【基金标书】2011CB504200-恶性肿瘤发生、发展的细胞表观遗传机制

项目名称： 恶性肿瘤发生、发展的细胞表观遗传机制 首席科学家： 尚永丰 北京大学 起止年限： 托部门： 教育部 二、预期目标 总体目标： 本项目 瞄准 表观遗传学 研究 的 前沿， 整合国内优秀 研究人员 ， 系统深入地开展恶性肿瘤发生发展及侵袭转移的表观遗传学研究。本项目的总体目标如下：阐明 表观遗传关键机制即 基化、 组蛋白修饰 和 非编码 基因表达调控的影响 ； 明确表观遗传调控在乳腺癌、肺癌发生发展及侵袭转移中的作用 ； 揭示 程中的表观遗传学变化及 细 胞重编程机制 ； 阐明细胞微环境在肿瘤转移中的作用及机制 ； 整合各种信息数据，描绘乳腺癌、肺癌 发生发展及侵袭转移的分子调控网络 。通过本项目的实施， 建立和完善表观遗传学研究的新 的 技术体系，实现我国在生命科学及医学研究领域的理论创新，为恶性肿瘤预警、诊断、治疗和药物筛选提供新思路、新途径和新靶标 ，发现几个潜在的可以用于乳腺癌、肺癌诊断的分子标志物及药物治疗的分子靶标， 并在本项目的实施过程中建立一支具有国际竞争力的研究团队 。 五年预期目标： 1、 发现一批新的组蛋白修饰因子 ， 探明 组蛋白修饰与 基化之间相互作用的分子机制， 筛选一批 肿瘤相关 定一批具有潜在临床应用价值的肿瘤诊断及治疗的新的 子靶标；鉴定一批新的 键调控因子 ； 发现针对转移型乳腺癌、肺癌的新的有效治疗靶点。 2、 建立一整套适应于恶性肿瘤表观遗传学研究的技术平台和技术体系。 3、 培养一批中青年学术带头人和 学术 骨干；培养研究生 （含硕、博） 50 名以上 、博士后 12 名以上 。 4、 在国际一流杂志（ 0）发表论文 8 篇以上，在有影响力的杂志（ ）上发表论文 25 篇以上。 三、研究方案 本项目分为 六 个课题，将全面系统地研究乳腺癌和肺癌发生发展及侵袭转移的表观 遗传 机制 ， 为 乳腺癌和肺癌的预防、诊断、治疗提供分子标志及 药物 靶标。前三 课题 分别从 基化、组蛋白修饰、非编码 个不同角度，分析肿瘤发生发展及侵袭转移中表观遗传学改变，研究其相互之间的 作用 关系及分子调控机理；第四 课题将 对肿瘤转移过程中非常重要的现象 即 上皮 间质转换的细胞重编程机制进行探讨；第五 课题 从肿瘤微环境的角度，探讨肿瘤微环境中基质细胞及细胞因子对肿瘤细胞生物学行为尤其是侵袭转移的影响；第六 课题 整合所有的信息，描绘乳腺癌和肺癌发生发展及侵袭转移的分子调控网络。 六个部分各有侧重，又紧密衔接，团结 合作，互相促进。 课题 一 ： 基化变化在恶性肿瘤发生发展及侵袭转移中的作用 本研究将筛选肿瘤细胞中高甲基化并失活的基因并分析其启动子区域组蛋白的修饰状况，探讨 基化与组蛋白修饰的先后关系。筛选出影响 合的关键性因子或蛋白；明确相关关键性因子 或 蛋白与 合蛋白作用的分子机制，进一步明确特定基因发生 基化的分子机制，进而揭示组蛋白修饰 与 基化 相互作用 的分子机制。另外在肿瘤组织， 白的正常组合关系被破坏，并且这种 白组合紊乱与肿 瘤相关基因失活之间可能存在因果关系。本研究还将以多种器官的正常组织和肿瘤组织为对象，了解正常组织细胞中 白的正常组合关系，研究这种正常组合关系破坏与肿瘤发生的关系及其 与 肿瘤相关基因组蛋白修饰、核小体定位和 基化发生的关系。表观遗传重编程不仅在体细胞去分化和获得多能 “干性 ”方面发挥关键性作用， 也是细胞癌变过程中获得无限增殖和侵袭/转移能力的物质基础。本研究将在开展肿瘤转移相关 基化组学研究的基础上，筛选并鉴定出影响肿瘤细胞转移能力的关键性 基化变化位点及其网络，了解其在癌细胞获得转移能 力重编程过程中作用，建立预测恶性肿瘤转移能力的表观遗传分子分型体系。总体研究方案 如下 ： 课题 负责人： 朱卫国，北京大学 学术骨干： 邓大君，北京大学 伍会健， 大连理工大学生命科学与技术学院 课题二： 组蛋白修饰异常在恶性肿瘤发生发展及侵袭转移中的作用 本课题将常规方法和高通量技术相结合，从筛选乳腺癌和肺癌中新的组蛋白修饰调控因子及其复合物出发，逐步揭示所获得的候选基因对于组蛋白修饰的作用和调控机理，并进一步阐明这些基因在调控肿瘤发生发展及侵袭转移中的作 用及其机制。将以功能基因组学和蛋白质组学的方法筛选乳腺癌和肺癌中发生突变或者表达异常的组蛋白修饰酶以及转录因子，同时针对 相关的甲基化酶复合物组分， 去甲基化酶 、 磷酸化酶和磷酸化激酶、转录因子 其转录辅助因子等，筛选新的组蛋白修饰基因或 用各种蛋白质间相互作用方法验证筛选获得的组蛋白修饰复合物中各成员间的相互作用。利用基因过量表达和敲低 /敲除技术、基因突变技术、组蛋白甲基化、磷酸化和乙酰化分析、 技术检测分离的组蛋白修饰因子对组蛋白修饰和基 因表达的影响及其在基因表达调控中的分子机制。在此基础上，利用动物模型和临床标本对组蛋白修饰候选因子在肿瘤发生发展及侵袭转移中的作用做深入分析。总体研究方案 如下 ： 肿瘤 代表性肿瘤及非瘤组织标本收集 500例 肿瘤 基因功能分析生物信息学分析 确定肿瘤发生 /转移 /侵袭相关的甲基化网络 验证研究：大样本患者随访、 模式动物 建立肿瘤转移能力的 式 分析肿瘤细胞中异常甲基化的启动子区域组蛋白修饰的状况选影响 及组蛋白修饰的关键蛋白 探 讨关键蛋白活性和 自身修饰的变化 明晰特异基因发生 的分子机制和组蛋白修饰调控探明关键蛋白与 合蛋白相互作用的分子机制 课题 负责人 ： 叶棋浓，军事医学科学院生物工程研究所 学术骨干： 杨晓，军事医学科学院生物工程研究所 课题三： 非编码 恶性肿瘤发生发展及侵袭转移中的作用 研究 用机制的一个关键就是鉴定与之相互作用的靶分子，特别是蛋白分子。本课题将以乳腺癌细胞系、肿瘤组织、肿瘤启动细胞为模型，利用自主建立的 术平台系统地发现和鉴定与肿瘤相关蛋白（特别是其中的转录因子和表观修饰酶）发生相互作用的 将采用不同大小的 库（ NA 定肿瘤启动细胞特异的用球囊形成实验、二维平皿及三维 养 以及 免疫缺陷鼠体内种植和肿瘤组 织等研究体系，系统深入地研究 蛋白间的相互作用、它们所构成的 结构网络、 调控网络、以及这些相互作用的生理功能，剖析 此同时，选择其中一些有重要功能的 结合大量的肿瘤患者的标本及临床资料， 研究将其作为药靶或生物标记物的可能性。 组蛋白修饰异常机制与肿瘤发生发展 筛选新的组蛋白修饰复合物 /因子 甲基化酶、磷酸酶、 录因子等 相互作用 分析 组蛋白修饰 分析 靶基因表达 分析 建立肿瘤发生 发展 侵袭转移相关的组蛋白 修饰网络 高通量芯片、酵母双杂交、 免疫沉淀 课题 负责人： 宋旭，四川大学 学术骨干： 宋尔卫，中山大学 李沁桐，四川大学 课题四：上皮间质转换的机理及 恶性肿瘤 侵袭转移的 细胞重编程机制 以乳腺癌细胞系、肿瘤组织及癌旁正常组织为模型，探讨 细胞重编程作用机理及其在乳腺癌转移及化疗药物耐受中的作用。选取永生化的正常乳腺细胞系（如 性低转移性细胞系（如 ）， ），以及 性但对三苯氧胺耐药的 胞等为主要细胞模型，并通过 导的 制或过表达 这些细胞系中分别诱导或抑制 型。比较不同细胞系在 后其基因表达谱变化，用 比较基因组范围内 基化变化情况，并用 比较与转录相关的主要的组蛋白修饰标志如激活性的 组蛋白乙酰化、 基化，抑制性的 基化等在全基因组范围内的分布变化规律。在此基础上，对差异表达的新基因及特异性组蛋白修饰酶在 及在乳腺癌转移及药物耐受中的作用做深入分析。同时，选取两种以上高转移性细胞系，以 激细胞 或 稳定转染别激活 以及 号通路诱导 基因表达谱、蛋白质谱及全蛋白磷酸化谱分析在三种条件下共同变化的靶基因及蛋白分子。这些共同通路分子是各信号通路间的交互作用节点及潜在的 键调控因子，非 编码 肿瘤发生发展研究 肿瘤相关 蛋白结合的 研究 阐明 术平台鉴定与肿瘤相关蛋白结合的NA 定肿瘤启动细胞特异 讨 利用体外培养、免疫缺陷小鼠肿瘤移植、肿瘤病理组织检测等进行功能研究 对它们的作用机理进行进一步细胞及分子水平上的分析。建立可诱导表达荧光 标记的 其它 导因子的稳定转染细胞系，以在细胞及分子水平上实时观察细胞内外环境的改变对 细胞转移能力的影响。 总体研究方案如下： 课题 负责人： 尚永丰，北京大学医学部 学术骨干： 梁静，北京大学医学部 张华， 中国航天员科研训练中心 课题五：细胞微环境与肿瘤的发生发展及侵袭转移 以乳腺癌为模型，分别从肿瘤细胞微环境中的肿瘤相关成纤维细胞、浸润的免疫细胞（肿瘤相关性巨噬细胞）和基质分 子（细胞因子 手，研究肿瘤微环境对肿瘤细胞生物学行为尤其 是 侵袭转移的影响。分离乳腺 良性增生患者及各种不同类型不同分期的乳腺癌 患者 组织微环境中的成纤维细胞及肿瘤相关性巨噬细胞，分析 表达谱；研究这些差异表达的基因或成纤维细胞及肿瘤细胞侵袭转移能力的影响； 建立 三维细胞培养 模型 ，将肿瘤细胞与基质细胞共培养，尽量模拟体内环境，并应用免疫分子及免疫细胞缺陷小鼠构建小鼠骨髓嵌合体动物模型，研究这些差异表达的基因或 上皮间质转换的机理 及表观遗传机制 建立低转移性、高转移性乳腺癌细胞系及人工改变 寻找 高转移性乳腺癌及对现有化疗药物不敏感性的乳腺癌的治疗靶点 基因表达谱差异 差异表达基因总体特征分析 新基因功能分析及特异性组蛋白修饰酶在功能域分析； 质谱检测并验证相互作用蛋白；靶基因检测；与已知 病毒介导的稳定过表达及 胞表型及小鼠乳腺癌转移模型的行为变化 以 激细胞 或 稳定转染 白质谱差异 磷酸化修饰蛋白质组学差异 共培养后肿瘤细胞侵袭转移能力的影响；采用基因工程小鼠模 型， 从分子、细胞、动物三个层面研究 号通路在肿瘤微环境中与 白酶体激活因子、重要肿瘤因子动态相互作用 及其动态调控的分子机制。在解析这些调控机制的生理病理意义的基础上，通过肿瘤模型研究进一步 阐 明 肿瘤微环境中重要 生物学因子对 肿瘤发生发展的决定性作用 。 具体方案如下： 课题 负责人： 刘芝华，中国医学科学院肿瘤研究所 学术骨干： 李晓涛，华东师范大学生命科学研究所 曲春枫，中国医学科学院肿瘤研究所 课题六：恶性肿瘤发生发展及侵袭转移的分子调控网络 利用肿瘤基因表达和表观遗传学数据，采用 计算生物学方法推测在恶性肿瘤、干细胞中发生变化的表观遗传学调控网络。为了更深入地研究肿瘤发生发展过程的分子调控网络，还需要从以下几个方面进一步发展基于贝叶斯网络的因果推断方法。 （ 1） 考虑到实验方法与手段的多样性，需要开发能够自动整合并利用多个异质实验数据的因果推断方法。这部分工作涉及去除反映单个数据源自身特征的背景信号，子网络的拼接与集成，观测型实验数据与 (基因敲除、 默等 )干预型实验数据的因果信息集成等多个问题 ；（ 2） 通过开发根据数据特征自适应地调整网络正则化参数的学习算法等方式，以解决如何在具有较 高噪声和不正常乳腺组织及不同类型的乳腺癌组织 建立基质细胞与肿瘤细胞的三维细胞培养模型 明确基质细胞的基因 /肿瘤相关成纤维细胞原代培养 号通路 /蛋白酶体 动物水平 等位基因表达小鼠模型 阐明 蛋白酶体与 细胞微环境与肿瘤发生发展及侵袭转移 基质细胞、细胞因子在肿瘤发生发展中的作用 分子、细胞水平 基因 /基因敲除 建立肿瘤与细胞微环境网络体系 肿瘤相关性巨噬细胞 免疫缺陷 小鼠骨髓嵌合体动物模型构建 精确性的系统生物学实验数据中进行可靠因果推断的实际问题。对于大规模因果推断问题，使用现有的贝叶斯因果推断方法，还面临有限的数据资源与急剧增大的网络搜索空间的矛盾。为了保证学习结果的鲁棒性，我们拟开发一系列能保持因果关系的特征选择方法来解决这个问题。 （ 3） 不同系统生物学因素之间的上下游作用关系可能会随肿瘤发生与发展的过程而动态地发生变化，为此我们拟开发能够正确推断这种动态关系的贝叶斯网络学习算法。因为肿瘤细胞有很多具有干细胞特性，且目前所掌握的胚胎干细胞数据比肿瘤数据更丰富也更系统 ,我们将在恶性肿瘤 与干细胞中分别预测基因表达与表观调控网络 ， 并进一步比较其异同。通过干扰预测的上游调控节点后以 术对下游节点进行检测，对以上预测模型中的关键调控关系进行验证。为了通过实验验证贝叶斯网络模型推测出来的因果关系，我们将把它们作为遗传学的上下游关系处理。这样 就可以人为 地 提高或降低上游事件的水平，例如，转录因子结合或者其他组蛋白修饰水平，而后观察下游事件，如基因表达，或者组蛋白或 饰的水平的变化，来证实我们所预测的因果关系。以组蛋白甲基化修饰作用为例，甲基化转移酶和去甲基化酶是 可用于干扰网络中的特定节点。譬如我们要证实制基因表达这一关系，我们可以通过抑制正常细胞或者癌细胞的组蛋白甲基化转移酶或者去甲基化酶来调节 平，从而观察下游基因表达水平的变化（图 2）。实际上，一些已报道的因果关系正是利用上述方法和遗传突变在模式生物或细胞实验中发现的。验证转录因子对某种组蛋白修饰的作用可以通过过表达或者 录因子来直接观察到。我们将通过过表达或者别上调或者下调转录因子，然后利用 术检测一些已知的修饰位点或者利用 术在全基因水平检测转录因子对全基因组范围内组蛋白修饰的影响。 图 2： 如何通过干扰上游调控节点并以 术 检测下游基因验证预测模型中的关键调控关系 具体方案 如下： 课题 负责人：韩敬东，中国科学院遗传与发育生物学研究所 学术骨干： 吴 旻 ，武汉大学生命科学学院 染色质与组蛋白的多种表观遗传学修饰 关键转录因子与基因的调控关系 转录因子的 基因表达谱差异分析 染色质构型分析 表观遗传因子 绝缘子的基因组分布 表观遗传因子的基因组分布 转录因子的目标基因分布 染色质空间形态与 蛋白修饰的因果调控网络 关键转录因子与目标基因的调控网络 多 因 素 定肿瘤发病相关的重要基因突变相互关系 恶性肿瘤发病因素预测的因果网络模型 证肿瘤发病相关转录因子与基因的影响范围 恶性肿瘤高通量数据的整合与网络的计算预测 四、年度计划 研究内容 预期目标 第 一 年 1） 多种手段研究肺癌细胞肿瘤抑制基因甲基化状况，开展肿瘤转移相关 基化标志物研究；开展 白表达变异与肿瘤抑制基因表观遗传失活关系研究； 2） 利用高通量芯片、 母双杂交、免疫沉淀结合质谱等技术，针对 转录因子 其转录辅助因子，筛选新的组蛋白修饰基因或 3） 利用 技术平台系统筛选鉴定与肿瘤相关蛋白相互作用的 测 表达谱； 4） 诱导或抑制 型。比较不同细胞系在 后其基因表达谱变化， 用 比较基因组范围内 基化变化情况，并用 比较与转录相关的主要的组蛋白修饰标志如激活性的组蛋白乙酰化、 基化，抑制性的 5） 分离乳腺良性增生患者及乳腺癌患者 微环境中的成纤维细胞 、 浸润巨噬细胞 、 浸润的单核巨噬细胞 ，分析 究不同类型的乳腺癌以及不同侵袭转移能力的乳腺癌中上皮细胞与间质细胞的表达谱差异 ； 6） 开发能够自动整合并利用多个异质实验数据的因果推断方法。 包括 去除反映单个数据源自身特征的背景信号，子网络的拼接与集成，观测型实验数据与 (基 因敲1） 找出有代表性的肿瘤抑制基因，分析甲基化谱，筛选出一组肿瘤转移相关 基化标志物；掌握肿瘤组织中多种 白表达变异规律； 2） 获得新的组蛋白修饰组分； 3） 筛选出一批肿瘤相关的 确定 相关蛋白的表达谱； 4） 优化 型诱导条件，完成基因表达谱及 5） 发现与肿瘤发生发展和转移相关的不同 间质细胞的表型特征，以及一些重要的免疫相关蛋白、间质细胞中 6） 建立 能够自动整合并利用多个异质实验数据 ，适用于大规模高噪声的组学数据 的因果推断方法 ，并开发为计算软件 。 研究内容 预期目标 除、 默等 )干预型实验数据的因果信息集成等多个问题。 第 二 年 1） 分析围绕甲基化基因启动子周围的组蛋白修饰状况，开展核小体在 基化扩展过程中的作用研究；开展肿瘤转移相关甲基化标志物多中心验证研究； 2） 利用免疫共沉淀、 胞内共定位等蛋白质间相互作用技术验证筛选获得的组蛋白修饰复合物中各成员间的相互作用，定位相互作用的结构域 /区域。 3） 研究筛选到的 蛋白质、 生物大分子的相互作用； 4） 对克隆得到的 新的潜在 控因子用分子生物学及细胞生物学的手段进行功能分析 ； 5） 通过基因过表达或敲降的方法，研究 差异表达的基因或 成纤维细胞 、巨噬细胞 及肿瘤细胞的生物学行为的影响，尤其是肿瘤细胞侵袭转移能力的影响； 1） 探明组蛋白修饰与甲基化 间的关联性，证明核小体在 2） 明确组蛋白修饰复合物中各成员间的相互作用及其相互作用方式 ； 3） 初步确定 作用靶点，特别是与蛋白的相互作用； 4） 发现一些 新的潜在 控因子； 5） 发现 几个间质 细胞 来源的 与肿瘤发生发展和转移 密切 相关的 新的分子 ； 6） 建立 能够自动 进行 因果关系的特征选择方法 ，并开发为计算软件 。探索 推断肿瘤发生与发展动态关系 的方法 ； 7） 发表 5F5的研究论文 ,1F10 的研究论文。申请专利1。 研究内容 预期目标 6） 对于大规模因果推断问题，使用现有的贝叶斯因果推断方法，还面临有限的数据资源与急剧增大的网络搜索空间的矛盾。为了保证学习结果的鲁棒性，我们拟开发一系列能保持因果关系的特征选择方法来解决这个问题。 第 三 年 1） 研究影响 出连接甲基化与组蛋白的蛋白。在不同病变人体组织中肿瘤 转移相关基因 基化形成、扩展和维持规律研究； 2） 利用基因过量表达和敲低 /敲除技术、组蛋白修饰等分析技术检测组蛋白修饰因子对组蛋白修饰的影响及不同修饰间的相互影响。检测组蛋白修饰候选因子对 激素信号通路等相关的下游靶基因表达的影响。确定组蛋 白修饰复合物中各成员间物理上的相互作用与功能上的相互作用的关系； 3） 研究 以及 关的信号调控通路； 4） 对克隆得到的 新的潜在 5） 发展三维细胞培养 模式，将肿瘤细胞与基质细胞共培养，尽量模拟体1） 初步论证连接 系得到一组能够准确预测肿瘤转移能力的基化标志物； 2） 明确组蛋白修饰候选因子对组蛋白修饰和基因表达的影响 ； 3） 发现肿瘤相关蛋白与 4） 建立单核巨噬细胞特定基因敲除或过表达的小鼠乳腺癌模型 ； 5） 发现 恶性肿瘤与干细胞中分别预测基因表达与表观调控网络 ,的 异同 ； 6） 发表 5 的研究论文 ,1F10的研究论文。申请专利 1 研究内容 预期目标 内环境，研究这些差异表达的基因或 探讨改变细胞微环境 对肿瘤侵袭转移的影响； 6） 在恶性肿瘤与干细胞中分别预测基因表达与表观调控网络 ,并进一步比较其异同。进一步通过自动文献检索来检验网络的准确性。 第 四 年 1） 研究 基化与组蛋白修饰的先后及其相互影响的机制，开展肿瘤转移相关甲基化标志物生物学功能基础研究； 2） 以过量表达、 扰和染色体免疫沉淀等技术手段增加或者降低组蛋白修饰候选因子在细胞内的含量，检测候选因子对组 蛋白修饰复合物中各成分的转录和蛋白质稳定性的影响、对组蛋白修饰酶在靶基因序列上募集的影响和对组蛋白修饰酶活性的影响； 3） 利用细胞模型和裸鼠动物模型系统研究 肿瘤发生发展中的作用 ； 4） 继续进行 关新基因功能分析，并根据分子生物学的研究成果，建立必要的动物模型，研究新的 控分子过表达或基因敲除后对乳腺癌转移的影响 ； 5） 利用小鼠骨髓嵌合体和乳腺癌动物模型，研究肿瘤相关 间质 细胞对肿瘤细胞的发展与转移能力的影响 。 继续研究 化学致癌剂 在肿瘤易发及对照小鼠中诱导特定的癌症模型并研究其病理生理特征以及相关分子 机制 。 原位 瘤异种移植模型的肿瘤转移机制1） 确定影响 基化与组蛋白修饰的蛋白作用机制，确定 基化标志物影响肿瘤转移相关的机制； 2） 确定组蛋白修饰候选因子在基因表达调控中的分子机制； 3） 发现肿瘤相关蛋白与 的相互作用在细胞生长、分化、肿瘤发生发展及侵袭转移中的作用； 4） 原位 瘤异种移植模型的肿瘤转移机制研究取得重大进展 ； 5） 验证并估算得到贝叶斯 网络的预测准确性 ； 6） 发表 5F5的研究论文 ,1F10 的研究论文。申请专利1。 研究内容 预期目标 研究 ； 6） 通过干扰预测的上游调控节点后以 术对下游节点进行检测，对贝叶斯网络模型推测出 的 关键调控关系进行验证。 第 五 年 1） 探讨表观遗传调控的新机制，建立测定肿瘤转移能力的 基化分型；进行 基化标志物诊断试剂盒开发 ； 2） 利用基因过量表达和敲低 /敲除技术，在体外细胞水平和体内小鼠肿瘤模型中检测筛选到的候选分子对肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭、转移以及 影响，检测候选分子对细胞恶性转化的能力。利用小鼠基因敲除模型，检测组蛋白修饰因子及其调节的靶分子在体内组织水平上的改变模式，利用免疫组织化学等技术检测某些 候选分子及相应的组蛋白修饰在肿瘤发生发展及侵袭转移中的临床意义 ； 3） 系统深入地研究 蛋白间的相互作用、它们所构成的结构网络、调控网络、以及这些相互作用的生理功能，剖析 控网络在肿瘤发生发展进程中的作用与意义 ； 4） 继续进行功能分析实验，并在乳腺癌肿瘤病人标本中验证研究所得的 键分子与肿瘤治疗反应及预后的关系，筛选有诊断意义的分子标志 ； 1） 开发出 1预测肿瘤转移能力的 基化标志物诊断试剂盒； 2） 确定组蛋白修饰候选因子在肿瘤发生发展及侵袭转移中的作用； 3） 提出 用机制的新假说，探讨在细胞中是否存在一个通过肿瘤诊断与治疗提供新的理论基础和子靶标； 4） 筛选出 1对乳腺癌治疗及预后具有诊断意义的分子标 志； 5） 阐述在肿瘤微环境中， 间质细胞及分子 对肿瘤发生发展及侵袭转移影响及作用的分子机制，从间质细胞角度寻找阻断肿瘤侵袭 转移的靶分子； 6） 进一步验证并估算贝叶斯网络的预 测 准 确 性 。 并 基 于 新 的据得到改进的贝叶斯网络模型。 7） 发表 5F5的研究论文 ,1F10 的研究论文 ,申请专利1。 研究内容 预期目标 5） 通过体内外实验，阐明在肿瘤微环境中，促进单核细胞浸润和分化发育成为不同类型巨噬细胞的调控因素，及不同微环境下不同的巨噬细胞亚群影响乳腺细胞以及乳腺肿瘤细胞 增殖和行为特征机制 ； 6） 利用 并在加入新的 一、研究内容 主要研究内容 1、 表观遗传重编程不仅在体细胞去分化和获得多能 “干性 ”方面发挥关键性作用， 也是细胞癌变过程中获得无限增殖和侵袭 /转移能力的物质基础。 本项目拟在开展转移相关 基化组 学研究的基础上，筛选并鉴定出影响乳腺癌细胞转移能力的关键性 基化变化位点及其网络，了解其在乳腺癌细胞获得转移能力重编程过程中作用，建立预测乳腺癌等恶性肿瘤转移能力的表观遗传分子分型体系。 以 肿瘤高甲基化基因 1（ 目标 ，以 组蛋白去乙酰化酶 对象 ，探讨 为组蛋白去乙酰化酶对组蛋白修饰及其对 基化酶和 合蛋白相关因子的作用，筛选影响基化酶和 合蛋白的关键性因子；明确相关关键性因子与 合蛋白作用的分子机制，进一步阐明 因发生 而揭示 组蛋白修饰和 基化的相互作用关系 。探讨逆转 基化在肿瘤治疗中的临床应用价值， 在明确 “肿瘤组织 基因表达变异 关系的基础上， 确定 乳腺癌和肺癌转移能力的关键性 基化变异位点及其网络， 建立肿瘤转移能力的 基化分型体系，并结合大样本肿瘤患者随访以及模式动物进行验证研究。 2、 探讨组蛋白修饰如何影响基因的转录及这种调控形式如何影响恶性肿瘤发生发展及侵袭转移。包括 新的 组蛋白修饰复合物的发现和作用机制 的探讨；研究 不同组蛋白修饰之间 的相互影响，特定的组蛋白修饰与特定的基因转录激活或抑制的关系，组蛋白修饰和转录因子 /转录辅助因子的组装，组蛋白修饰复合物的调控，组蛋白修饰在肿瘤发生发展及侵袭转移中的作用和机制 ；筛选 组蛋白修饰复合物成分，包括 相关的甲基化酶复合物成分、组蛋白磷酸化酶、 雌激素信号途径相关的组蛋白修饰因子等；验证组蛋白修饰复合物中各成员间的相互作用； 检测分离的 组蛋白修饰因子对组蛋白修饰的影响及不同修饰间的相互影响； 检测 组蛋白修饰因子对靶基因的选择性和表达的 影响，以及组蛋白修饰对 转录因子募集到靶 基因启动子上的作用；在细胞水平和小鼠肿瘤模型中检测筛选到的候选分子在乳腺癌、肺癌等肿瘤发生发展及侵袭转移中的作用和机制；收集大量临床标本，结合病理及预后等资料，检测几个候选分子及相应的组蛋白修饰在乳腺癌、肺癌等肿瘤发生发展及侵袭转移中的临床意义。 3、 利用课题组前期工作中建立的筛选与目标蛋白相互作用的 技术平台（ 从肿瘤细胞系和肿瘤组织中筛选鉴定与肿瘤相关蛋白相互作用的 究 态时空关系以及功能调控网络 ； 阐明 表观 遗传修饰和转录水平上对基因转录的调控作用，深入探讨它们在肿瘤发生发展及侵袭转移中的意义；利用生物信息学和实验 相结合的方法鉴定以 轴心，与之相互作用的蛋白质、 现 的作用机制 ，探讨在细胞中是否存在一个通过 在发现和鉴定的肿瘤特异性 其相关蛋白的基础上，用肿瘤启动细胞模型、肿瘤转移模型（包括肿瘤细胞 型） 以及临床标本， 深入探索具有临床意义的 其相关蛋白在肿瘤发生发展中的作用。 4、 寻找新的 控 因子以 及新的 关调控通路，研究建立和维持 号通路之间的交互作用：一般来说， 性的乳腺癌细胞（如 移性弱，而 性的乳腺癌细胞（如 胞）转移性强。癌细胞 达阳性也是其对三苯氧胺等雌激素拮抗疗法有反应性的前提条件。但三苯氧胺对部分 性的乳腺癌细胞治疗效果较差。选取正常乳腺癌细胞、乳腺癌低转移性、高转移性、耐药性的代表细胞系进行表达谱分析，检测它们是否具有 关基因的表达差异。其中差异表达的除已知 因外，未知功能的基因表达产物根据其功能域及蛋白质 组学分析（如质谱检测其相互作用蛋白等方法）可研究其是否为新的 关转录因子。基因表达谱差异分析可同样应用于以 低转移性细胞用制 进其 高转移性细胞引入 达后与原有细胞的对比研究中。已发现多种信号通路都与 关。拟选取目前研究较为充分的 路，以及 通路为代表，分别给予乳腺癌细胞相关信号分子刺激诱导 后进行基因表达谱、通路特异性蛋白质谱以及高通量的细胞内磷酸化修饰改变等分析，找到这些通路在 如何扮演关键角色。 建立可诱导表达荧光标记的 其它 导因子的稳定转染细胞系，以在细胞及分子水平上实时观察细胞内外环境的改变对 时，研究这些分子及相关的通路与乳腺癌病人的转移、疗效、预后及药物敏感性的关系，探讨其临床应用价值。 5、 程中 基化水平和组蛋白修饰在全基因组范围内的改变及 特异的组蛋白修饰酶如何参与调控 已分化上皮细胞进行基因表达重编程的生物学行为，势必有 基化及多种影响基因转录的组蛋白 修饰在全基因组范围内重新分布。利用 测细胞在发生 在全基因组范围内的 基化变化规律。同时， 针对 特异性组蛋白化学修饰 如转录激活性的组蛋白乙酰化、 基化，转录抑制性的 3基化等， 利用其特异性 抗体进行 析，检测细胞发生 的组蛋白化学修饰变化规律。从以上两方面的研究出发，进而对潜在 键基因进行详细的生物学功能研究。特异的组蛋白修饰酶可能在 控中扮演关键角色。组蛋白 甲基化酶 乳腺癌中显著高表达，并 与远处转移及较差预后密切相关，提示其在 亦可能扮演关键角色。 相关 课题组之前 发现 组蛋白 甲基化酶 号通路及乳腺癌转移中 起 重要作用 。 课题将进一步以 究对象 ，通过基因组 学 及质谱分析 ， 研究它们 和 已知的 关的 转录因子 之间的 相互关