血管紧张素ⅱ对高糖诱导nrk-52e细胞转分化作用研究

精品文档2016全新精品资料全新公文范文全程指导写作独家原创1/9血管紧张素对高糖诱导NRK52E细胞转分化作用研究【摘要】目的探讨血管紧张素ANG对高糖诱导大鼠肾小管导管上皮细胞株NRK52E转分化的干预作用。方法细胞培养72H后，WESTERNBLOT检测对照组0MMOL/L葡萄糖、高糖组25MMOL/L葡萄糖、血管紧张素干预组10NMOL/LANG、高糖血管紧张素干预组10NMOL/LANG25MMOL/L葡萄糖中转化生长因子1TGF1、型胶原、金属蛋白酶2MMP2、平滑肌肌动蛋白SMA以及甲状旁腺素相关肽PTHRP在NRK52E细胞中的表达。活性氧ROS含量应用CM2H2DCFDA试剂盒检测。结果高浓度葡萄糖上调TGF1、型胶原、MMP2、SMA以及PTHRP表达。ANG明显上调高浓度葡萄糖状态下TGF1、型胶原、MMP2、SMA和PTHRP的表达，并提高ROS含量。结论ANG可以促进高浓度葡萄糖诱导肾小管导管上皮细胞转分化。【关键词】血管紧张素葡萄糖NRK52E细胞转分化ABSTRACTOBJECTIVETOINVESTIGATETHEEFFECTWITHANGIOTENSININTERVENTIONONHYPERGLYCEMIAINDUCEDTRANSDIFFERENTIATIONINTHEEPITHELIOIDCLONEOFMIXEDCULTUREOFNORMALRATKIDNEYNRK精品文档2016全新精品资料全新公文范文全程指导写作独家原创2/952ECELLSMETHODS72HOURSAFTERINTERVENTION,THEEXPRESSIONOFTRANSFORMINGGROWTHFACTOR1TGF1,TYPECOLLAGEN,MATRIXMETALLOPEPTIDASE2MMP2,SMOOTHMUSCLEACTINSMAANDPARATHYROIDHORMONERELATEDPROTEINPTHRPINNRK52ECELLSWASDETECTEDWITHWESTERNBLOTINTHECONTROLGROUP0MMOL/LGLUCOSE,HIGHGLUCOSEGROUP25MMOL/LGLUCOSE,ANGIOTENSIN10NMOL/LANGIOTENSINGROUPANDANGIOTENSINPLUSHIGHGLUCOSE10NMOL/LANGIOTENSIN25MMOL/LGLUCOSEGROUP,RESPECTIVELYANDTHELEVELSOFREACTIVEOXYGENSPECIESROSWEREDETECTEDBYKITCM2H2DCFDARESULTSTHEEXPRESSIONOFTGF1,TYPECOLLAGEN,MMP2,SMAANDPTHRPWEREUPREGULATEDBYHYPERGLYCEMIAANGIOTENSINMARKEDLYUPREGULATEDTGF1,TYPECOLLAGEN,MMP2,SMAANDPTHRPINTHEHIGHGLUCOSECONDITIONANDINCREASEDROSLEVELSCONCLUSIONANGIOTENSINCOULDPROMOTETHEHYPERGLYCEMIAINDUCEDTRANSDIFFERENTIATIONINNRK52ECELLSKEYWORDSANGIOTENSINGLUCOSENRK52E精品文档2016全新精品资料全新公文范文全程指导写作独家原创3/9TRANSDIFFERENTIATION已换醛固酮血管紧张素肾素系统RAS系统是体内重要的内分泌调节系统，在肾脏局部微炎症状态RAS系统常被激活。肾小管上皮细胞转分化是肾脏纤维化的重要病理基础，有研究发现高浓度葡萄糖通过激活RAS系统，进一步诱导肾小球纤维化1，但对于肾小管导管上皮细胞的研究并不清晰。因此,本实验应用血管紧张素ANG干预持续性高葡萄糖状态下大鼠肾小管导管上皮细胞株NRK52E，观察各种调控肾小管导管上皮细胞转分化的因子及其标记物，包括转化生长因子1TGF1、型胶原、金属蛋白酶2MMP2、平滑肌肌动蛋白SMA以及甲状旁腺素相关肽PTHRP的表达，以探讨ANG对肾小管导管上皮细胞转分化的影响。1材料和方法试剂和仪器DMEM培养液美国GIBCO公司，胎牛血清美国SIGMAALDRICH公司，ANG美国SIGMAALDRICH公司，一抗试剂PTHRP、型胶原均购于美国SANTACRUZ公司，TGF1、MMP2购于英国ABCAM公司，SMA购置于美国DAKO公司，HRP标记的RABBITANTIMOUSE二抗美国DAKO公司，电泳仪美国BIORAD公司，扫描仪美国GE公司，酶标仪美国BIOTEK公司。细胞培养大鼠肾小管导管上皮细胞株NRK52E购自精品文档2016全新精品资料全新公文范文全程指导写作独家原创4/9中科院细胞库，DMEM培养液加入10ML胎牛血清、1ML双抗青、链霉素各1105U/L、1MMOL/LEDTA。每周传代23次。实验分组与处理空白对照组CONTROL组无糖培养基，未进行干预。高糖组GLU组含25MMOL/L葡萄糖DMEM培养基培养。血管紧张素干预组ANG组无糖DMEM培养基加入10NMOL/LANG干预。高糖血管紧张素干预组GLUANG组DMEM培养基中加入25MMOL/L葡萄糖、10NMOL/LANG干预。各组设3复孔。均在37、5CO2条件下培养3天，每24H换液1次。WESTERNBLOT检测蛋白表达进行常规细胞裂解获取蛋白后，与预染蛋白MARKER一起上样,经分离胶和浓缩胶进行SDSPAGE电离，完毕后将蛋白质电转印到PVDF膜上，将膜放入含100G/L脱脂奶粉的TBST中封闭，4过夜，然后与TGF1、型胶原、MMP2、SMA以及PTHRP等一抗分别按1100、175、1125、175及150的比例室温孵育90MINSMA及型胶原4过夜，用TBST液洗膜5MIN3次，PVDF膜分别与辣根过氧化物酶标记的相应二抗11000室温孵育45MIN后，用TBST液洗膜3次，每次5MIN。用ECL显色试剂盒显示目的条带。WESTERNBLOT图片检测采用IMAGINGSYSTEM扫描分析仪扫描凝胶图谱，采用TOTALLAB分析软件对条带进行密度精品文档2016全新精品资料全新公文范文全程指导写作独家原创5/9扫描分析。活性氧ROS检测经处理72H的各组细胞加入10L的1MMOL/LCM2H2DCFDA美国INVITROGEN公司，终浓度为10MOL/L染色液,37避光孵育30MIN,离心，PBS洗2次，重悬于1ML含10胎牛血清的DMEM培养液中。用全自动定量绘图酶标仪检测光密度D值,激发波长485NM，发射波长528NM。统计学处理所有实验均重复3次。应用SPSS统计软件，采用ONEWAYANOVASNK法比较总体和组间差异，检验水准。2结果ANG对高糖诱导NRK52E细胞株中各种肾小管导管上皮细胞转分化调控因子表达的影响结果见图1。GLU组、ANG组TGF1、型胶原、MMP2、SMA及PTHRP的表达明显高于CONTROL组，但2组间无明显差异GLUANG组TGF1、型胶原、MMP2、SMA以及PTHRP的表达明显高于ANG组，GLUANG组TGF1、SMA以及PTHRP的表达明显高于GLU组。提示ANG能明显促进高浓度葡萄糖状态下TGF1、型胶原、MMP2、SMA以及PTHRP的表达。ANG对高糖诱导NRK52E细胞株ROS含量影响结果见图2。GLUANG组ROS含量明显高于CONTROL组及GLU精品文档2016全新精品资料全新公文范文全程指导写作独家原创6/9组，提示ANG能明显促进高浓度葡萄糖状态ROS含量水平。3讨论糖尿病肾病最终转归为肾功能衰竭，其发生机制主要是肾脏纤维化。有研究表明高血糖通过微炎症状态诱导肾组织纤维化是其最重要的病理基础，而微炎症状态常常激活RAS系统，进而恶性循环不断促进肾脏组织纤维化1。然而对于肾小管导管上皮细胞转分化为成纤维细胞等的研究却很少见，为此本研究目的为探讨其机制。本研究提示，在高浓度葡萄糖或ANG分别作用72H后，NRK52E细胞TGF1、型胶原、MMP2、SMA以及PTHRP表达水平均明显上调。既往研究提示，高浓度葡萄糖通过诱导肾小管导管上皮转分化，主要通过上调TGF1、型胶原、MMP2、SMA以及PTHRP等蛋白水平，从而加重肾小球硬化及肾间质纤维化25，而ANG同样可以从多个水平影响炎症通路信号转导，从而加重纤维化的进程67。故此表明高血糖及ANG均可能通过上调TGF1、型胶原、MMP2、SMA以及PTHRP等多种蛋白水平，参与糖尿病肾小管导管上皮转分化病程。为进一步阐明ANG对于高浓度葡萄糖状态下肾小管导管上皮转分化进程的干预作用，本研究应用ANG在不同条件下干预NRK52E细胞株，结果发现，ANG能明显上调高精品文档2016全新精品资料全新公文范文全程指导写作独家原创7/9浓度葡萄糖状态下TGF1、型胶原、MMP2、SMA以及PTHRP的表达。LIU等8研究也提示ANG高度表达能通过促进TGF1等系列因子表达从而加剧糖尿病肾脏功能损害。说明ANG能明显促进TGF1、型胶原、MMP2、SMA以及PTHRP等蛋白表达，从而可能促进肾小管导管上皮细胞转分化。在进一步研究中发现ANG同时能明显提高高糖状态下NRK52E细胞株ROS含量，由于氧化应激是诱导肾小管导管上皮转分化重要因子67，本组结果也进一步验证了ANG可能加剧高糖状态下肾小管导管上皮细胞转分化的进程。【参考】1SANCHEZAP,SHARMAKTRANSCRIPTIONFACTORSINTHEPATHOGENESISOFDIABETICNEPHROPATHYJEXPERTREVMOLMED,2009,11E132LOCS,CHENCH,HSIEHTJ,ETALLOCALACTIONOFENDOGENOUSRENALTUBULARATRIALNATRIURETICPEPTIDEJJCELLPHYSIOL,2009,21937767863HILLSCE,ALRASHEEDN,ALRASHEEDN,ETAL精品文档2016全新精品资料全新公文范文全程指导写作独家原创8/9CPEPTIDEREVERSESTGFBETA1INDUCEDCHANGESINRENALPROXIMALTUBULARCELLSIMPLICATIONSFORTREATMENTOFDIABETICNEPHROPATHYJAMJPHYSIOLRENALPHYSIOL,2009,2963F614F6214HOLIANJ,QIW,KELLYDJ,ETALROLEOFKRUPPELLIKEFACTOR6INTRANSFORMINGGROWTHFACTORBETA1INDUCEDEPITHELIALMESENCHYMALTRANSITIONOFPROXIMALTUBULECELLSJAMJPHYSIOLRENALPHYSIOL,2008,2955F1388F13965LIH,LIUD,ZHAOCQ,ETALHIGHGLUCOSEPROMOTESCOLLAGENSYNTHESISBYCULTUREDCELLSFROMRATCERVICALPOSTERIORLONGITUDINALLIGAMENTVIATRANSFORMINGGROWTHFACTORBETA1JEURSPINEJ,2008,1768738816GRUDENG,PERINPC,CAMUSSIGINSIGHTONTHEPATHOGENESISOFDIABETICNEPHROPATHYFROMTHESTUDYOFPODOCYTEANDMESANGIALCELLBIOLOGYJCURRDIABETESREV,2005,112740精品文档2016全新精品资料全新公文范文全程指导写作独家原创9