的成果。 4. 良好的工作条件和环境为本研究项目顺利完成提供了保障 本项目依托、承担和参加研究单位（中国科学院上海生命科学研究院、 南方医科大学、 中国人民解放军第二军医大学、中国人民解放 军第四军医大学等）都属于国内一流的科研院校，有很强的综合科研实力。并且大部分科研骨干都依托于多个国家级和省部级重点实验室，包括医学免疫学国家重点实验室、肿瘤生物学国家重点实验室、分子生物学国家重点实验室、生命有机化学国家重点实验室、中国科学院分子细胞生物学重点实验室、中国科学院再生生物学重点实验室、中国科学院营养与代谢重点实验室、再生医学教育部重点实验室和重大疾病的转录组与蛋白质组学教育部重点实验室。这些国内一流的科研院校及所依托的国家级和省部级重点实验室为本项目大开展提供了良好的工作环境和条件。 本项目依 托、承担和参加研究单位装备了开展 生物化学、分子生物学、细胞生物学、蛋白质组学、结构生物学、药学、有机化学、免疫学、基础和临床医学等学科 方面研究的仪器设备，如共聚焦显微镜、 实时荧光定量 、 谱 、 核磁共振仪、红外光谱仪、元素分析仪、 X衍射仪、旋光仪、气相色谱仪、毛细管电泳仪、计算机工作站、 流式细胞分析和分选仪、射电子显微镜、活细胞工作站、 因芯片平台、原子力显微镜、共聚焦显微镜、 实时荧光定量 、 器、 4800 射电子显微镜、活细胞工作站等先进的大型专业仪器设备。建立了成熟的实验方法，包括免疫荧光组织化学技术、激光共聚焦显微镜术、包埋前 /后免疫电镜技术、活细胞成像技术、流式细胞分析技术、分子原位杂交技术、酵母双杂交系统、免疫共沉淀技术、动物模型制备、蛋白质肽谱分析、全基因组扫描和连锁分析、转基因动物制备和基因敲除技术、实验动物平台等。这些条件都确保了本项目在仪器设备和技术方法的需求方面切实可行。 （四） 创新点与特色 本项目是在项目组成员已取得的扎实的炎症领域科研成果基础上， 以炎症中细胞间相互作用为主线，以细胞间发生相互作用基本过程中调控各个步骤的信号转导机制为对象，并在前述基础研究的引导下进行抗炎药物的研发，彼此间相互补充、有机结合，对炎症的发生发展展开集中深入的研究。 六个研究方向有机整合，综合研究了炎症过程中细胞间相互作用的各个层面，无疑将极大地加深我们对炎症及其相关重大疾病发生发展的分子调控机制的了解，从而有力推动相应的药物研发和临床诊疗。选取炎症反应中最基本的细胞间相互作用这一特征，对炎症及其相关重大疾病的发生发展进行重点突出、集中深入的研究，并且基础研究和应用研究紧密 结合、相互促进，这在学术思路上具有良好创新性和重要科学价值。同时，我们将从分子水平、细胞水平到动物模型等多个层面揭示各种信号分子在炎症发生发展过程中的关键作用，在理论上和技术上均有突出的创新性和特色。 理论创新： 对 国际前沿科学问题 的把握和提炼 保证了本项目的创新性 ，我们将针对 炎症细胞 及其所处环境 间相互作用 的信号网络和时空动态 调控规律 展开研究 。 我们将 从炎症因子与 I 型干扰素的差异性调节这一特殊的视角研究 号转导 机制，提出 “炎症和 I 型干扰素反应失衡促进炎症损伤 ”的理论观点，为炎症性疾病的治疗提供新思路。 我们 创新性地提出 识别 A、激活小胶质细胞及 理变化中的作用， 为 病理机制提供新的内容 ，为 选凝素活化整合素的信号通路是我们原创性的发现，将对其展开深入揭示。 我们拟开展的 急性期蛋白对选凝素黏附活性的详细调控机制更是从未见报 道。 我们将 从系统生物学的角度研究炎症过程中细胞迁移的信号调节机制 。 从调控关键转录因子、染色质结构、关键信号通路和方式等角度揭示炎症复合体、转录复合 物等生物大分子网络在炎症状态下对炎症信号转导的贡献及规律。 我们也将创新性地开展 组蛋白去甲基化酶与炎症效应的关系、 炎症因子基因表达和炎症复合体在炎症因子释放中的作用方面 的研究 。 技术创新： 多 种新的技术手段综合运用是本项目的一大特色。 将结构基因组的模式运用于少数重要的核心蛋白质及其复合物，进行集中式高通量的目标片断优化设计，从而高效快速的获取靶蛋白及其复合物的结构信息，以高分辨率结构信息为切入点，从分子水平上阐释炎症反应过程中细胞识别的内部机理。 建立了从基因蛋白水平、组织细胞水平以及动物模型水平的多 层次多手段的炎症相关细胞黏附行为研究系统，为相关研究的系统深入的开展打下了基础。 将传统的分子生物学、生物化学、细胞生物学、结构生物学与单分子纳米技术相结合，研究炎症反应中的细胞极性这一重大生物学问题。 本研究涉及组蛋白甲基化对染色质结构的影响、细胞内炎症复合体形成等研究，因此将充分利用分子细胞内活体 示 踪、荧光偏振能量转移等方法，争取在蛋白质 蛋白质 大分子复合物研究技术上有所创新。 同时，我们已拥有相当规模的小分子化合物库，对活性小分子的化学合成和结构改造也已有多年的研究经验积累 ，有望开发出新的 合成技术和获得新颖分子结构。 （五） 课题设置： 课题一 炎症过程中细胞识别的信号转导机制： 研究目标： 揭示 双特异性蛋白磷酸酶、 及自主发现的 号转导 的调节作用及其分子机制，解析相关重要蛋白质及其复合物的高分辨率晶体结构。明确 识别A、介导 A所致 部炎症反应中的作用及其分子机制，阐明去甲肾上腺素对小胶质细胞识别、吞噬和清除 A的影响及分子机制。 研究内容： 症细胞 因子、 趋化因子的产生，其 信号转导 对介导炎症反应的发生起关键作用。本课题将研究 双特异性蛋白磷酸酶 族转录因子以及 分子对 导的细胞识别 信号转导的调节作用。观察 症细胞 因子、 I 型干扰素、趋化因子表达以及 炎症细胞 趋化效应的影响，研究 子活化的调节作用及其分子间的相互作用，解析重要蛋白质分子及其复合物的高分辨率晶体结构，阐明其分子间的相互作用的结 构基础。 在 阿尔茨海默氏病（ 淀粉样蛋白（ A）通过激活小胶质细胞释放 炎性 介质而导致神经元死亡、突触功能障碍。小胶质细胞则可吞噬、降解 A。另外，蓝斑神经元变性导致其投射区域去甲肾上腺素（ 平的降低加重 课题拟 利用 胶质细胞 A受体 、介导 A所致 及 去甲肾上腺素对小胶质细胞识别、吞噬和清除 A的影响及其信号转导机制。为 理机制及治疗研究提供新的内容和 靶标。 承担单位： 中国人民解放军第二军医大学 课题负责人： 安华章 ，教授，中国人民解放军第二军医大学 主要学术骨干：周兆才 ，研究员，中国科学院上海生命科学研究院 乐颖影 ， 研究员，中国科学院上海生命科学研究院 经费比例： 16 课题二 炎症过程中细胞黏附的信号转导机制： 研究目标： 进一步揭示选凝素活化整合素的信号调控机制，确认此信号通路中酶、 酶、 关键分子的活性调节方式 。 阐明选凝素与急性期蛋白 相互作用机理，加深对细胞黏附分子通过信号转导 调节 炎症细胞 黏附行为的认识。 研究内容： 本课题将研究 研究急性期蛋白通过调节选凝素活性影响白细胞黏附的信号转导机制。 利用我们建立的涉及分子、细胞和动物模型等多层次的 炎症相关细胞黏附行为研究系统 ，研究 究 白细胞和血管内皮细胞之间相互作用的影响；利用 及 认此 整合素活性调节机制的生理作用。同时我们还将研究在 酪氨酸磷酸化的情况，及其随时间进程的变化，探讨 性如何受括白细胞中哪个 究在 用 活性突变体抑制 活性，研究 相互调节对此信号通路所起到的负反馈调节作用；在 及 认此负反馈调节机制的生理作用。 我们还将研究选凝素与急性期蛋白 用缺失突变和位点特异性突变等试验来寻找 合 表面等离子共振技术检测 用晶体结构分析研究 的关键结合位点；用 利用 症细胞 黏附实验中以及选凝素发挥关键作用的炎症等动物模型中，确认急性期蛋白通过调节选凝素活性影响 炎症细胞 黏附 活性 的生理作用。 承担单位： 中国科学院上海生命科学研究院 课题负责人： 耿建国 ，研究员，中国科学院上海生命科学研究院 主要学术骨干：杨雪松 ，教授，暨南大学 陈铭 ，副研究员，中国科学院上海生命科学研究院 经费比例： 25 课题三 炎症过程中细胞极性形成的信号转导机制： 研究目标： 揭 示炎症相关整合素及其配体在细胞极性形成中的作用及其对白细胞的黏附和迁移的影响；阐明整合素功能调控及其相关信号转导的机制；揭示细胞极性蛋白复合物 其结合蛋白移和炎症发生、发展中的功能及其信号调控机制 。 研究内容： 本课题将研究细胞极性在淋巴细胞激活、迁移和炎症发生发展中的功能及其信号调控机制，阐明黏附分子及其配体、重要细胞极性蛋白复合物及其结合蛋白的生物学功能和分子机理。 白细胞的滚动和稳定黏附与其在内皮细胞小静脉的定位、捕获和迁 移有关。4整合素既可以介导白细胞在其配体表面滚动，也可以介导白细胞的稳定黏附，这一特性是通过对其亲和性的动态调节实现的。而且，整合素对配体的亲和性与细胞的极性，迁移和信号转导相关。因此，研究 4 整合素亲和性动态调节机制和相关信号转导机制对于我们了解细胞极性与白细胞运动的关系是非常重要的。我们将研究：整合素亲和性动态调节的机制和结构基础；整合素亲和性动态调节对细胞极性与细胞迁移的影响；整合素介导的信号转导。 通过研究细胞极性蛋白复合物 讨细胞极性建立和维持与 T/B 淋巴细胞激活、 迁移和炎症发生之间的相互关系，希望阐明动对复杂系统中不同的细胞活动间相互关系的认识，了解细胞极性如何影响淋巴细胞功能及其在炎症中变化规律。具体内容包括： 细胞极性蛋白 淋巴 细胞极性形成机理研究； 巴 细胞功能的影响和信号调控机制； 合物及其结合蛋白对 淋巴 细胞迁移的影响和信号调控机制； 合物及其结合蛋白在炎症中的作用和机制研究。 我们将利用单分子力谱法，在纳米级空间尺度上标定黏附分子在白细胞表面的 分布以及活性。采用目前国际上常用的 细胞株作为样品， 胞将被转入 4 整合素，以及不同的趋化因子受体。利用原子力显微镜配合荧光显微镜成像的方法，我们将研究： 内信号转导引发的胞外整合素介导的黏附力变化并测量变化的动力学过程； 胞与人血管内皮细胞的黏附力以及在模拟炎症条件下的相互作用变化过程； 胞在受趋化信号吸引下做定向迁移时，其细胞前端和后缘的纳米级分辨率的形貌，黏附蛋白的分布以及活性 。 承担单位： 中国科学院上海生命科学研究院 课题负责人： 陈剑峰 ，研究员，中国科学院 上海生命科学研究院 主要学术骨干：陈正军 ，研究员，中国科学院上海生命科学研究院 张晓晖 ， 研究员，中国科学院上海生命科学研究院 经费比例： 16 课题四 炎症过程中细胞迁移的信号调控及其分子基础： 研究目标： 建立和完善研究细胞定向迁移的技术平台，发现一系列调控细胞迁移的新的信号分子，并系统地研究这些分子对细胞迁移的调控机制；结合原有研究基础，建立从胞外、胞膜到胞内调控细胞迁移的关键信号网络，发现调控 炎症细胞 定向迁移的新的信号途径，并鉴定若干新的抗炎药物作用靶位 。 研究内容： 本 课题 将 系统地研究炎症发生过程中调控细胞迁移的信号网络及其调控机制。拟以参与炎症发生过程中的各种白细胞和内皮细胞为靶细胞，结合已有研究基础，发展研究细胞迁移的新技术，建立高效、系统的细胞迁移研究技术平台；系统地研究细胞外信号分子、细胞膜表面受体群及细胞内信号分子网络对细胞迁移方向的决择及迁移速度的调控；基于多种筛选技术，寻找并鉴定正向或负向调控细胞迁移的细胞因子及化合物；以蛋白质组学为手段，鉴定白细胞迁移过程中的蛋白质修饰的调控机制，并鉴定调控细胞定向迁移关键信号蛋白复合体，研究调控白细胞迁移的各种信号通路间 的新的对话机制；并结合功能基因组学，运用大规模 选，寻找并鉴定调控白细胞定向迁移的新的调控分子及调控机制；结合细胞及模式动物技术，进一步研究这些新的调控分子对于炎症及相关疾病的影响。探索从胞外信号与膜蛋白 合启动的信号传递过程，通过研究磷脂代谢家族、小 G 蛋白家族到核转录因子的调控网络，系统深入的探索其与细胞迁移及炎症的关系。选择关键的分子靶位，筛选正向或负向调控细胞迁移的蛋白、短肽、寡糖或化合物，为控制 炎症细胞 迁移提供新的技术途径。 承担单位： 南方医科大学 课题负责人： 姜勇 ，教授，南方 医科大学 主要学术骨干：王平 ，教授，华东师范大学 经费比例： 16 课题五 炎症过程中细胞效应的信号转导机制： 研究目标： 系统研究在炎症过程中产生炎症放大和组织损伤效应的 炎症细胞 及其作用的靶细胞的信号转导规律，阐明这些细胞合成和释放炎症因子等效应分子的调控方式，认识细胞在 炎症环境 下参与控制表达效应分子的新的信号分子及作用机制，从炎症复合体、转录复合物等角度建立炎症状态下生物大分子相互作用的网络的理论模型，力争发现新的控制炎症的药物靶位。 研究内容： 本课题拟研究的主要 炎症细胞 为巨噬细胞，炎症效应的靶组织 则主要利用关节炎中的滑膜成纤维细胞为研究对象。在这些细胞探讨在基因转录水平控制巨噬细胞 促炎细胞因子基因表达和表达产物成熟及释放的信号分子及其转导机制；在成纤维细胞则重点观察 细胞外基质降解酶的基因表达控制信号通路以及影响这些分子翻译后加工及释放的信号机制。 在基因转录及转录后水平的研究中，将特别关注调控这些效应因子释放的组蛋白修饰编码、扩展对 等关键转录因子作用的认识、系统认识调节炎症因子释放的 体内容包括： （ 1） 发现和鉴定炎症效应相关的组蛋 白去甲基化酶（如 蛋白去甲基化酶），阐明它们在调控炎症效应因子（ 达中的作用，利用组蛋白去甲基化酶基因剔除小鼠研究组蛋白修饰与炎症效应的关系； （ 2） 观察 炎症细胞 及其他效应细胞在炎症应激信号作用下的转录因子含量及活性变化、 类和含量变化，分析这些变化对于炎症效应信号（ 影响； （ 3） 研究 炎症细胞 及相关细胞在 炎症环境 下细胞内信号与细胞外基质的相互作用，阐明细胞外基质成分（胶原、纤连蛋白、整合素等）在 炎症环境 下的变化及其对 细胞炎症效应的影响。 在炎症效应因子的翻译后调控信号方面则重点研究在促炎细胞因子或炎症复合体的形成及作用。系统而深入地研究炎症复合体在病原侵入和应激刺激中形成的信号转导机制，及信号网络异常引起各种疾病的分子机理。拟通过规模性地蛋白质相互作用筛选手段，寻找各种炎症复合体介导信号通路中新的蛋白分子，并研究其在信号网络中的功能和分子作用机制；同时研究信号转导关键分子 复合体的形成，动态变化规律，并阐明蛋白翻译后修饰在此过程中的作用及对 重大 疾病的诊治提供新策略和新靶点。 承担单位： 中国人民解放军第四军医大学 课题负责人： 药立波 ，教授，中国人民解放军第四军医大学 主要学术骨干：陈德桂 ，研究员，中国科学院上海生命科学研究院 钱友存 ，研究员， 中国科学院上海生命科学研究院 经费比例： 16 课题六 抗炎活性化合物筛选及优化： 研究目标： 针对本项目发现的与炎症相关的新通路或靶标， 建立快速可靠的活性化合物筛选模型 ，通过通量筛选、合理药物设计和结构优化相结合的方法获得高活性的化合物，并完成较全面的构效关系研究，获得具有显 著抗炎效果的候选药物化合物。并为进一步研究相关靶标在炎症过程中的作用提供小分子化合物研究工具和探针。 研究内容： 本课题将开展大量抗炎活性化合物的筛选及优化研究工作。针对本项目发现的有效的抗炎新通路或靶标，利用分子和细胞生物学等方法建立快速可靠的筛选模型，并进行通量筛选，寻找相应靶标的小分子抑制剂。对所获得的活性化合物进行结构优化，提高化合物对靶标的活性和选择性，同时改善化合物的理化性质等其它性质。我们还将利用 及免疫荧光分析、流式细胞 仪分析等手段进一步验证化合物对靶标的生物学作用和选择性等。此外，在了解药物靶标的三维结构的基础上，我们还将利用计算机辅助药物设计等技术合理设计和合成对应 相关 生物靶标的小分子调节剂。 在获得针对生物靶标具有较好活性和选择性的化合物后，我们一方面将利用动物模型研究这些化合物对炎症反应的抑制作用，评价并改善其药代动力学特性并提高化合物的安全性，以期以此为基础开发具有自主知识产权的新型抗炎药物。另一方面，我们也将根据 科学研究 的需要，对化合物进行生物素或荧光标记，为 进一步研究相关靶标及其信号通路提供有力的小分子研究工具和探针。 承担单位： 中国科学院上海有机化学研究所 课题负责人： 俞飚 ，研究员，中国科学院上海有机化学研究所 主要学术骨干：丁克 ，研究员，中国科学院广州生物医药与健康研究院 经费比例： 11 （六） 课题设置思路： 本项目拟 从 炎症细胞 及其所处环境 间相互作用 的信号网络和时空动态 调控规律这一关键科学问题出发，主要 以炎症中细胞间相互作用为主线，以 炎症细胞间发生相互作用基本过程中的 信号转导机制 为对象，并在前述基础研究的引导下进行抗炎药物的研发，彼此间相互补充、有机 结合，对炎症的发生发展展开集中深入的研究。 基于大量的文献回顾、长期的工作基础和储备的人才队伍，本项目拟设立 六个课题 ：课题一，炎症过程中细胞识别的信号转导机制；课题二，炎症过程中细胞黏附的信号转导机制；课题三，炎症过程中细胞极性形成的信号转导机制；课题四，炎症过程中细胞迁移的信号转导机制；课题五，炎症过程中细胞效应的信号转导机制；课题六，抗炎活性化合物筛选及优化。 各课题间的有机联系以及与项目预期目标的关系： 炎症反应的发生从本质上讲就是各种 炎症细胞 在致炎 /抗炎因子等作用下，通过不同的信号转导机制发生相互作用 的过程，包括了从 炎症细胞 识别 （ 课题一 ）炎症信号与其它细胞或胞外基质发生 黏附 （ 课题二 ），到 炎症细胞 形成 极性 （ 课题三 ）并响应炎症信号发生 迁移 （ 课题四 ），以及最终 炎症细胞 发挥生物学 效应（ 课题五 ）的整个过程， 既有明确的阶段和步骤，又是相互间密切联系和时空有序的完整事件。 治疗炎症性疾病是炎症领域基础研究的目的，通过对炎症的发生发展进行细致的分子调控机制研究，发现新的抗炎药物作用靶点，无疑将有力促进 抗炎药物研发 （ 课题六 ）。本项目包含的六个课题的设置相互间紧密相关，围绕着揭示炎症及其相关重大疾病中细胞间相互作用的信号转导 机制、促进抗炎药物研发等应用研究的项目预期目标，展开系统深入的研究，课题间相互关联、逐渐延续、密切合作、互为指导，组成一个完整的研究体系。 课题间有机联系 示意图 四、年度计划 年度 研究内容 预期目标 第 一 年 1. 研究包括 内的靶分子基因转染对原代培养的单核巨噬细胞 /树突状细胞 应的影响。 2. 在 白质及功能水平探讨激活脑小胶质细胞中的作用。 3. 利用分子和细胞水平的炎症细胞黏附实验系统，研究选凝素与急性期蛋 白 究 究不同白细胞间对同一活化信号的不同响应机制。 4. 研究炎症相关黏附分子在鸡胚早期发育中的时空表达模式，以此建立利用胚胎作为模式动物研究黏附分子的实验模型。 5. 研究整合素 47 的亲和性动态调控的机制。 6. 完善和系统化原子力显微和单细胞力谱技术，使之适用于探测迁移中的活体炎症细胞。 7. 建立血液细胞（ T/白质组学定量技术方法： 极性蛋白质复合物进行研究分析。 8. 以参与炎症发生过程中的各种白细胞和内皮细胞为靶细胞，结合已有研究基础，发展研究细胞迁移的新技术，建立高效、系统的细胞迁移研究技术平台。并建立相应的筛选技术包括功能基因组、白质组筛选。同时在此基础之上，建立小分子化合物的筛选平台。 9. 用 刺激和活化中性粒细胞，建立体外中性粒细胞黏附和迁移模型，结合抑制剂、基因共转染技术，分析2整合素等蛋白的细胞分布、动态变化及对中性粒细胞黏附和迁移的影响。 10. 探 讨 路信号分子，尤其是细胞骨架调整中的作用及其机制。 1. 发现新的对 应具有调节作用的 2. 明确 导的炎症及固有免疫反应中的调节作用。 3. 获得足够 量的高纯度目标蛋白质以用于体外生化实验以及结构分析。 4. 获得有效表达 细胞水平明确 所致脑部炎症反应的关键分子。 5. 揭示选凝素通过与 相互作用调控炎症细胞的黏附行为的分子机制，揭示示不同白细胞间对同一活化信号的不同响应机制。 6. 采用原位杂交和免疫组化技术进一步完善黏附分子 后探讨其它黏附分子。 7. 揭示整合素亲和性 动态调控对白细胞在炎症过程中的极性形成和运动的影响。 8. 开发出测量单个活体细胞表面分子分布和活性的纳米生物学方法。 9. 从分子水平上，确定极性蛋白 定重要的功能性结合蛋白、确定其细胞定位和与 T/ 10. 建立多样化的、系统研究白细胞、内皮细胞等定向迁移技术平台。 11. 建立并完善相应的筛选技术平台：包括相关功能基因家族的克隆、相关 定及相关表达系统的建立如逆转录病毒、慢病毒等系统、以及相关的蛋白质组学技术的 建立。 12. 建立中性粒细胞铺片培养，实时观测并记录细胞的黏附和延展实验模型，单层细胞划痕实验模型，体外 确 酶等与细胞骨架相关动态变化等相关蛋白在中性粒细胞黏附和迁移中的作用。 年度 研究内容 预期目标 11. 观察炎症细胞及其他效应细胞在炎症应激信号作用下的转录因子含量及活性变化、 类和含量变化，分析这些变化对于炎症效应信号的影响。 12. 构建核蛋白质基因克隆库 , 用免疫组化方法高通量筛选新的组蛋白去甲基化酶 , 并用高表达 标基因在细胞内鉴定组蛋白去甲基化酶的活性。 13. 研究 活前体白介素 1加工成熟通路的信号转导机制； 14. 通过酵母双杂交系统、免疫共沉淀和手段筛选炎症复合体中新的信号分子； 15. 针对目前已被验证过的抗炎药物新靶标（主要针对尚无药物上市的靶标）开发原创性的小分子调节剂作为新药候选物。如针对与机体免疫反应密切相关的关节炎（ 切相关的 发选择性小分子调节剂剂等。建设小分子化合物库。 13. 获得研究需要的部分小鼠品系。 14. 发现一些新的 15. 发现炎症信号作用下某些特定转录因子、 现新的组蛋白去甲基化酶候选基因；在阐明 1 成熟加工的分子机制方面筛选出炎症复合体中新的信号分子 。 16. 完成 进行活性评价和筛选。初步获得针对 17. 定向合成 200 个左右小分子化合物，充实小分子化合物库。 18. 在国际高水平学术杂志（ ）上发表 10篇以上论文，申请 2项以上相关专利，培养博士研究生 10人以上。 第 二 年 1. 合成并筛选 分子特异性干扰 究内源性 子基因敲减对原代培养的单核巨噬细胞、树突状细胞中 导的炎症细胞因子及 反应的影响。 2. 鉴定目标蛋白质及其复合物关键组分的生化特征。对目标蛋白质及体外重构的复合物并进行单晶培养。 3. 通过 在急性 A42所诱导脑部胶质细胞侵润和炎性细胞因子生成中的作用。 4. 利用生化实验和动物模型系统，研究机体调控选凝素与 互结合的分子机理；研究 5. 利用哮喘等模型，研究不同白细胞对同一活化信号有不同响应的生理意义。 6. 开发已知的常见黏附分子的基因干扰（ 同时，探讨其它黏附分子干涉的相应条件，设计构建 7. 研究整合素介导细胞双向跨膜信号的1. 明确内源性 分子在体外对 导的炎症及固有免疫反应中的作用。 2. 获得目标蛋白质及其复合物的翻译后修饰特征。通过体外分析，建立目标蛋白质复合物的动力学和热力学参数。获得初步晶体生长条件。 3. 在急性 物模型明确 4. 揭示机体通过调控选凝素与 互作用，影响炎症细胞的黏附行为的分子机制；揭示 示噬酸性粒细胞在哮喘中的行为调控机制。 5. 在明确目标黏附分子基因的基础上，建立稳定的 基因干扰的条件，为后续工作打下坚实的基础。 6. 阐明整合素相关的信号转导与白细胞极性形成以及运动的关系。 7. 揭示整合素的在白细胞迁移过程中的纳米级空间分布、极性化过程及活性的调控机制。 年度 研究内容 预期目标 机制及其生物学功能。 8. 利用整合素配体修饰的探针，用于探测上整合素的在白细胞迁移时的分布与活性。 9. 从细胞水平，建立单分子和高分辨率的免疫荧光技术，以及原子力显微镜等先进的成像技术。利用上述技术研究 10. 利用 术研究 白复合 物的缺失对 T/ 11. 从动物水平，开始着手制备 /或 组织特异性条件性基因敲除小鼠模型各种质粒，或引进相应的小鼠模型。 12. 以蛋白质组学为手段，鉴定白细胞迁移过程中的关键蛋白家族如 脂代谢相关蛋白修饰的调控机制。 13. 结合功能基因组学， 筛选技术，寻找并鉴定调控白细胞定向迁移的新的调控分子。 14. 结合酵母双杂交、蛋白质免疫共沉淀和质普分析技术，分析和鉴定在中性粒细胞黏附和迁移过程中与 2整合素相互作用的蛋白质，及相互作用的时空动态变化。 15. 构建 细胞条件性基因剔除自身免疫性疾病的小鼠模型。 16. 以细胞骨架相关蛋白为靶标，使用蛋白质免疫共沉淀、非变性凝胶电泳、质普分析等多种技术鉴定相关信号蛋白复合体。 17. 继续观察炎症细胞及其他效应细胞在炎症应激信号作用下的转录因子含量及活性变化、 类和含量变化，进一步分析这些变化对于炎症效应信号的影响。 18. 表达和纯化组蛋白去甲基化酶候选基因 , 用质谱和 方法在体外鉴定组蛋白去甲基化酶的活性 , 并鉴定组8. 在分子水平，进一步确定重要的功能性结合蛋白，及其细胞定位和与 T/ 9. 在细胞水平，确定极性蛋白 10. 预期将鉴定并发现 2调控在细胞定向迁移过程中起关键作用的信号分子的新机制包括新的修饰机制磷酸化、泛素化等、新的调控蛋白。 11. 通 过 选，得到 2直接参与细胞定向迁移的蛋白。 12. 在明确 2整合素在中性粒细胞黏附和迁移中作用的基础上，通过对相关复合物组分的动态分析，鉴定出与上述两种蛋白相互作用的蛋白及可能相互作用的环节，预期发现 1新的相互作用蛋白。 13. 获得 件性基因剔除自发性自身免疫性疾病的小鼠模型。 14. 鉴定出一些新的细胞骨架相关蛋白复合体，发现一些新的蛋白质作用关系。 15. 初步证实所发现的某些特定转录因子、 炎症相关细胞效应中的作用；证实所发现的组蛋白去甲基化 酶候选基因的活性；发现筛到新分子的部分功能；进一步阐明 1成熟加工的分子机制。 16. 利用不同模型完成对初筛到的对先导化合物进行结构优化；定向合成 200 个左右小分子化合物，充实小分子化合物库。 17. 在国际高水平学术杂志（ ）上发表 10篇以上论文，申请 2项以上相关专利，培养博士研究生 10人以上。 年度 研究内容 预期目标 蛋白去甲基化酶的催化机理。 19. 研究 1加工成熟通路的信号转导机制，并与 导白介素 1加工机制比较。 20. 通过 21. 获得应激反应基因 基因剔除小鼠，鉴定其一般表型变化。 22. 对与机体免疫反应密切相关的关节炎（ 切相关的 发选择性小分子调节剂剂等。建设小分子化合物库。 第 三 年 1. 观察 应中